穴位按摩對急性腦缺血再灌注損傷模型鼠認知及Notch通路的影響干預組

袁宇紅 盧躍卿 韓洋

摘要 目的：觀察百會穴及足三里穴對急性腦缺血再灌注損傷模型鼠認知能力的影響，并通過Notch信號通路進一步探討其可能的機制。方法：選取無特定病原體（SPF）級SD大鼠45只，隨機分為空白組15只，造模組30只，其中24只造模成功，再次隨機分為缺血組及干預組，每組12只。空白組及造模組大鼠無任何干預，干預組大鼠在造模后24 h開始百會穴、足三里按摩，每次持續(xù)20 min，2次/d，連續(xù)14 d。其中造模組鼠利用改良線栓法行大腦中動脈梗死（MCAO）制備急性腦缺血再灌注損傷模型，干預結(jié)束后用水迷宮評估各組大鼠認知能力變化，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法（TTC）觀察各組腦梗死體積變化，利用透射電鏡法觀察各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化，用Western blotting法檢測Notch1、NICD蛋白的變化。結(jié)果：干預第14天空白組與缺血組、干預組比較，逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;干預組與缺血組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;空白組和干預組穿越平臺次數(shù)比缺血組多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干預14 d后，TTC檢測顯示缺血組大鼠腦區(qū)出現(xiàn)明顯的缺血梗死病灶，而干預組梗死體積較缺血組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。透射電鏡顯示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞明顯，導致腦組織細胞出現(xiàn)一系列變性壞死，而干預組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解明顯減輕。Western blotting法顯示經(jīng)過干預后Notch1、NICD蛋白有明顯提高，與缺血組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：百會穴、足三里穴按摩可改善大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，提高認知能力，減少腦梗死體積，促進腦的神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復，其作用機制可能通過Notch信號通路實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 急性腦缺血，再灌注損傷，改良線栓法，穴位按摩，百會穴，足三里，機制，Notch信號通路

Abstract Objective：To observe the effects of Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） on cognitive ability of rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury，and to further explore its possible mechanism through Notch signaling pathway.Methods：A total of 45 SPF SD rats were randomly divided into a blank group （n=15） and a model group （n=30）.The model group was established by modified middle cerebral artery infarction （Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），totally 24 were successfully modeled，which were then randomly divided into an ischemic group （n=12） and an intervention group （n=12）.The rats in the blank group and the model group did not accept any intervention means，while the rats in the intervention group began massage at Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） 24 hours after modeling，20 mins each time and twice a day for 14 days.After the intervention，the cognitive ability of rats in each group was evaluated by water maze.The volume of cerebral infarction was observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride staining （TTC），and the ultrastructural changes of hippocampus were observed by transmission electron microscopy （TEM）.The changes of Notch1 and NICD proteins were detected by Western blotting.Results：1）On the 14th day of intervention，there was significant difference in escape latency between the blank group，the ischemia group and the intervention group （P<0.05），and there was significant difference between the intervention group and the ischemia group （P<0.05）.The blank group and the intervention group crossed the platform more times than the ischemic group，and the difference was statistically significant （P<0.05）.2）After 14 days of intervention，TTC showed that there were obvious ischemic infarction lesions in the brain region of the ischemic group，but the infarct volume in the intervention group was significantly decreased than that in the ischemic group，with statistically significant difference （P<0.05）.3）The results of transmission electron microscope （TEM） showed that the structure of hippocampal neurons in the ischemic group was obviously destroyed，resulting in a series of signs of degeneration and necrosis of brain tissue cells.In the intervention group，the degree of necrosis and dissolution of hippocampal neurons on the ischemic side of the brain was significantly reduced in the intervention group.4）Western blotting showed that Notch1 and NICD protein were significantly increased after intervention，which were different from those in ischemic group （P<0.05）.Conclusion：Massage at Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） can improve the neurological deficit，improve cognitive ability，reduce the volume of cerebral infarction and promote the repair of neuronal morphology and structure，and the mechanism may be realized by Notch signaling pathway.

