PP2對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

唐寧寧　楊艷艷　張杰　劉少燕　于濤

[摘要]目的探究PP2對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機制。方法根據(jù)處理情況將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分為空白對照組、50 μg/L成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）處理組（簡稱FGF2處理組）、50 μg/L FGF2和0.02 mol/L PP2共處理組（簡稱共處理組）。采用Transwell小室和EdU實驗檢測PP2對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響，采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測酪氨酸蛋白激酶（Src）通路相關(guān)蛋白及核蛋白的表達(dá)。結(jié)果不同濃度PP2處理均可抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活（F=10.25～56.18，P<0.05、0.01）。與FGF2處理組相比，共處理組細(xì)胞增殖率明顯降低（F=32.23，P<0.01），細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少（F=22.15，P<0.01）。共處理組磷酸化成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1）表達(dá)水平較FGF2處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.21，P<0.01）。在相同處理時間，F(xiàn)GF2處理組Src通路相關(guān)蛋白及核蛋白表達(dá)水平與共處理組比較差異均有顯著性（F=10.17～278.11，P<0.05、0.01）。結(jié)論PP2可通過靶向FGFR1和Src發(fā)揮抗腫瘤作用，這可能為研發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型治療藥物提供一個新思路。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)膠質(zhì)瘤;蛋白酪氨酸激酶類;受體，成纖維細(xì)胞生長因子;細(xì)胞增殖;細(xì)胞運動

[中圖分類號]R730.264;R329.25[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0383-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of PP2 on the proliferation and migration of C6 glioma cells and its mechanism. MethodsAccording to the treatment， C6 glioma cells were divided into blank control group， 50 g/L fibroblast growth factor 2 （FGF2） treatment group （FGF2 treatment group for short） and 50 g/L FGF2 with 0.02 mol/L PP2 co-treatment group （co-treatment group for short）. Transwell chamber assay and EdU assay were used to evaluate the effect of PP2 on the proliferation and migration of C6 glioma cells. Western blotting was used to measure the expression levels of proteins involved in the tyrosine protein kinase （Src） pathway and nucleoproteins. ResultsPP2 treatment at different concentrations inhibited the survival of C6 glioma cells （F=10.25-56.18，P<0.05，0.01）. Compared with the FGF2 treatment group， the co-treatment group showed a significant decrease in cell proliferation rate （F=32.23，P<0.01） and a significant decrease in the number of migrating cells （F=22.15，P<0.01）. The expression level of phosphorylated fibroblast factor receptor 1 （FGFR1） was significantly lower in the co-treatment group than in the FGF2 treatment group （F=20.21，P<0.01）. During the same treatment time， the expression levels of Src pathway-related proteins and nucleoproteins were significantly different between the FGF2 treatment group and the co-treatment group （F=10.17-278.11，P<0.05，0.01）. ConclusionPP2 can exert an anti-tumor effect by targeting FGFR1 and Src， which may provide a new idea for the development of novel therapeutic drugs for glioma.

[KEY WORDS]glioma; protein-tyrosine kinases; receptor， fibroblast growth factor; cell proliferation; cell movement

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，占所有惡性腦腫瘤的80%[1]。目前，綜合療法已被廣泛用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但是療效不佳，病人存活率較低，所以需要進(jìn)一步探究神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)節(jié)機制，尋找潛在的治療靶點。有文獻(xiàn)報道，成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而且FGFR1 是酪氨酸蛋白激酶（Src）的上游調(diào)節(jié)因子，可以激活Src通路[2]。PP2是Src家族激酶信號通路的抑制劑，可以通過調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞的遷移和增殖來調(diào)節(jié)各種疾病[3-5]。然而，PP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討PP2對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響及其分子機制。

