間斷注射骨鈣素可預防高脂飲食誘導小鼠非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生

聶美云，張明亮，杜 婧，竇建新，陸俊茜，馬曉靜，包玉倩，賈偉平

（上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病臨床醫(yī)學中心，上海市代謝病臨床醫(yī)學中心，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點實驗室，上海 200233）

近年來，骨的內(nèi)分泌功能成為國內(nèi)外學者關注的焦點，其中骨鈣素（骨鈣蛋白，osteocalcin，OCN）作為成骨細胞分泌的一種調(diào)節(jié)蛋白，不僅是反映骨轉(zhuǎn)化的重要血清標志物，而且對糖脂及能量代謝有重要影響[1,2]。我們前期研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清骨鈣素水平較糖耐量正常者明顯降低（P＜0.01）；與正常人群相比，代謝綜合征及中心性肥胖人群的血清骨鈣素水平明顯降低（P＜0.01）。目前，隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率在世界范圍內(nèi)快速上升，已經(jīng)成為西方發(fā)達國家最常見的肝疾病，NAFLD與肥胖、糖脂代謝異常等密切相關，是心血管疾病的高風險因素[5]。NAFLD是肝細胞內(nèi)脂質(zhì)，特別是甘油三酯（triglycerides，TG）過度蓄積所致，與血清TG水平呈正相關[6]。本課題組前期研究[7]顯示，在社區(qū)人群中，NAFLD人群的血清骨鈣素水平較低，NAFLD的患病率隨著血清骨鈣素水平的降低而增高。Ferron等[8]基礎研究提示，骨鈣素無論持續(xù)注射還是間斷注射，均可降低小鼠血清TG水平。因此，本研究擬探討骨鈣素間斷注射是否可預防高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 動物及骨鈣素

選取4周齡體質(zhì)量介于18～19g的C57BL/6J雄性小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為以下4組，每組8只：普通飲食對照組（normal diet，ND）；高脂飲食對照組（high fat diet＋vehicle，HFD＋Vehicle）；高脂飲食＋骨鈣素低劑量組[high fat diet＋OCN 3ng/（g·d），HFD＋OCN3]；高脂飲食＋骨鈣素高劑量組[high fat diet＋OCN 10ng/（g·d），HFD＋OCN10]。高脂飼料購自（Research Diet公司），RD Western Diet，貨號D12079B，含蛋白質(zhì)17%，碳水化合物43%，脂肪41%。注射用骨鈣素為非羧化骨鈣素（美國AnaSpec公司），貨號65307-025，0.25mg/支，使用前用DMSO配制成濃度為1.0mg/ml儲存液，并用0.9%生理鹽水分別稀釋成0.3，1.0ng/μl，每天下午16∶00進行腹腔注射。干預24周，實驗期間每周1次測體質(zhì)量及進食量。

1.2 血標本檢測

羅氏卓越金銳血糖儀檢測空腹血糖（空腹12h），骨鈣素干預24周處死小鼠，心臟取血，測定血清生化指標和炎癥因子，血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）采用酶法應用自動分析儀進行檢測（7600-120 Automatic Analyser；Hitachi，Tokyo，Japan）；血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）運用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，TNF-α試劑盒（美國R&D公司）。于實驗第16周行腹腔注射葡萄糖耐量實驗（intraperitoneal glucose tolerance tests，IPGTT）。

1.3 組織的收集與形態(tài)學分析

干預第24周處死小鼠，分離附睪旁、皮下、腎周脂肪及肝，并稱重。于肝右上葉分別取10mm×5mm×5mm的標本2份，一份用于蘇木素?伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE），觀察肝病理學特征；另一份用于冰凍切片，油紅O（60%異丙醇配制）染色，觀察肝細胞內(nèi)脂滴聚集情況。

1.4 肝脂質(zhì)提取

取150～160mg的凍存肝組織，分為2份做復孔，在EP管中加入氯仿/甲醇（2∶1）混合液用研磨器（SCIENTZ-48高通量組織研磨器）研磨60s，然后分別加入甲醇、氯仿離心，取下清，用氮吹機吹1h，或放入通風櫥12h吹干，加入1%Triton-100溶解脂質(zhì)，應用自動分析儀采用酶法檢測TC和TG含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有結(jié)果均采用±s表示，統(tǒng)計方法采用SPSS16.0 one-way ANOVA進行統(tǒng)計，并使用GraphPad Prism5作圖軟件作圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

