無(wú)菌獼猴桃種子采集方法研究

孫菁婕 楊迪 鄒婷婷 趙新仕

摘 要：無(wú)菌的獼猴桃種子是獼猴桃胚乳培養(yǎng)、實(shí)生苗微嫁接等技術(shù)的基礎(chǔ)材料，利用消毒劑滅菌是常用的無(wú)菌種子采集手段，應(yīng)用最廣泛的消毒劑為升汞（mercuric chloride）和次氯酸鈉（NaClO）。為了避免使用消毒劑，該研究提出了一種新的無(wú)菌獼猴桃種子采集方法——無(wú)菌攪拌法，同時(shí)為探索其準(zhǔn)確性和應(yīng)用性，比較了0.2%升汞滅菌20 min、10%次氯酸鈉滅菌20 min、無(wú)菌攪拌法三種方式采集無(wú)菌獼猴桃種子的效果，并對(duì)種子萌發(fā)和幼苗形成的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：無(wú)菌攪拌法、0.2%升汞滅菌20 min是穩(wěn)定有效的無(wú)菌獼猴桃采集方式，10%次氯酸鈉滅菌20 min的采集效果不穩(wěn)定;在相同的時(shí)間內(nèi)，無(wú)菌攪拌法的種子發(fā)芽率最高，為89.90%，但發(fā)芽勢(shì)較低，均可正常成苗;10%次氯酸鈉滅菌20 min的發(fā)芽率次之，與無(wú)菌攪拌法的種子無(wú)顯著差異，發(fā)芽勢(shì)和成苗率最高，分別為47.47%和67.86%，且有打破獼猴桃種子休眠的作用，整體作用類似于赤霉素（GA3）浸種的效果;0.2%升汞滅菌20 min對(duì)獼猴桃種子的萌發(fā)有抑制作用，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于無(wú)菌攪拌法種子，且生長(zhǎng)緩慢。此外，無(wú)菌攪拌法是物理處理，對(duì)種子、操作人員、環(huán)境均無(wú)害。這證實(shí)了無(wú)菌攪拌法的實(shí)用性和優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)了次氯酸鈉在打破獼猴桃種子休眠方面的作用，為其它同類型果實(shí)的無(wú)菌種子采集提供了參考。

關(guān)鍵詞：種子， 獼猴桃， 無(wú)菌， 萌發(fā)， 攪拌

中圖分類號(hào)：Q945.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0472-10

Abstract：Aseptic seeds of kiwifruit is fundamental tested material of endosperm culture， micro-grafting and other researches. It is a usual way to gather aseptic seeds to usedisinfectant to sterilize. Among them， mercuric chloride and NaClO are the most widely useddisinfectants. This article showed that aseptic stirring method is a new method to obtain aseptic seeds of kiwifruit. In order to explore accuracy and applicability of aseptic stirring method， kiwifruit seeds were used to study the effects of three methods， including 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min， 10% NaClO sterilization for 20 min， aseptic stirring method， and their effects on seed germination and plant growth. The results showed that aseptic stirring method and 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min were an effective and reproductive way for gathering aseptic seeds of kiwifruit. Oppositely， gathering aseptic seeds of kiwifruit which in 10% NaClO sterilization for 20 min was unstable. The results also showed that the three methods were effective， and at the same time， seed germination rate of aseptic stirring method was the highest. And the rate was 89.90%， but its germination energy was lower， sprouts could grow healthily， germination rate of seeds with 10% NaClO sterilization for 20 min was the second place， but there was no significantdifference in germination rate of seeds between 10% NaClO sterilization for 20 min and aseptic stirring method， its germination energy and seedling rate were the highest which were 47.47% and 67.86% respectively， and could give the seed a premature start and also could break effectively thedormancy of kiwifruit seeds like GA3. And 0.2% mercuric chloride sterilization for 20 min inhibited germination of kiwifruit seeds， the various index was significantly lower than aseptic stirring method， sprouts grew slowly， most of the seeds could notdevelop into young seedlings within the allotted time. In addition， aseptic stirring method was a physical method， and it was harmless for seeds， workers and environment. The study indicated that the practicality and advantage of aseptic stirring method， and found the ability of NaClO to break thedormancy of kiwifruit seeds， which provided a reference for the obtaining aseptic seeds of other same type of fruits.

