穴位按摩對(duì)急性腦缺血再灌注損傷模型鼠認(rèn)知及Notch通路的影響干預(yù)組

袁宇紅 盧躍卿 韓洋

摘要 目的：觀察百會(huì)穴及足三里穴對(duì)急性腦缺血再灌注損傷模型鼠認(rèn)知能力的影響，并通過Notch信號(hào)通路進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。方法：選取無特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠45只，隨機(jī)分為空白組15只，造模組30只，其中24只造模成功，再次隨機(jī)分為缺血組及干預(yù)組，每組12只?？瞻捉M及造模組大鼠無任何干預(yù)，干預(yù)組大鼠在造模后24 h開始百會(huì)穴、足三里按摩，每次持續(xù)20 min，2次/d，連續(xù)14 d。其中造模組鼠利用改良線栓法行大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）制備急性腦缺血再灌注損傷模型，干預(yù)結(jié)束后用水迷宮評(píng)估各組大鼠認(rèn)知能力變化，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法（TTC）觀察各組腦梗死體積變化，利用透射電鏡法觀察各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化，用Western blotting法檢測(cè)Notch1、NICD蛋白的變化。結(jié)果：干預(yù)第14天空白組與缺血組、干預(yù)組比較，逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)組與缺血組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;空白組和干預(yù)組穿越平臺(tái)次數(shù)比缺血組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)14 d后，TTC檢測(cè)顯示缺血組大鼠腦區(qū)出現(xiàn)明顯的缺血梗死病灶，而干預(yù)組梗死體積較缺血組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。透射電鏡顯示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞明顯，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞出現(xiàn)一系列變性壞死，而干預(yù)組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解明顯減輕。Western blotting法顯示經(jīng)過干預(yù)后Notch1、NICD蛋白有明顯提高，與缺血組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：百會(huì)穴、足三里穴按摩可改善大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，提高認(rèn)知能力，減少腦梗死體積，促進(jìn)腦的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復(fù)，其作用機(jī)制可能通過Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 急性腦缺血，再灌注損傷，改良線栓法，穴位按摩，百會(huì)穴，足三里，機(jī)制，Notch信號(hào)通路

Abstract Objective：To observe the effects of Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） on cognitive ability of rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury，and to further explore its possible mechanism through Notch signaling pathway.Methods：A total of 45 SPF SD rats were randomly divided into a blank group （n=15） and a model group （n=30）.The model group was established by modified middle cerebral artery infarction （Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），totally 24 were successfully modeled，which were then randomly divided into an ischemic group （n=12） and an intervention group （n=12）.The rats in the blank group and the model group did not accept any intervention means，while the rats in the intervention group began massage at Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） 24 hours after modeling，20 mins each time and twice a day for 14 days.After the intervention，the cognitive ability of rats in each group was evaluated by water maze.The volume of cerebral infarction was observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride staining （TTC），and the ultrastructural changes of hippocampus were observed by transmission electron microscopy （TEM）.The changes of Notch1 and NICD proteins were detected by Western blotting.Results：1）On the 14th day of intervention，there was significant difference in escape latency between the blank group，the ischemia group and the intervention group （P<0.05），and there was significant difference between the intervention group and the ischemia group （P<0.05）.The blank group and the intervention group crossed the platform more times than the ischemic group，and the difference was statistically significant （P<0.05）.2）After 14 days of intervention，TTC showed that there were obvious ischemic infarction lesions in the brain region of the ischemic group，but the infarct volume in the intervention group was significantly decreased than that in the ischemic group，with statistically significant difference （P<0.05）.3）The results of transmission electron microscope （TEM） showed that the structure of hippocampal neurons in the ischemic group was obviously destroyed，resulting in a series of signs of degeneration and necrosis of brain tissue cells.In the intervention group，the degree of necrosis and dissolution of hippocampal neurons on the ischemic side of the brain was significantly reduced in the intervention group.4）Western blotting showed that Notch1 and NICD protein were significantly increased after intervention，which were different from those in ischemic group （P<0.05）.Conclusion：Massage at Baihui （GV20） and Zusanli （ST36） can improve the neurological deficit，improve cognitive ability，reduce the volume of cerebral infarction and promote the repair of neuronal morphology and structure，and the mechanism may be realized by Notch signaling pathway.