本實驗中，HFD＋Vehicle組中有2只小鼠造模失敗而被剔除，最終分析時該組樣本量為6只小鼠，其他各組均為8只小鼠。監(jiān)測進食量的結(jié)果顯示，OCN組與HFD＋Vehicle組相比，進食量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.1 骨鈣素對小鼠體質(zhì)量、糖脂代謝、及體內(nèi)脂肪含量的影響

實驗第7周起，HFD＋Vehicle組體質(zhì)量較ND組有明顯升高（P＜0.01；圖1）；HFD＋OCN3組、HFD＋OCN10組體質(zhì)量與HFD＋Vehicle相比均明顯降低（P＜0.01），上述差異維持至實驗結(jié)束。兩OCN組與ND組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 實驗周期內(nèi)4組小鼠體質(zhì)量比較Figure 1 Comparison of body mass among 4 groups

骨鈣素干預16周后，IPGTT結(jié)果顯示，與ND組相比，除空腹血糖外，葡萄糖負荷后HFD＋Vehicle組各時點血糖值均明顯升高（P＜0.05）；與HFD＋Vehicle組相比，HFD＋OCN3組30，60，90min血糖均明顯降低（均P＜0.01）；HFD＋OCN10組各時點血糖值與HFD＋Vehicle組相比均明顯降低（均P＜0.001）；HFD＋OCN3組15，30min血糖值明顯高于ND組（P＜0.05），其他各時點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但HFD＋OCN10組與ND組各時點血糖值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；除15min時HFD＋OCN3組血糖值明顯高于HFD＋OCN10組外（P＜0.05），其他各時點兩組間均無明顯差異（P＞0.05；圖2）。

實驗第24周時HFD＋Vehicle組的皮下、腎周、附睪旁脂肪及脂體比值與ND組相比，均明顯升高（均P＜0.001）；兩OCN組的上述部位脂肪及脂體比值與HFD＋Vehicle組相比均明顯降低（均P＜0.001），但與ND組和兩OCN組之間相比均無差異（P＞0.05；表1）。干預第19周，與ND組相比，HFD＋Vehicle組空腹血糖明顯升高（P＜0.001）；兩OCN組的血糖與HFD＋Vehicle組相比明顯降低（P＜0.01～0.001），且與ND組沒有明顯差異（P＞0.05），兩OCN組間無明顯差異（P＞0.05；表1）。

圖2 骨鈣素干預16周后葡萄糖耐量實驗結(jié)果Figure 2 Intraperitoneal glucose tolerance tests after 16 weeks of osteocalcin treatment

干預24周時，與ND組相比，HFD＋Vehicle組的TC、FFA水平明顯升高（P＜0.01～0.001），TG雖高于ND組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.086）；兩OCN組血清TC、TG、FFA與HFD＋Vehicle組相比，均明顯降低（均P＜0.05）；兩OCN組血清TC均明顯高于ND組（均P＜0.001），TG與ND組無明顯差異（P＞0.05），F(xiàn)FA水平均低于ND組，其中HFD＋OCN10組明顯低于ND組（P＜0.05）。而血清TC、TG、FFA水平在兩OCN組間均無明顯差異（均P＞0.05）。血清TNF-α檢測結(jié)果顯示，與ND組相比HFD＋Vehicle組明顯升高（P＜0.01）；兩OCN組與HFD＋Vehicle組相比明顯降低（均P＜0.01）；兩OCN組間無明顯差異（P＞0.05；表2）。

2.2 骨鈣素對小鼠肝重量和肝脂肪沉積的影響

HFD＋Vehicle組肝質(zhì)量明顯高于ND組（P＜0.001）；兩OCN組小鼠肝質(zhì)量明顯低于HFD＋Vehicle組（均P＜0.001）；兩OCN組與ND組均無明顯差異（P＞0.05），兩OCN組間亦未見明顯差異（P＞0.05）。此外，HFD＋Vehicle組的肝體比值高于ND組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但兩OCN組明顯低于HFD＋Vehicle組（均P＜0.01）；更值得注意的是，兩OCN組肝體比值均明顯低于ND組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；兩OCN組間無明顯差異（P＞0.05；表3）。

表1 4組小鼠體內(nèi)脂肪含量及空腹血糖比較Table 1 Comparison of fat mass and FBG among four groups (±s )

表1 4組小鼠體內(nèi)脂肪含量及空腹血糖比較Table 1 Comparison of fat mass and FBG among four groups (±s )