Key words：seeds， kiwifruit， aseptic， germination， stirring

種子是種子植物的繁殖體，對(duì)延續(xù)物種起著重要作用。獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）的多年生藤本植物（吳秀華等，2013），原產(chǎn)地在中國(guó)，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)廣泛種植（Belrose， 2009），果實(shí)可口且營(yíng)養(yǎng)豐富，因維生素 C 含量高而被譽(yù)為“水果之王”，根、莖、葉、花均可入藥，可謂‘全身是寶’（周玲艷等，2013）。獼猴桃種子數(shù)量多、體積小，鑲嵌在果肉中，影響果實(shí)的口感和部分產(chǎn)品的加工（如果汁等）。為得到無(wú)籽獼猴桃果實(shí)，許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究。被子植物的胚乳培養(yǎng)是獲取不育植株的重要手段，目前已在西番蓮（張琴等，2000）、楊桃（吳清等，2002）、枇杷（彭曉軍和王永清，2002）等果樹研究中廣泛應(yīng)用;獼猴桃的胚乳培養(yǎng)也有很大進(jìn)展，且已獲得了三倍體植株（林穎等，2012）。獼猴桃種質(zhì)資源具有豐富的多樣性（王發(fā)明等，2018），但童期長(zhǎng)，基因高度雜合（葉開玉等，2012），現(xiàn)階段的繁殖手段多為實(shí)生嫁接法，周期長(zhǎng)且創(chuàng)傷易感染潰瘍病。微嫁接技術(shù)是組織培養(yǎng)和嫁接技術(shù)的結(jié)合，目前在葡萄（郝新意，2017）、蘋果（周瑞金等，2007）等果樹上廣泛應(yīng)用，利用種子在無(wú)菌培養(yǎng)基上培育實(shí)生苗，再無(wú)菌嫁接優(yōu)良品種，可縮短繁殖周期、提高成活率、避免潰瘍病感染。

上述兩種技術(shù)都需要無(wú)菌的獼猴桃種子為基礎(chǔ)材料。常用的獼猴桃無(wú)菌種子是利用消毒劑殺菌獲得，升汞、次氯酸鈉是使用最多的消毒劑。實(shí)際上，獼猴桃正常完整果實(shí)的內(nèi)部是無(wú)菌環(huán)境，種子被無(wú)菌的果肉包裹，也是無(wú)菌的。為避免在取種時(shí)將種子暴露在有菌環(huán)境中，去掉不必要的工作量，直接采集無(wú)菌獼猴桃種子，本研究提出了一種新的無(wú)菌獼猴桃種子采集方法——無(wú)菌攪拌法，避免了使用消毒劑，優(yōu)化了胚乳培養(yǎng)、微嫁接技術(shù)的前期工作。

1 材料與方法

1.1 材料

選取6個(gè)獼猴桃品種的果實(shí)作為供試材料，分別為‘貴長(zhǎng)’‘紅陽(yáng)’‘徐香’‘翠香’‘Hort 16A’‘海沃德’，由超市購(gòu)買或從西峽縣獼猴桃種植果園中采集。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)條件 所用的培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，試驗(yàn)地點(diǎn)在南陽(yáng)師范學(xué)院植物培養(yǎng)室，培養(yǎng)基、磁力攪拌子、去離子水、果醬瓶等均用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，赤霉素用0.2 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，溫度控制在25 ℃左右，每天的光照時(shí)間為12 h，光照強(qiáng)度在1 500～2 000 lx之間，試驗(yàn)除了“無(wú)菌種子采集方式效果的穩(wěn)定性測(cè)定”這一步外，其余工作均在12月份開始。

1.2.2 無(wú)菌種子采集

1.2.2.1 無(wú)菌攪拌法 在試驗(yàn)中，先選取‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’獼猴桃完全成熟的完整果實(shí)，用無(wú)菌攪拌法采集種子，具體步驟如下：在超凈工作臺(tái)中，把獼猴桃果實(shí)放在無(wú)菌濾紙上，先用酒精棉球擦拭果實(shí)表面，再用無(wú)菌的鑷子和手術(shù)刀做剝皮處理。剝皮的過(guò)程中應(yīng)多次在酒精燈上灼燒鑷子、手術(shù)刀與果皮接觸的部分，保證其始終無(wú)菌。剝皮后的果肉先移放到另一張無(wú)菌濾紙上，用灼燒過(guò)的手術(shù)刀削去表面的果肉，然后放入無(wú)菌的果醬瓶中，用無(wú)菌鑷子搗碎，加入無(wú)菌水至果醬瓶體積的2/3，擰緊瓶蓋，置于磁力攪拌器上攪拌3