Key Words Acute cerebral ischemia; Reperfusion injury; Modified suture method; Acupoint massage; Baihui （GV20）; Zusanli （ST36）; Mechanism; Notch signaling pathway

中圖分類號(hào)：R245文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.019

缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，亦具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率等特點(diǎn)，己成為當(dāng)今世界上危害人類健康最主要的致死和致殘疾病之一[1]。認(rèn)知功能障礙是腦卒中的主要后遺癥，不同程度的腦卒中后認(rèn)知功能障礙可嚴(yán)重影響康復(fù)進(jìn)展，降低患者生命質(zhì)量，給家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[2-3]，已成為當(dāng)前國際腦卒中研究和干預(yù)的熱點(diǎn)。穴位按摩是中醫(yī)治療重要手段，通過刺激人體特定穴位，激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，達(dá)到通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)整功能、祛邪扶正，從而實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的[4-6]。我們通過臨床證實(shí)穴位按摩確可明顯提高缺血性腦卒中患者的認(rèn)知能力，現(xiàn)為進(jìn)一步研究其機(jī)制，我們利用動(dòng)物作為媒介，探討按摩百會(huì)穴、足三里穴的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

選取45只健康無特定病原體（SPF）級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（斯萊克，上海）[生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005]，體質(zhì)量（200±20）g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證：SYXK（閩）2014-0005]統(tǒng)一無菌環(huán)境飼養(yǎng)，大鼠飼料統(tǒng)一為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配置的滅菌飼料，飲用水為高溫高壓滅菌水，動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，定時(shí)通風(fēng)換氣，模擬標(biāo)準(zhǔn)晝夜系統(tǒng)即12 h光照+12 h黑夜。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審批通過并嚴(yán)格按照我國相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 試劑與儀器

2，3，5-氯化三苯四唑（購自北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司），β-actin鼠單克隆抗體（購自美國CST公司）、Nestin1一抗抗體（購自Proteintech公司），NICD一抗抗體（購自美國CST公司），DAB免疫組化試劑盒（購自ZYMED公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Model ELX800，購自美國Bio.Tek公司），凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000，購自美國Bio.Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

選取45只健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠并隨機(jī)分為空白組15只，造模組30只，其中24只造模成功，再次隨機(jī)分為缺血組及干預(yù)組，每組12只?？瞻捉M及造模組大鼠無任何干預(yù)，干預(yù)組大鼠在造模后24 h開始百會(huì)穴、足三里按摩，持續(xù)20 min/次，2次/d，連續(xù)14 d。

術(shù)前24 h大鼠禁食不禁水，將直徑為0.26 mm的魚制備成5 cm長度，在0.18 cm、0.2 cm及0.22 cm處用記號(hào)筆標(biāo)記，在室溫23 ℃條件下，將10%水合氯醛按照0.1 mL/kg比例進(jìn)行麻醉，沿頸部正中切開頸部皮膚，暴露分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），隨后逐級(jí)分離，使頸內(nèi)動(dòng)脈（Internal Carotid Artery，ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA）及其分支充分暴露。在CCA結(jié)扎處上方約0.5 mm的上方做一小口，將魚線從開口處推入至頸內(nèi)動(dòng)脈（從ECA與ICA分叉處起約18～22 mm即魚線標(biāo)記處為準(zhǔn)），2 h后抽出魚線實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程至動(dòng)物蘇醒期間用加熱墊進(jìn)行保暖直至其蘇醒。

假手術(shù)組只分離大鼠左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎也不插線。造模過程中注意保暖。

1.2.2 干預(yù)方法

干預(yù)組采用百會(huì)穴、足三里穴按摩干預(yù)。操作時(shí)，先用膠布將鋼珠（直徑2 mm）固定于右手示指指端，再用右手拇指和中指將大鼠稍固定，然后根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠穴位定位方法取百會(huì)穴（頂骨正中），足三里穴，以鋼珠作為接觸點(diǎn)進(jìn)行按揉，力度維持在（350±50）g[43]，以大鼠能耐受為宜（實(shí)驗(yàn)前操作者先用大鼠體質(zhì)量秤反復(fù)練習(xí)按摩力度，達(dá)到熟練控制后再對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)。當(dāng)大鼠不耐受時(shí)，出現(xiàn)煩躁，抵抗，往四周爬走等表現(xiàn)），頻率為40～60次/min，每次揉按20 min，每日2次，連續(xù)14 d。空白組和缺血組：同等條件下飼養(yǎng)，每天同等抓取20 min后回籠飼養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

認(rèn)知能力：各組大鼠在干預(yù)第3天開始每天進(jìn)行水迷宮測(cè)試用于評(píng)估認(rèn)知能力，將大鼠置于Morris水迷宮中進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。水迷宮直徑為200 cm、高度為50 cm，水的高度為30 cm。水溫保持恒溫，水溫保持在23～27 ℃之間;將水迷宮均分為4個(gè)象限，每次將實(shí)驗(yàn)大鼠分別從4個(gè)象限的入水點(diǎn)面壁式放入水池，大鼠入水后盡力游動(dòng)逃避水患，當(dāng)找到平臺(tái)后則棲身其上。如大鼠在平臺(tái)上停留時(shí)間大于3 s，則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái)，即為逃避潛伏期。將每次訓(xùn)練的時(shí)間設(shè)定為90 s，作為最大潛伏期，如果大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留3 s以上，則其從入水到找到平臺(tái)時(shí)間為其逃避潛伏期;如果大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，其潛伏期按90 s計(jì)算。時(shí)間越短說明大鼠的學(xué)習(xí)能力越好。