1材料和方法

1.1主要材料

PP2購自美國Selleckchem公司;成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）購自美國Peprotech公司;胎牛血清（FBS）購自美國ExCell Bio公司;DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;EdU試劑盒購自美國RiboBio公司;Transwell小室購自BD Biosciences公司;MTT試劑盒購自Sigma公司;RIPA緩沖液購自北京索萊寶公司;磷酸化Src（p-Src）、FGFR1、磷酸化FGFR1（p-FGFR1）、P65、c-jun、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（p-STAT1）一抗及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞購上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用含體積分?jǐn)?shù)0.10 BSA的DMEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱（37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2）中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞存活率測定

將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以每孔108/L的密度接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)12 h后，分別用0、0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.030 0、0.040 0 mol/L的PP2進(jìn)行處理（均設(shè)3個平行復(fù)孔）。分別在孵育48、72和96 h時，按MTT試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀（Biohit，Helsinki，F(xiàn)inland）在595 nm波長處檢測吸光度（A）值。實驗重復(fù)3次。

1.4EdU實驗檢測細(xì)胞增殖

將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以每孔108/L的密度接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞分為空白對照組（A組）、50 μg/L FGF2處理組（簡稱FGF2處理組，B組）、50 μg/L FGF2和0.02 mol/L PP2共處理組（簡稱共處理組，C組），并進(jìn)行相應(yīng)處理。處理24 h后，根據(jù)EdU試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色，使用熒光顯微鏡（Zeiss，LSM510，META）拍照并用圖像處理工具ImageJ v1.8.0分析數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次。

1.5Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移

將200 μL含有2.5×108/L細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加500 μL 含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)液。將細(xì)胞按1.4所述進(jìn)行分組并處理。處理后24 h，棄上清，用磷酸鹽緩沖液濕潤的棉棒輕輕擦去殘留在膜上側(cè)的細(xì)胞。然后用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，在室溫下用1 g/L結(jié)晶紫染色30 min。使用熒光顯微鏡（Zeiss，LSM510，META）拍照，選擇5個隨機區(qū)域來計數(shù)細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.6蛋白質(zhì)印跡方法檢測Src通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取含有108/L C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液2 mL接種于6孔板中，將細(xì)胞按1.4所述進(jìn)行分組并處理，在處理后5、10、20、30、60 min時快速收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞沉淀置于含有0.1 mmo/L苯基甲基磺酰氟和10 g/L蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中，在冰上裂解10 min，4 ℃溫度下以12 000 r/min離心15 min。采用蛋白質(zhì)印跡方法[6]檢測FGFR1、p-FGFR1、p-Src、p-Akt、p-ERK和p-STAT1蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.7蛋白質(zhì)印跡方法檢測核蛋白表達(dá)

將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞按照1.4所述進(jìn)行分組并處理，快速收集細(xì)胞，將其重懸于300 μL細(xì)胞裂解緩沖液中，在冰上裂解30 min，4 ℃下以1 000 r/min離心20 min。將收集的細(xì)胞沉淀重懸于200 μL核裂解緩沖液中，在冰上裂解30 min（每5 min振蕩1次）。4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，所得上清即為核蛋白。采用蛋白質(zhì)印跡方法[6]檢測核蛋白P65、c-jun的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用one way ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PP2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響

在相同處理時間，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率隨著PP2濃度的升高而降低;相同濃度 PP2處理，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率隨著處理時間延長而降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.25～56.18，P<0.05、0.01）。見圖1。

2.2PP2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

EdU實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2處理組細(xì)胞增殖率較空白對照組明顯增加，而共處理組細(xì)胞增殖率較FGF2處理組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.23，P<0.01）。見表1。

2.3PP2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2處理組細(xì)胞遷移數(shù)量較空白對照組明顯增加，而共處理組細(xì)胞遷移數(shù)量較FGF2處理組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.15，P<0.01）。見表1。

2.4PP2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Src通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

空白對照組、FGF2處理組和共處理組細(xì)胞p-FGFR1/FGFR1分別為0、0.632±0.029和0.133±0.015，F(xiàn)GF2處理組較空白對照組明顯升高，而共處理組較FGF2處理組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.21，P<0.05）。在藥物處理5 min時，共處理組p-Src、p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表達(dá)水平較FGF2處理組均降低;藥物處理10 min時，共處理組p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表達(dá)水平較FGF2處理組升高;藥物處理30、60 min時，共處理組p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表達(dá)水平較FGF2處理組降低，差異均具有顯著性（F=15.33～156.38，P<0.05、0.01）。見表2。