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5 min，靜置，觀察種子與果肉的分離狀況，再用無(wú)菌水沖走果肉碎屑，留下獼猴桃種子。采集的獼猴桃種子在超凈工作臺(tái)上直接接種于MS培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基上接種6粒，接種10個(gè)培養(yǎng)基，共接60粒種子，20d時(shí)觀察種子的污染狀況，記錄數(shù)據(jù)，待第一粒種子萌發(fā)后第20天停止觀察，記錄種子的萌芽是否帶菌。無(wú)菌攪拌法采集的‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’三個(gè)品種的種子分別標(biāo)記為A1、A2、A3。同時(shí)，試驗(yàn)設(shè)置有菌環(huán)境中，用磁力攪拌器攪拌采集的‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’獼猴桃種子作為對(duì)照組，分別標(biāo)記為CK1、CK2、CK3，與無(wú)菌攪拌法采集的種子比較。為進(jìn)一步證實(shí)無(wú)菌攪拌法的可靠性，試驗(yàn)再選用‘徐香’‘海沃德’‘紅陽(yáng)’三個(gè)品種獼猴桃作為無(wú)菌攪拌法的供試材料，獲取種子，具體觀察記錄方式與無(wú)菌攪拌法一致。

1.2.2.2 消毒劑滅菌 試驗(yàn)選用的消毒劑為升汞、次氯酸鈉，濃度分別為0.2%、10%，滅菌時(shí)間為20 min，這也是文獻(xiàn)中應(yīng)用過(guò)的有效滅菌處理。消毒劑滅菌所用的種子是通過(guò)常規(guī)取種方式采集的，即選擇‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’獼猴桃完全成熟的完整果實(shí)，在有菌環(huán)境中擠出果肉，利用紗布包裹后反復(fù)淘洗，去掉果肉和漂浮于水面的空癟種子，留下飽滿種子。升汞滅菌后的 ‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’種子分別標(biāo)記為B1、B2、B3，次氯酸鈉滅菌后的‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’種子分別標(biāo)記為C1、C2、C3。滅菌后的獼猴桃種子在超凈工作臺(tái)上直接接種于MS培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基上接種6粒，接種10個(gè)培養(yǎng)基，共接60粒種子，20d時(shí)觀察種子的污染狀況，記錄數(shù)據(jù)，待第一粒種子萌發(fā)后第20天停止觀察，記錄種子的萌芽是否帶菌。

1.2.2.3 無(wú)菌種子采集方式效果的穩(wěn)定性測(cè)定 為了更好地確定無(wú)菌攪拌法和消毒劑滅菌的效果，以‘貴長(zhǎng)’獼猴桃的果實(shí)為材料，分別用這兩種方式在12月、1月、2月、3月分別采集一次無(wú)菌獼猴桃種子，觀察記錄方式與上述（1）、（2）一致。

1.2.3 種子萌發(fā)培養(yǎng) 培養(yǎng)種子萌發(fā)和觀察芽的生長(zhǎng)狀況主要是用于分析兩種無(wú)菌種子采集方式各自的優(yōu)缺點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證無(wú)菌攪拌法的實(shí)用性。以‘貴長(zhǎng)’獼猴桃果實(shí)為材料，進(jìn)行以下研究。

1.2.3.1 無(wú)菌種子的直接培養(yǎng) 試驗(yàn)用無(wú)菌攪拌法、0.2%升汞滅菌20 min、10%次氯酸鈉滅菌20 min采集的無(wú)菌種子接種于MS培養(yǎng)基，使其自然萌芽生長(zhǎng)，以10d為一個(gè)單位，觀察一次種子的萌發(fā)情況，待種子萌發(fā)結(jié)束后觀察成苗情況（長(zhǎng)出真葉的芽為成苗），觀察時(shí)長(zhǎng)為50d。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)33粒左右。