ND:normal diet;HFD:high fat diet;HFD＋OCN3:high fat diet＋osteocalcin 3ng/(g·d);HFD＋OCN10:high fat diet＋osteocalcin 10ng/(g·d);FBG:fasting blood glucose. Compared with ND group, ***P＜0.001;compared with HFD＋Vehicle group, ###P＜0.001

Item ND(n＝8) HFD＋Vehicle(n＝6) HFD＋OCN3(n＝8) HFD＋OCN10(n＝8)Fat beside epididymis at 24 weeks(g) 0.395±0.020 1.012±0.089*** 0.485±0.060### 0.443±0.046###Subcutaneous fat at 24 weeks(g) 0.443±0.026 1.027±0.127*** 0.476±0.063### 0.539±0.037###Fat around kidney at 24 weeks(g) 0.076±0.011 0.318±0.046*** 0.116±0.027### 0.138±0.020###Total fat mass/body mass at 24 weeks 0.030±0.001 0.072±0.006*** 0.035±0.004### 0.037±0.002###FBG at 19 weeks(mmol/L) 4.963±0.191 6.550±0.496*** 4.988±0.117### 4.738±0.084###

肝脂質(zhì)提取，結(jié)果顯示HFD＋Vehicle組的TC含量明顯高于ND組（P＜0.01）；兩OCN組肝TC含量均明顯低于HFD＋Vehicle組（均P＜0.05），而與ND組和骨鈣素干預組間相比未見明顯差異（P＞0.05）。HFD＋Vehicle組肝TG含量明顯高于ND組（P＜0.05）；兩OCN組肝TG含量均明顯低于HFD＋Vehicle組（均P＜0.001）；且低于ND組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩OCN組間未見明顯差異（P＞0.05；表3）。

肝HE染色結(jié)果顯示，HFD＋Vehicle組可見明顯脂肪沉積，而ND組及兩OCN組未見明顯脂滴（圖3A）。同樣地，油紅O染色結(jié)果顯示兩OCN組脂滴明顯減少（圖3B）。

3 討 論

骨鈣素是由成骨細胞分泌的蛋白，最初合成的是相對分子質(zhì)量為10kD的前體，翻譯后在維生素K和CO2依賴的羧化酶復合物作用下羧化，形成谷氨酸殘基。成熟骨鈣素含49個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量是5.8kD。在有Ca2+存在的情況下，谷氨酸殘基發(fā)生構(gòu)像變化，促進骨鈣素結(jié)合于羥基磷灰石和在骨基質(zhì)中的聚集。大部分骨鈣素沉積在骨基質(zhì)，未羧化及羧化不全的骨鈣素與羥基磷灰石的親和力較差，主要進入血液循環(huán)參與調(diào)節(jié)能量、糖脂代謝[9]。

表2 4組小鼠血清指標比較Table 2 Comparison of serum indices among four groups (±s)

表2 4組小鼠血清指標比較Table 2 Comparison of serum indices among four groups (±s)

ND:normal diet;HFD:high fat diet;HFD＋OCN3:high fat diet＋osteocalcin 3ng/(g·d);HFD＋OCN10:high fat diet＋osteocalcin 10ng/(g·d);TC:total cholesterol;TG:triglycerides;FFA:free fatty acid;TNF-α:tumor necrosis factor α. Compared with ND group,*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001;compared with HFD＋Vehicle group, #P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001

Item ND group(n＝8) 0HFD＋Vehicle group(n＝6) HFD＋OCN3 group(n＝8) HFD＋OCN10 group(n＝8)TC(mmol/L) 1.778±0.067 03.067±0.105*** 2.427±0.149### 2.540±0.148###TG(mmol/L) 0.504±0.690 00.682±0.114 0.469±0.073# 0.398±0.026##FFA(μEq/L) 00.500±31.522 01011.500±138.040** 0608.125±21.502### 0509.750±35.321###TNF-α(pg/ml) 4.438±1.074 11.316±2.812** 6.024±0.512## 5.539±0.416##

表3 4組小鼠肝指標比較Table 3 Comparison of liver indices among four groups (±s)

表3 4組小鼠肝指標比較Table 3 Comparison of liver indices among four groups (±s)

ND:normal diet;HFD:high fat diet;HFD＋OCN3:high fat diet＋osteocalcin 3ng/(g·d);HFD＋OCN10:high fat diet＋osteocalcin 10ng/(g·d);TC:total cholesterol;TG:triglycerides;FFA:free fatty acid;TNF-α:tumor necrosis factor α. Compared with ND group,*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001;compared with HFD＋Vehicle group, #P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001