Key Words Acute cerebral ischemia; Reperfusion injury; Modified suture method; Acupoint massage; Baihui （GV20）; Zusanli （ST36）; Mechanism; Notch signaling pathway

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.019

缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，亦具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率等特點，己成為當今世界上危害人類健康最主要的致死和致殘疾病之一[1]。認知功能障礙是腦卒中的主要后遺癥，不同程度的腦卒中后認知功能障礙可嚴重影響康復進展，降低患者生命質(zhì)量，給家庭及社會帶來了沉重的負擔[2-3]，已成為當前國際腦卒中研究和干預的熱點。穴位按摩是中醫(yī)治療重要手段，通過刺激人體特定穴位，激發(fā)經(jīng)絡之氣，達到通經(jīng)活絡、調(diào)整功能、祛邪扶正，從而實現(xiàn)治療疾病的目的[4-6]。我們通過臨床證實穴位按摩確可明顯提高缺血性腦卒中患者的認知能力，現(xiàn)為進一步研究其機制，我們利用動物作為媒介，探討按摩百會穴、足三里穴的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取45只健康無特定病原體（SPF）級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（斯萊克，上海）[生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005]，體質(zhì)量（200±20）g，由本校實驗動物中心[許可證：SYXK（閩）2014-0005]統(tǒng)一無菌環(huán)境飼養(yǎng)，大鼠飼料統(tǒng)一為實驗動物中心配置的滅菌飼料，飲用水為高溫高壓滅菌水，動物自由進食及飲水，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，定時通風換氣，模擬標準晝夜系統(tǒng)即12 h光照+12 h黑夜。所有動物實驗均經(jīng)過本校實驗動物管理委員會審批通過并嚴格按照我國相關(guān)實驗動物的規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 試劑與儀器

2，3，5-氯化三苯四唑（購自北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司），β-actin鼠單克隆抗體（購自美國CST公司）、Nestin1一抗抗體（購自Proteintech公司），NICD一抗抗體（購自美國CST公司），DAB免疫組化試劑盒（購自ZYMED公司），全自動酶標儀（Model ELX800，購自美國Bio.Tek公司），凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000，購自美國Bio.Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

選取45只健康SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠并隨機分為空白組15只，造模組30只，其中24只造模成功，再次隨機分為缺血組及干預組，每組12只。空白組及造模組大鼠無任何干預，干預組大鼠在造模后24 h開始百會穴、足三里按摩，持續(xù)20 min/次，2次/d，連續(xù)14 d。

術(shù)前24 h大鼠禁食不禁水，將直徑為0.26 mm的魚制備成5 cm長度，在0.18 cm、0.2 cm及0.22 cm處用記號筆標記，在室溫23 ℃條件下，將10%水合氯醛按照0.1 mL/kg比例進行麻醉，沿頸部正中切開頸部皮膚，暴露分離左側(cè)頸總動脈（CCA），隨后逐級分離，使頸內(nèi)動脈（Internal Carotid Artery，ICA）和頸外動脈（ECA）及其分支充分暴露。在CCA結(jié)扎處上方約0.5 mm的上方做一小口，將魚線從開口處推入至頸內(nèi)動脈（從ECA與ICA分叉處起約18～22 mm即魚線標記處為準），2 h后抽出魚線實現(xiàn)大腦中動脈再灌注。整個實驗過程至動物蘇醒期間用加熱墊進行保暖直至其蘇醒。

假手術(shù)組只分離大鼠左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，不結(jié)扎也不插線。造模過程中注意保暖。

1.2.2 干預方法

干預組采用百會穴、足三里穴按摩干預。操作時，先用膠布將鋼珠（直徑2 mm）固定于右手示指指端，再用右手拇指和中指將大鼠稍固定，然后根據(jù)《實驗針灸學》中大鼠穴位定位方法取百會穴（頂骨正中），足三里穴，以鋼珠作為接觸點進行按揉，力度維持在（350±50）g[43]，以大鼠能耐受為宜（實驗前操作者先用大鼠體質(zhì)量秤反復練習按摩力度，達到熟練控制后再對大鼠進行干預。當大鼠不耐受時，出現(xiàn)煩躁，抵抗，往四周爬走等表現(xiàn)），頻率為40～60次/min，每次揉按20 min，每日2次，連續(xù)14 d?？瞻捉M和缺血組：同等條件下飼養(yǎng)，每天同等抓取20 min后回籠飼養(yǎng)。