1.2.3.2 赤霉素處理 試驗(yàn)用無(wú)菌攪拌法、0.2%升汞滅菌20 min采集的無(wú)菌種子，在濃度為25 mg·L-1的赤霉素中分別浸種0、5、8、15、20、24 h，無(wú)菌攪拌法種子按順序標(biāo)記為D1、D2、D3、D4、D5、D6，升汞滅菌的種子按順序標(biāo)記為D7、D8、D9、D10、D11、D12。經(jīng)赤霉素處理后的無(wú)菌種子于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記錄種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)等情況，時(shí)長(zhǎng)為50d。設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)31粒左右。發(fā)芽率=最終發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)

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100%;發(fā)芽勢(shì)=試驗(yàn)前20d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)100%;成苗率=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)萌芽的成苗數(shù)/供試種子數(shù)100%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2013軟件整理數(shù)據(jù)和制作圖表，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用one-way ANOVAduncan法完成多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌攪拌法的無(wú)菌獼猴桃種子采集效果

無(wú)菌攪拌法可順利采集獼猴桃種子（圖1：A、D），攪拌果肉時(shí)可清楚觀察到種子與果肉分離（圖1：B），靜置后飽滿的種子沉在果醬瓶底部，空癟種子漂浮在去離子水上部（圖1：C），表明無(wú)菌攪拌法是一種可靠的獼猴桃種子采集方法。

利用無(wú)菌攪拌法采集‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’三個(gè)獼猴桃品種無(wú)菌種子的效果如表1所示。三個(gè)品種的對(duì)照組種子全部污染，確認(rèn)污染的時(shí)間在310d之間;無(wú)菌攪拌法采集的三個(gè)獼猴桃品種種子接種于MS培養(yǎng)基，經(jīng)20d的觀察，‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’兩個(gè)品種各有1粒種子污染，確認(rèn)污染的時(shí)間分別在第7天、第6天，‘翠香’的種子無(wú)污染產(chǎn)生。三個(gè)品種的對(duì)照組由于種子全部污染，因此無(wú)萌芽產(chǎn)生，而無(wú)菌攪拌法組中，三個(gè)品種的種子開始萌發(fā)時(shí)間并無(wú)顯著差異，均在1316d之間，因此對(duì)萌芽污染情況的觀察時(shí)間統(tǒng)一至第36天結(jié)束，所有的種子萌芽均不帶菌?？梢姡瑹o(wú)菌攪拌法是可以用來(lái)采集無(wú)菌獼猴桃種子的，試驗(yàn)中出現(xiàn)的2粒種子污染應(yīng)該是試驗(yàn)操作不嚴(yán)謹(jǐn)造成的。

在試驗(yàn)中為了確認(rèn)表1中出現(xiàn)的2粒種子污染不是方法本身的問(wèn)題，本研究選用‘徐香’‘紅陽(yáng)’‘海沃德’三個(gè)獼猴桃品種為材料，利用無(wú)菌攪拌法取種，具體采集效果如表2所示。采集的三個(gè)獼猴桃品種種子是無(wú)菌的，經(jīng)20d觀察，無(wú)污染產(chǎn)生，種子的開始發(fā)芽時(shí)間‘徐香’約在第14天，‘紅陽(yáng)’約在第16天，‘海沃德’約在第14天，因此對(duì)萌芽的觀察時(shí)間分別持續(xù)至第34、36、34天，種子的萌芽也無(wú)污染現(xiàn)象?？梢?，表1中的2粒種子污染與無(wú)菌攪拌法本身并無(wú)關(guān)聯(lián)，無(wú)菌攪拌法是一種可靠的無(wú)菌獼猴桃種子采集方法。