空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)4 d后，即在干預(yù)的第14天將水迷宮中的平臺(tái)移除，隨后將大鼠頭部背對(duì)平臺(tái)，從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限放入水中，觀察90 s內(nèi)大鼠游過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。次數(shù)越多表明大鼠的記憶能力越好。

腦梗死體積：利用TTC染色法計(jì)算各組大鼠腦組織梗死體積，干預(yù)14 d后各組隨機(jī)抓取3只大鼠，脫頸處死后斷頭取腦，取腦過程均于冰上操作，將大鼠腦組織取出后保存至-20 ℃冰箱內(nèi)20 min，隨后將全腦均勻切成5薄片，每片厚度約2 mm，避光條件下將各腦片置于，3，5-氯化三苯四唑液體中充分反應(yīng)，腦梗死組織呈蒼白色，未梗死組織呈鮮紅色。充分反應(yīng)后取出腦組織整齊平鋪于可現(xiàn)實(shí)刻度的標(biāo)尺上，用高清數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍攝，隨后將相片傳輸至計(jì)算機(jī)中用Image-ProPlus圖像軟件計(jì)算梗死體積。梗死體積=梗死面積總和×2 mm。

透射電鏡觀察海馬組織超微結(jié)構(gòu)：利用透射電鏡觀察各組大鼠海馬組織的超微結(jié)構(gòu)，利用水合氯醛充分麻醉后夾閉腹主動(dòng)脈切口近心端，從右心耳灌注生理鹽水100 mL及電鏡灌流液100 mL后于冰上迅速取海馬組織浸泡于電鏡固定液，然后放入4 ℃冰箱中保存48 h，隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行漂洗，在30%乙醇5 min→50%乙醇10 min→70%乙醇10 min進(jìn)行脫水，并在70%乙醇+鈾于4 ℃冰箱過夜。再將標(biāo)本置于純丙酮+包埋劑（2：1）中浸透后環(huán)氧樹脂包埋，手工修塊，用徠卡切片機(jī)切成厚度為0.5 μm的半薄切片定位海馬，隨后再用超薄切片機(jī)切成90 nm薄片，后進(jìn)行醋酸雙氧鈾（20 min）+檸檬酸鉛（10 min）雙重染色后利用透射電子顯微鏡H-7650拍攝觀察超薄切片的超微結(jié)構(gòu)。

Western blotting檢測(cè)Notch1、NICD蛋白水平變化：干預(yù)14 d后各組隨機(jī)抓取3只大鼠進(jìn)行充分麻醉后斷頭取左側(cè)大腦皮質(zhì)，將樣本置于含1%PMSF的蛋白裂解液中，然后將組織放置冰里勻漿，放入冰中充分裂解，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量并計(jì)算上樣量，隨后進(jìn)行蛋白SDS-PAGE電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將Notch1、NICD以及β-actin一抗用抗體稀釋液稀釋后進(jìn)行膜孵育置于條件為4 ℃的搖床中過夜，次日用TBST液洗滌3次，每次洗10 min后加入稀釋過生物辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，隨后用ECL液進(jìn)行顯影，并用Image（美國BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測(cè)定各樣本灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或兩樣本秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知行為學(xué)比較

干預(yù)第14天逃避潛伏期空白組與缺血組、干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），干預(yù)組與缺血組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;見表1?？瞻捉M和干預(yù)組穿越平臺(tái)次數(shù)比缺血組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 各組腦梗死體積比較

干預(yù)14 d后，TTC檢測(cè)顯示缺血組大鼠腦區(qū)出現(xiàn)明顯的缺血梗死病灶，而干預(yù)組梗死體積較缺血組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 各組海馬組織超微結(jié)構(gòu)比較

透射電鏡結(jié)果顯示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯破壞，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞出現(xiàn)一系列變性壞死的征象，而干預(yù)組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解的程度明顯減輕。見圖1。

2.4 各組Notch1、NICD蛋白表達(dá)比較

Western blotting法顯示經(jīng)過干預(yù)后Notch1、NICD蛋白有明顯提高，與缺血組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2及圖3。