Item ND group(n＝8) 0HFD＋Vehicle group(n＝6) HFD＋OCN3 group(n＝8) HFD＋OCN10 group(n＝8)Liver mass(g) 1.090±0.026 01.288±0.036*** 1.108±0.025### 1.094±0.023###Liver mass/body mass 0.039±0.001 00.039±0.001 0.036±0.001## 0.036±0.001##TC(mg/g) 1.430±0.085 00002.070±0.180** 1.620±0.136# 1.630±0.157#TG(mg/g) 7.300±1.176 00010.610±2.450* 3.822±0.610### 3.660±0.527###

圖3 肝HE染色和油紅O染色Figure 3 Liver hematoxylin-eosin staining (A) and oil red O staining (B ×100)

NAFLD是脂肪異位沉積的重要表現(xiàn)，屬代謝應激性肝損傷。脂肪組織釋放FFA增加，可使肝細胞內(nèi)TG蓄積，是形成NAFLD的重要原因[10,11]，NAFLD的主要病理表現(xiàn)為彌漫性肝細胞大泡性脂肪變。本研究以高脂飲食成功誘導了NAFLD的小鼠模型，經(jīng)過24周的高脂喂養(yǎng)，高脂對照組小鼠的體脂含量、肝質(zhì)量、肝體比等顯著增加，肝HE染色及油紅O染色均可見肝細胞內(nèi)脂滴明顯增加，并且經(jīng)定量檢測證實肝脂質(zhì)含量明顯增加。

Ferron等[2,10]的研究顯示，3，10ng/h骨鈣素注射可降低普通飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠體內(nèi)脂肪含量及血清TG水平，并呈劑量依賴性。無論采用骨鈣素連續(xù)注射與間斷注射均可見到類似結(jié)果，臨床研究也已證實，NAFLD與機體糖脂代謝紊亂密切相關[12,13]。因此，在本研究中，我們分別采用3，10ng/（g·d）兩種骨鈣素劑量對高脂喂養(yǎng)的小鼠進行干預，觀察骨鈣素是否可以有效預防NAFLD的產(chǎn)生。經(jīng)過24周的外源骨鈣素干預后，見到上述2個劑量等級的骨鈣素干預均可有效降低高脂喂養(yǎng)小鼠的肝質(zhì)量，與高脂對照組的小鼠相比，降低幅度達14.03%～15.08%。病理切片證實，兩OCN組的肝細胞內(nèi)脂滴明顯減少，且肝TC、TG含量均明顯減少。提示無論采用低劑量還是高劑量骨鈣素干預，均可有效預防高脂飲食誘導的NAFLD的產(chǎn)生。

近年來，越來越多的證據(jù)提示骨鈣素與糖脂代謝有密切關系[14]。Lee等[15]研究了骨鈣素活性增加的小鼠模型——Esp基因缺失小鼠，顯示這種小鼠的血清TG、FFA水平均明顯低于WT小鼠（P＜0.05）；而Osteocalcin基因缺失小鼠體內(nèi)脂肪和血清TG均明顯增加（P＜0.05）。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)OCN組小鼠糖脂代謝指標明顯改善。本研究中見到類似結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量也明顯減輕。

胰島素抵抗是NAFLD的主要病理生理機制[17]。Ferron等[10]的研究發(fā)現(xiàn)無論是給小鼠骨鈣素間斷注射還是連續(xù)注射均可改善高脂喂養(yǎng)小鼠的胰島素抵抗；細胞研究提示骨鈣素可通過PI3K/Akt途徑增加胰島素敏感性，并可見肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激明顯減輕[18]。此外，炎癥反應也參與NAFLD的發(fā)病[18,19]。TNF-α是參與肝細胞炎癥、氧化應激、細胞凋亡的重要炎癥因子，是由激活的單核?巨噬細胞產(chǎn)生的一種多肽，相對分子質(zhì)量為17kDa，在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨鈣素干預后在改善肝脂質(zhì)積聚的同時，血清TNF-α濃度亦明顯下降。

本研究結(jié)果表明，間斷注射骨鈣素不僅可以改善高脂飲食誘導小鼠的糖脂代謝，并且可以有效預防NAFLD形成。然而，我們尚未進行相關機制的研究，這是本研究存在的局限性。今后尚需進一步開展骨鈣素預防NAFLD的機制探討，為臨床NAFLD及相關代謝性疾病的防治提供新的證據(jù)及思路。

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