2.2 消毒劑滅菌采集無(wú)菌獼猴桃種子的效果

消毒劑滅菌采集無(wú)菌獼猴桃種子的效果如表3所示。對(duì)于‘貴長(zhǎng)’‘Hort 16A’‘翠香’三個(gè)品種的種子，經(jīng)0.2%升汞處理20 min和10%次氯酸鈉處理20 min后在20d內(nèi)均無(wú)細(xì)菌或真菌污染，每種處理的60粒種子都是無(wú)菌的。0.2%升汞處理20 min后的種子開始發(fā)芽較晚，‘貴長(zhǎng)’大約在第17天，‘Hort 16A’大約在第18天，‘翠香’大約在第16天，對(duì)萌芽污染情況的觀察分別至第37天、第38天、第36天結(jié)束，萌芽均不帶菌。10%次氯酸鈉處理20 min后的種子開始發(fā)芽有所時(shí)間提前，‘貴長(zhǎng)’大約在第11天，‘Hort 16A’ 大約在第12天，‘翠香’大約在第11天，對(duì)萌芽污染情況的觀察分別至第31天、第32天、第31天結(jié)束，萌芽均不帶菌?？梢?，消毒劑滅菌也能采集無(wú)菌獼猴桃種子。

2.3 不同無(wú)菌獼猴桃種子采集方式效果的穩(wěn)定性

不同無(wú)菌獼猴桃種子采集方式效果的穩(wěn)定性測(cè)定效果如表4所示。無(wú)菌攪拌法在12月采集的無(wú)菌 ‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子有1粒污染， 其余3個(gè)月

無(wú)污染;0.2% 升汞20 min處理在4次無(wú)菌‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子采集中均無(wú)污染產(chǎn)生;10% 次氯酸鈉20 min處理在12月、1月兩次無(wú)菌‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子采集中無(wú)污染現(xiàn)象，而在2月時(shí)有7粒污染，3月有11粒種子污染。在2.1中已經(jīng)證明‘貴長(zhǎng)’獼猴桃的那1粒種子污染與無(wú)菌攪拌法本身無(wú)關(guān)，因此無(wú)菌攪拌法和0.2% 升汞20 min處理都是效果比較穩(wěn)定的獼猴桃無(wú)菌種子的采集方式，10% 次氯酸鈉20 min處理2月、3月兩次的無(wú)菌種子采集效果與前兩者有明顯差異，可參考性不強(qiáng)。

2.4 不同無(wú)菌種子采集方式對(duì)‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子發(fā)芽及成苗的影響

從圖2可以看出，消毒劑滅菌和無(wú)菌攪拌法采集的無(wú)菌‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子的發(fā)芽是在1040d之間，010d之間無(wú)種子萌發(fā)，4050d之間發(fā)芽率基本無(wú)變化。10%次氯酸鈉滅菌20 min的種子開始萌發(fā)時(shí)間大約在第11天，1120d之間發(fā)芽率達(dá)到47.47%，到30d時(shí)發(fā)芽率為53.53%，而3040d之間才有29.80%的種子發(fā)芽;無(wú)菌攪拌法采集的無(wú)菌種子大約在第15天開始萌發(fā)，3040d之間的種子發(fā)芽率為57.81%，而前30d只有32.09%，后期發(fā)芽率接近于前期的2倍;0.2%升汞滅菌20 min后的種子開始萌發(fā)時(shí)間較晚，大約在第17天，前30d的發(fā)芽率19.19%，40d時(shí)的最終發(fā)芽率為46.46%，整體種子發(fā)芽率顯著低于無(wú)菌攪拌法和10%次氯酸鈉滅菌20 min（圖1，表5，P<0.05），種子開始萌發(fā)的時(shí)間約比無(wú)菌攪拌法晚2d，比10%次氯酸鈉滅菌20 min晚6d，可見，無(wú)菌攪拌法種子的發(fā)芽高峰時(shí)段為試驗(yàn)后期，開始萌發(fā)時(shí)間較晚，說(shuō)明‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子有休眠性;10%次氯酸鈉滅菌20 min的種子發(fā)芽高峰時(shí)段是在試驗(yàn)前期，且開始萌發(fā)時(shí)間提前無(wú)菌攪拌法種子4d，說(shuō)明10%次氯酸鈉滅菌20 min有助于‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子的破眠;0.2%升汞滅菌20 min的種子各方面指標(biāo)都低，開始萌發(fā)時(shí)間最晚，說(shuō)明0.2%升汞滅菌20 min會(huì)抑制‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子的萌發(fā)。