3 討論

知功能障礙主要包括學(xué)習(xí)記憶力、執(zhí)行力、注意力等的障礙，是缺血性腦卒中最常見并發(fā)癥之一。如果卒中后認(rèn)知功能障礙未得到及時(shí)合理控制，則將逐漸向癡呆進(jìn)展[7-8]。亦有研究人員證實(shí)在認(rèn)知障礙中，約83%腦卒中患者至少某一方面存在功能障礙，且有71%的生存患者即使在醫(yī)院接受了3個(gè)月后的治療，也仍然存在不同程度的認(rèn)知功能障礙[9]。本研究利用Morris水迷宮對(duì)各組大鼠干預(yù)前后的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，水迷宮實(shí)驗(yàn)是借助大鼠會(huì)游泳但又怕水的特點(diǎn)，將大鼠放置在水迷宮中被迫游泳，依靠設(shè)置的空間參照物判斷水中平臺(tái)的位置，從而逃避水患，被視為公認(rèn)的評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能較為客觀的方法。結(jié)果顯示經(jīng)過MCAO造模的大鼠逃避潛伏期明顯較假手術(shù)延長，且穿越平臺(tái)的次數(shù)減少，這提示經(jīng)過MCAO造模后大鼠的確出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)。

百會(huì)穴，其名最早見于晉代皇普謐《針灸甲乙經(jīng)》：“百會(huì)，一名三陽五會(huì)，在前頂后一寸五分，頂中央旋毛中，陷可容指，督脈足太陽之會(huì)”。百會(huì)穴隸屬督脈，又名“三陽五會(huì)”，是督脈、手太陽小腸經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)、手陽明大腸經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足陽明胃經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)的交會(huì)穴。所以，百會(huì)穴對(duì)腦髓有著舉足輕重的調(diào)節(jié)作用。百會(huì)穴具有振奮諸陽、激發(fā)經(jīng)氣、調(diào)節(jié)臟腑、安神定志、滋養(yǎng)腦髓、醒腦開竅等功效[10-12]。陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，刺激陽明經(jīng)可實(shí)現(xiàn)益氣活血、扶正通絡(luò)的效應(yīng)，足三里穴屬于足陽明胃經(jīng)的下合穴，是匯聚天部精微物質(zhì)的經(jīng)典穴位，從而激發(fā)促進(jìn)胃氣升發(fā)，調(diào)整機(jī)體氣血。百會(huì)穴和足三里穴合用遵循遠(yuǎn)近配穴原則，共奏健腦調(diào)神、扶正通絡(luò)作用[13-15]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過按摩百會(huì)穴及足三里穴后大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，這說明穴位按摩的確改善了缺血性再灌注損傷大鼠模型的認(rèn)知能力。我們利用TTC觀察各組大鼠腦梗死體積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組未出現(xiàn)明顯梗死灶，而經(jīng)過MCAO造模的大鼠腦組織均出現(xiàn)明顯梗死灶，這說明本研究造模成功，且經(jīng)過百會(huì)穴、足三里穴干預(yù)后大鼠腦梗死體積明顯減少，在研究中發(fā)現(xiàn)示缺血組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯破壞，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞出現(xiàn)一系列變性壞死，而干預(yù)組大鼠缺血側(cè)大腦海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)壞死及溶解明顯減輕，這說明腦組織缺血再灌注損傷確導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞受損，而經(jīng)過百會(huì)穴、足三里穴干預(yù)有腦保護(hù)效應(yīng)。

本研究檢測(cè)了Notch信號(hào)通路的標(biāo)志因子，結(jié)果顯示缺血組大鼠腦組織Notch1、NICD水平均降低，而干預(yù)組水平上調(diào)，由此認(rèn)為腦缺血中Notch信號(hào)通路受到抑制，而百會(huì)穴、足三里穴干預(yù)激活了Notch信號(hào)通路。Notch信號(hào)通路屬于細(xì)胞信號(hào)裝置器，相鄰的神經(jīng)元細(xì)胞之間的Notch受體與相對(duì)應(yīng)的配體結(jié)合后促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新。有研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路是神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的“決定者”，當(dāng)Notch配體與相關(guān)的受體結(jié)合后可裂解釋放出NICD（Intracellular Domain of Notch），NICD是Notch受體產(chǎn)生活性的主要細(xì)胞片段，隨后Notch配體產(chǎn)生核移位，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合蛋白R(shí)BP-J發(fā)生反應(yīng)，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄信息的調(diào)節(jié)[16-18]。由此可認(rèn)為百會(huì)穴、足三里穴干預(yù)介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與Notch信號(hào)通路密不可分。

總之，通過百會(huì)穴、足三里按摩可改善MCAO大鼠的認(rèn)知能力，減少腦梗死體積，促進(jìn)腦的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復(fù)，其作用機(jī)制可能通過Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

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（2019-03-29收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）