1.2.3 檢測指標與方法

認知能力：各組大鼠在干預第3天開始每天進行水迷宮測試用于評估認知能力，將大鼠置于Morris水迷宮中進行定位航行實驗和空間探索實驗。水迷宮直徑為200 cm、高度為50 cm，水的高度為30 cm。水溫保持恒溫，水溫保持在23～27 ℃之間;將水迷宮均分為4個象限，每次將實驗大鼠分別從4個象限的入水點面壁式放入水池，大鼠入水后盡力游動逃避水患，當找到平臺后則棲身其上。如大鼠在平臺上停留時間大于3 s，則認為大鼠找到平臺，即為逃避潛伏期。將每次訓練的時間設定為90 s，作為最大潛伏期，如果大鼠在90 s內(nèi)找到平臺并在平臺上停留3 s以上，則其從入水到找到平臺時間為其逃避潛伏期;如果大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，其潛伏期按90 s計算。時間越短說明大鼠的學習能力越好。

空間探索實驗：定位航行實驗4 d后，即在干預的第14天將水迷宮中的平臺移除，隨后將大鼠頭部背對平臺，從平臺對側(cè)象限放入水中，觀察90 s內(nèi)大鼠游過原平臺區(qū)域的次數(shù)。次數(shù)越多表明大鼠的記憶能力越好。

腦梗死體積：利用TTC染色法計算各組大鼠腦組織梗死體積，干預14 d后各組隨機抓取3只大鼠，脫頸處死后斷頭取腦，取腦過程均于冰上操作，將大鼠腦組織取出后保存至-20 ℃冰箱內(nèi)20 min，隨后將全腦均勻切成5薄片，每片厚度約2 mm，避光條件下將各腦片置于，3，5-氯化三苯四唑液體中充分反應，腦梗死組織呈蒼白色，未梗死組織呈鮮紅色。充分反應后取出腦組織整齊平鋪于可現(xiàn)實刻度的標尺上，用高清數(shù)碼相機進行拍攝，隨后將相片傳輸至計算機中用Image-ProPlus圖像軟件計算梗死體積。梗死體積=梗死面積總和×2 mm。

透射電鏡觀察海馬組織超微結(jié)構(gòu)：利用透射電鏡觀察各組大鼠海馬組織的超微結(jié)構(gòu)，利用水合氯醛充分麻醉后夾閉腹主動脈切口近心端，從右心耳灌注生理鹽水100 mL及電鏡灌流液100 mL后于冰上迅速取海馬組織浸泡于電鏡固定液，然后放入4 ℃冰箱中保存48 h，隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）進行漂洗，在30%乙醇5 min→50%乙醇10 min→70%乙醇10 min進行脫水，并在70%乙醇+鈾于4 ℃冰箱過夜。再將標本置于純丙酮+包埋劑（2：1）中浸透后環(huán)氧樹脂包埋，手工修塊，用徠卡切片機切成厚度為0.5 μm的半薄切片定位海馬，隨后再用超薄切片機切成90 nm薄片，后進行醋酸雙氧鈾（20 min）+檸檬酸鉛（10 min）雙重染色后利用透射電子顯微鏡H-7650拍攝觀察超薄切片的超微結(jié)構(gòu)。

Western blotting檢測Notch1、NICD蛋白水平變化：干預14 d后各組隨機抓取3只大鼠進行充分麻醉后斷頭取左側(cè)大腦皮質(zhì)，將樣本置于含1%PMSF的蛋白裂解液中，然后將組織放置冰里勻漿，放入冰中充分裂解，用BCA試劑盒進行蛋白定量并計算上樣量，隨后進行蛋白SDS-PAGE電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將Notch1、NICD以及β-actin一抗用抗體稀釋液稀釋后進行膜孵育置于條件為4 ℃的搖床中過夜，次日用TBST液洗滌3次，每次洗10 min后加入稀釋過生物辣根過氧化酶HRP標記的二抗，室溫下孵育2 h，隨后用ECL液進行顯影，并用Image（美國BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進行處理，測定各樣本灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗或兩樣本秩和檢驗;組內(nèi)比較采用配對t檢驗或配對秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認知行為學比較

干預第14天逃避潛伏期空白組與缺血組、干預組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），干預組與缺血組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;見表1?？瞻捉M和干預組穿越平臺次數(shù)比缺血組多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2 各組腦梗死體積比較

干預14 d后，TTC檢測顯示缺血組大鼠腦區(qū)出現(xiàn)明顯的缺血梗死病灶，而干預組梗死體積較缺血組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3 各組海馬組織超微結(jié)構(gòu)比較

透射電鏡結(jié)果顯示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯破壞，導致腦組織細胞出現(xiàn)一系列變性壞死的征象，而干預組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解的程度明顯減輕。見圖1。

2.4 各組Notch1、NICD蛋白表達比較

Western blotting法顯示經(jīng)過干預后Notch1、NICD蛋白有明顯提高，與缺血組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2及圖3。