再到長(zhǎng)出真葉，所需時(shí)間和10%次氯酸鈉滅菌20 min的種子無(wú)明顯差異，根健壯，分根多，由于開始萌發(fā)時(shí)間晚，規(guī)定時(shí)間內(nèi)成苗率不及次氯酸鈉處理（圖4：左1）;0.2%升汞滅菌20 min的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)狀況都很差，許多種子雖然萌發(fā)，會(huì)長(zhǎng)出一點(diǎn)根，但到試驗(yàn)結(jié)束基本無(wú)變化，一小部分會(huì)長(zhǎng)出子葉和真葉，成苗率顯著低于前兩者（P<0.05），規(guī)定時(shí)間內(nèi)成苗的芽根細(xì)且短小，分根少（圖4：左3）?？梢姡瑥墨@取實(shí)生苗的角度看，10%次氯酸鈉滅菌20 min顯然效果更好，無(wú)菌攪拌法也能獲得健壯的實(shí)生苗，兩者的差異主要體現(xiàn)在種子開始發(fā)芽的時(shí)間上。

2.5 赤霉素浸種對(duì)不同方式采集的無(wú)菌獼猴桃種子萌發(fā)的影響

赤霉素浸種對(duì)不同方式采集的無(wú)菌獼猴桃種96.77%，略微超過(guò)D3處理的94.62%（圖4：左4），兩者并無(wú)顯著差異（P<0.05），但D3處理的浸種時(shí)間比D5處理少12 h?？梢?，D3即赤霉素浸種8 h是‘貴長(zhǎng)’獼猴桃種子的最佳的浸種時(shí)間。浸種時(shí)間最短的D2處理，3個(gè)指標(biāo)均處于一般水平，而浸種時(shí)間最長(zhǎng)的D6處理，發(fā)芽勢(shì)、成苗率卻最低，和D3、D4、D5都有顯著差異（P<0.05），發(fā)芽高峰時(shí)段也有所推遲?？梢?，赤霉素的破眠作用只是在一定的范圍內(nèi)有效。0.2%升汞滅菌20 min的種子經(jīng)赤霉素浸種后，D11處理發(fā)芽率最高，為94.62%，D10發(fā)芽勢(shì)最高，為50.54%，D12成苗率最高，為70.05%（圖4：左5），顯著低于除D6、D1外所有的無(wú)菌攪拌法浸種處理（P<0.05）。可見，即使打破種子的休眠，0.2%升汞滅菌20 min依然不利于種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)，這也從另一方面印證了2.4的結(jié)論。

綜上所述，適當(dāng)利用赤霉素浸種在打破獼猴桃種子休眠上有很好的作用，試驗(yàn)中探索出的最佳方案為25 mg·L-1的赤霉素浸種8 h。

3 討論

采集無(wú)菌種子時(shí)，采集方式的效果、種子活性的保持、附帶問(wèn)題的存在和解決是必須考慮的三大因素。本研究結(jié)果表明，無(wú)菌攪拌法、消毒劑滅菌都可有效采集無(wú)菌的獼猴桃種子，但消毒劑中的次氯酸鈉滅菌效果不穩(wěn)定，在天氣較冷的12月、1月滅菌效果很好，但在天氣轉(zhuǎn)暖的2月、3月滅菌效果較差。王羽悅（2016）在探索獼猴桃莖段的最佳取材時(shí)間時(shí)發(fā)現(xiàn)季節(jié)轉(zhuǎn)換對(duì)莖段的污染有影響，天氣轉(zhuǎn)暖會(huì)導(dǎo)致污染率的上升。本研究中升汞處理之所以能保持良好的滅菌效果，是因?yàn)樵囼?yàn)中使用的濃度較高、浸種時(shí)間較長(zhǎng)，而在其它外植體滅菌時(shí)，常用的升汞濃度為0.1%，滅菌時(shí)間在15 min以內(nèi)，濃度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)抑制外植體的活性（何官榕等，2017），陳雪鵑等（2012）在做芙蓉菊組培時(shí)、蔣時(shí)姣等（2014）在采集柳杉無(wú)菌種子時(shí)的滅菌探索都印證了此結(jié)論。0.2%升汞滅菌20 min是眾多獼猴桃胚乳培養(yǎng)文獻(xiàn)中常用的種子滅菌方式（林穎等，2012;龍自立，2008;趙丹丹，2011），滅菌效果好卻存在一些附帶問(wèn)題。首先，升汞滅菌的原因在于其含有的Hg2+是重金屬離子，會(huì)與菌體內(nèi)帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而殺滅菌體，但Hg2+會(huì)殘留在被滅菌的外植體表面不易清除，影響外植體的存活，林妃等（2013）在做花梨木組織培養(yǎng)時(shí)有此結(jié)論;其次，汞是一種重金屬，對(duì)環(huán)境污染大，對(duì)操作人員有潛在危害，妥善處理升汞廢液、避免對(duì)人體傷害是不容忽視卻又較難解決的問(wèn)題（Bjrklund et al.， 2017）。無(wú)菌攪拌法是一種物理取種方法，與消毒劑滅菌相比，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，不會(huì)對(duì)獼猴桃種子造成傷害，也不存在環(huán)境、安全等附加問(wèn)題，適合實(shí)驗(yàn)室中的無(wú)菌獼猴桃種子采集。