2.5PP2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中核蛋白表達(dá)的影響

在相同處理時間，與FGF2處理組相比，共處理組細(xì)胞P65和c-jun蛋白表達(dá)水平降低，差異具有顯著意義（F=10.17～278.11，P<0.05、0.01）。在不同處理時間中，以藥物處理60 min時FGF2處理組與共處理組P65和c-jun蛋白表達(dá)水平差異最明顯。見表3。

3討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤沒有明顯的邊界，難以完整手術(shù)切除?；熀头暖煂ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性低而且具有許多副作用和明顯的毒性反應(yīng)，治療效果較差。但目前化療仍是最常用的治療方法[1，7]。傳統(tǒng)抗癌藥物（如替莫唑胺、洛莫司汀和替尼泊苷）存在很多缺點，如選擇性差、副作用嚴(yán)重、血-腦脊液屏障穿越等[8-9]。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療迫切需要基于分子生物學(xué)和基因療法的新型治療策略。

文獻(xiàn)報道，F(xiàn)GFRs屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4[10]。其中，F(xiàn)GFR1是αFGF、βFGF和FGF5的高親和力受體[11]。FGFs/FGFRs的異常誘導(dǎo)和持續(xù)活化可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生[9，12-13]。有研究表明，F(xiàn)GFR1在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)[2]。在病理狀態(tài)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞FGFR1的磷酸化水平較高，F(xiàn)GF2刺激也可以使C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中p-FGFR1水平升高[3，14]。因此，本研究用50 μg/LFGF2刺激C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞模擬病理條件。作為受體酪氨酸激酶，F(xiàn)GFR1包含細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、單個跨膜區(qū)和蛋白酪氨酸激酶核。FGFR1與配體結(jié)合后其酪氨酸殘基會快速自磷酸化，活化的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核會調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。同時，F(xiàn)GFR1還是Src蛋白的上游調(diào)節(jié)因子，可以激活Src通路，故抑制FGFR1磷酸化可以阻止Src活化。而激活的Src可以調(diào)節(jié)多條信號途徑，包括絲裂原活化蛋白激酶、PI3K/Akt、STAT和PLC途徑[15-17]。本研究結(jié)果表明，PP2可顯著影響Src信號通路相關(guān)蛋白（包括p-ERK、p-AKT和p-STAT1）的表達(dá)，且Src通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平隨著PP2作用時間的延長而發(fā)生變化，這符合信號通路調(diào)控的時間規(guī)律。有研究表明，F(xiàn)GF2刺激后，一些重要的核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1蛋白可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[18]。文獻(xiàn)報道，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子P65和c-jun是調(diào)節(jié)Src信號通路的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]。本文研究結(jié)果顯示，與FGF2處理組相比，共處理組細(xì)胞P65和c-jun蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明PP2可能是通過靶向FGFR1調(diào)節(jié)P65和c-jun信號傳導(dǎo)途徑而表現(xiàn)出抗癌作用。目前，一些通過激活替代信號傳導(dǎo)途徑，或者通過靶向細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點來抑制FGFR的藥物已經(jīng)被開發(fā)應(yīng)用，例如普納替尼、瑞格非尼、帕唑帕尼、尼達(dá)尼布和樂伐替尼等已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療癌癥[19-21]。然而，這些藥物有較多的副作用，說明上述靶向抑制藥物仍然存在一些問題，需要進(jìn)行更深入的研究?；诖吮尘埃瑧?yīng)該盡快將PP2抑制劑的研究推向動物水平研究。

總之，本文結(jié)果表明，PP2可通過靶向FGFR1和Src發(fā)揮抗腫瘤作用，這可能為研發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型治療藥物提供一個新思路。

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（本文編輯 馬偉平）