3 討論

知功能障礙主要包括學習記憶力、執(zhí)行力、注意力等的障礙，是缺血性腦卒中最常見并發(fā)癥之一。如果卒中后認知功能障礙未得到及時合理控制，則將逐漸向癡呆進展[7-8]。亦有研究人員證實在認知障礙中，約83%腦卒中患者至少某一方面存在功能障礙，且有71%的生存患者即使在醫(yī)院接受了3個月后的治療，也仍然存在不同程度的認知功能障礙[9]。本研究利用Morris水迷宮對各組大鼠干預前后的學習記憶能力進行檢測，水迷宮實驗是借助大鼠會游泳但又怕水的特點，將大鼠放置在水迷宮中被迫游泳，依靠設置的空間參照物判斷水中平臺的位置，從而逃避水患，被視為公認的評價學習記憶功能較為客觀的方法。結(jié)果顯示經(jīng)過MCAO造模的大鼠逃避潛伏期明顯較假手術(shù)延長，且穿越平臺的次數(shù)減少，這提示經(jīng)過MCAO造模后大鼠的確出現(xiàn)認知功能障礙表現(xiàn)。

百會穴，其名最早見于晉代皇普謐《針灸甲乙經(jīng)》：“百會，一名三陽五會，在前頂后一寸五分，頂中央旋毛中，陷可容指，督脈足太陽之會”。百會穴隸屬督脈，又名“三陽五會”，是督脈、手太陽小腸經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)、手陽明大腸經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足陽明胃經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)的交會穴。所以，百會穴對腦髓有著舉足輕重的調(diào)節(jié)作用。百會穴具有振奮諸陽、激發(fā)經(jīng)氣、調(diào)節(jié)臟腑、安神定志、滋養(yǎng)腦髓、醒腦開竅等功效[10-12]。陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，刺激陽明經(jīng)可實現(xiàn)益氣活血、扶正通絡的效應，足三里穴屬于足陽明胃經(jīng)的下合穴，是匯聚天部精微物質(zhì)的經(jīng)典穴位，從而激發(fā)促進胃氣升發(fā)，調(diào)整機體氣血。百會穴和足三里穴合用遵循遠近配穴原則，共奏健腦調(diào)神、扶正通絡作用[13-15]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過按摩百會穴及足三里穴后大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，這說明穴位按摩的確改善了缺血性再灌注損傷大鼠模型的認知能力。我們利用TTC觀察各組大鼠腦梗死體積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組未出現(xiàn)明顯梗死灶，而經(jīng)過MCAO造模的大鼠腦組織均出現(xiàn)明顯梗死灶，這說明本研究造模成功，且經(jīng)過百會穴、足三里穴干預后大鼠腦梗死體積明顯減少，在研究中發(fā)現(xiàn)示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯破壞，導致腦組織細胞出現(xiàn)一系列變性壞死，而干預組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解明顯減輕，這說明腦組織缺血再灌注損傷確導致神經(jīng)元細胞受損，而經(jīng)過百會穴、足三里穴干預有腦保護效應。

本研究檢測了Notch信號通路的標志因子，結(jié)果顯示缺血組大鼠腦組織Notch1、NICD水平均降低，而干預組水平上調(diào)，由此認為腦缺血中Notch信號通路受到抑制，而百會穴、足三里穴干預激活了Notch信號通路。Notch信號通路屬于細胞信號裝置器，相鄰的神經(jīng)元細胞之間的Notch受體與相對應的配體結(jié)合后促進了神經(jīng)干細胞的自我更新。有研究認為Notch信號通路是神經(jīng)干細胞增殖、分化的“決定者”，當Notch配體與相關(guān)的受體結(jié)合后可裂解釋放出NICD（Intracellular Domain of Notch），NICD是Notch受體產(chǎn)生活性的主要細胞片段，隨后Notch配體產(chǎn)生核移位，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)與DNA結(jié)合蛋白RBP-J發(fā)生反應，從而介導轉(zhuǎn)錄信息的調(diào)節(jié)[16-18]。由此可認為百會穴、足三里穴干預介導神經(jīng)干細胞增殖與Notch信號通路密不可分。

總之，通過百會穴、足三里按摩可改善MCAO大鼠的認知能力，減少腦梗死體積，促進腦的神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復，其作用機制可能通過Notch信號通路實現(xiàn)。

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（2019-03-29收稿 責任編輯：楊覺雄）