種子的休眠是植物在長(zhǎng)期的系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中形成的抵抗外界不良環(huán)境條件，以保持物種不斷發(fā)展和進(jìn)化的生態(tài)特性，是調(diào)節(jié)種子萌發(fā)最佳時(shí)機(jī)和空間分布的一種機(jī)制（鄭道君等，2017）。獼猴桃種子體積微小，有一定的休眠特性。低溫沙藏法是打破獼猴桃種子休眠常用的方法，一般在冬天開始，時(shí)間為2

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3個(gè)月不等，低溫沙藏過(guò)程中還需控制沙的濕度、種子表面的空氣流動(dòng)等問(wèn)題（王亞威，2017），整個(gè)方法受限條件多，過(guò)程繁瑣。赤霉素是打破種子休眠的常用試劑（常青山等，2016）。本研究在探索無(wú)菌攪拌法優(yōu)勢(shì)時(shí)，利用25 mg·L-1的赤霉素浸種，得出一定的濃度下赤霉素浸種促進(jìn)獼猴桃種子萌發(fā)只在一定時(shí)間范圍內(nèi)有效的結(jié)論，這與周玲艷等（2009）用2.5 mg·L-1的赤霉素浸泡美味獼猴桃種子時(shí)的結(jié)論不謀而合。25 mg·L-1濃度的赤霉素浸種8 h是本研究中赤霉素浸種的最佳處理。另外，本研究中用次氯酸鈉滅菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉亦有打破獼猴桃種子休眠的作用，這可能是因?yàn)榇温人徕c腐蝕了獼猴桃種子的種皮，讓胚更易吸收外界的水分及無(wú)機(jī)鹽離子。10%次氯酸鈉滅菌20 min的種子在開始萌發(fā)時(shí)間、發(fā)芽高峰時(shí)段上和赤霉素浸種的最佳處理無(wú)差異，兩者的差異在于11

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20d時(shí)種子的發(fā)芽數(shù)量，赤霉素處理為82.79%，次氯酸鈉處理為47.47%，相差35.32%，但都顯著高于不做處理的普通種子（無(wú)菌攪拌法種子）。因此，25 mg·L-1赤霉素浸種8 h處理的破眠效果優(yōu)于10%次氯酸鈉滅菌20 min處理。不過(guò)，浸種時(shí)間短是次氯酸鈉的優(yōu)勢(shì)，20 min是8 h的1/24，本研究只是觀察了10%的次氯酸浸種20 min的破眠效果，有一定的片面性，但次氯酸鈉的破眠作用是可以肯定的，具體潛力有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，升汞滅菌的附帶問(wèn)題較多，最好避免使用;次氯酸鈉滅菌的效果不穩(wěn)定，相比之下，用于打破獼猴桃種子休眠更有意義;無(wú)菌攪拌法可避免升汞、次氯酸鈉滅菌時(shí)的短處，適合用于采集無(wú)菌的獼猴桃種子。本研究證實(shí)了無(wú)菌攪拌法的可靠性和實(shí)用性，為采集無(wú)菌的獼猴桃種子提供了新的高效、安全的方法，具有較大的實(shí)用價(jià)值，也為類似植物的無(wú)菌種子采集拓展了新思路。

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