大黃素對TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞增殖的影響

吉晶 何立群

摘要 目的：研究大黃素對TGF-β1誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞株（NRK-49F）增殖以及降低FN（纖連蛋白），Col-I（I型膠原蛋白），Smad2/3蛋白及基因表達(dá)的機制。方法：采用CCK8法檢測不同濃度大黃素對NRK-49F細(xì)胞增殖情況的影響;終濃度為20、40、80 μmol/L的大黃素處理NRK-49F細(xì)胞30 min后，模型組和觀察組均以TGF-β1以5 ng/mL的終濃度刺激24 h，并收集細(xì)胞，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測FN，Col-I，Smad2/3蛋白表達(dá)水平，實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測FN，Col-I，Smad2/3 mRNA表達(dá)。結(jié)果：模型組FN，Col-I，Smad2/3蛋白和基因的表達(dá)明顯增加，大黃素含藥血清組能抑制NRK-49F細(xì)胞增殖，且抑制FN，Col-I，Smad2/3蛋白和的表達(dá)（P<0.05）。大黃素濃度越高，抑制作用越明顯，成一定的量效關(guān)系。結(jié)論：大黃素干預(yù)后，可改善腎纖維化程度，保護(hù)NRK-49F細(xì)胞模型損傷。

關(guān)鍵詞 大黃素;NRK-49F細(xì)胞;纖連蛋白（FN）;I型膠原蛋白（Col-I）;Smad2/3

Abstract Objective：To investigate the mechanism of emodin on the proliferation of TGF-β1 induced renal fibroblasts（NRK-49F）and the reduction of protein and gene expressions of FN（fibronectin），Col-I（typeⅠcollagen）and Smad2/3.Methods：The effects of different concentrations of emodin on the proliferation of NRK-49F cells were detected by CCK8 assay.NRK-49F cells were treated with emodin at a final concentrations of 20，40，80 μmol/L for 30 min.Both the model group and the treatment group were stimulated with TGF-β1 at a final concentration of 5 ng/mL for 24 h，and the cells were collected.The expression levels of FN，Col-I and Smad2/3 protein were detected by Western blot，and the expressions of FN，Col-I and Smad2/3 mRNA were detected by real-time PCR.Results：The expression of FN，Col-I，Smad2/3 protein and gene in the model group was significantly increased.The emodin-containing serum group inhibited the proliferation of NRK-49F cells and inhibited the expression of FN，Col-I，Smad2/3 protein（P<0.05）.The higher the concentration of emodin was，the more obvious the inhibition was.Emodin concentration and inhibition were dose-effect relationships.Conclusion：After emodin intervention，it can improve the degree of renal fibrosis and protect the NRK-49F cell model injury.

Key Words Emodin; Renal fibroblasts（NRK-49F）; Fibronectin（FN）; Col-I; Smad2/3

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.007

腎纖維化是一切慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease，CKD）進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同通路，機制非常復(fù)雜，已影響全球人類的健康，成為世界公共衛(wèi)生關(guān)注的主要關(guān)注點之一。我國CKD發(fā)病率達(dá)11%，患患者數(shù)已達(dá)1.2億。腎纖維化可以發(fā)展成為慢性腎衰竭（Chronic Renal Failure，CRF），而最終結(jié)局是終末期腎臟?。‥nd-stage Renal Disease，ESRD）[1-2]。腎纖維化以腎臟成纖維細(xì)胞活化、增殖，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）在腎間質(zhì)過度積聚，最終導(dǎo)致腎功能喪失為特征[3]。中藥由于其多環(huán)節(jié)、多方位、多靶點的作用優(yōu)點，在治療腎纖維化方面具有獨特的優(yōu)勢。大黃素是中藥大黃的有效單體成分之一，它能抗菌消炎、抗腫瘤，不僅可抑制腎臟成纖維細(xì)胞的活化增殖和ECM的積聚，還能保護(hù)腎成纖維細(xì)胞，減輕TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化[4-7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）被認(rèn)為是致纖維化因子之一，在多組織器官纖維化中起重要作用[8]。近年來運用大黃素治療腎纖維化報道已屢見不鮮，并且都取得了良好的療效。本文采用TGF-β1刺激大鼠腎臟成纖維細(xì)胞（NRK-49F）模型，觀察大黃素對NRK-49F細(xì)胞增殖以及對FN，Col-I，Smad2/3蛋白及基因的影響，探討大黃素對腎臟纖維化的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 NRK-49F大鼠腎臟成纖維細(xì)胞株，購自上海中科院細(xì)胞中心。大黃素（含量>98%），溶解于二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）后制成混懸液。將NRK-49F細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含有5%CO2及飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，每2～3 d傳代1次。待細(xì)胞生長培養(yǎng)至60%～70%，胰酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.1.2 試劑與儀器 大黃素（Sigma，E7881）;TGF-β1人重組蛋白（美國Peprotech公司）、DMEM培養(yǎng)基、雙抗（美國Hyclone公司）;0.25%胰酶（美國Thermo Scientific公司）;二甲基亞砜（DMSO，上海生工有限公司）;Fbs10099-141胎牛血清（美國Gibco公司）;BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、山羊抗兔二抗（威奧生物技術(shù)有限公司）;PVDF膜（美國Millipore公司，0.45 μm）;兔抗小鼠FN IgG、Col-I IgG、Smad2/3 IgG（英國Abcam公司）。BioTek Synergy2酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）;5810R臺式離心機（德國Eppendorf公司）;Mill-Q Integral 3超純水儀（美國Millpore公司）;二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;OLYMPUS IX71倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;ProteinSimple FluorChem M全自動成像分析系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）;trizol試劑（美國Invitrogen公司）;熒光定量PCR儀（羅氏LightCycler 480）。

1.2 方法

1.2.1 大黃素存儲液 精確稱取大黃素50 mg，并用1 mL DMSO超聲破碎溶解，加入4 mL培養(yǎng)基稀釋，得到大黃素濃度37 mmol/L儲存，使用時稀釋。

1.2.2 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖活性 復(fù)蘇NRK-49F細(xì)胞，以每孔100 μL，4×104個細(xì)胞/mL接種于96孔板中，放入5% CO2及37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，向各孔加入100 μL的（20、40、80、160、320）μmol/L大黃素進(jìn)行實驗，每組平行設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組。加入各濃度大黃素培養(yǎng)12、24 h后，滴加10 μL CCK 8，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度OD值，計算細(xì)胞抑制率=（1-A檢驗組/A空白組）×100%。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞分為5組：空白對照組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）、大黃素組（20、40、80 μmol/L）。取對數(shù)生長期的NRK-49F細(xì)胞株，胰酶消化，并以2×106個/mL的密度接種于六孔板中，細(xì)胞生長至60%～70%時，用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，觀察組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的大黃素30 min后，模型組和觀察組都加入終濃度為5 ng/mL的TGF-β1刺激24 h，使每組的總體積為2 mL，然后收集細(xì)胞做蛋白印跡和qPCR分析。

1.2.4 Western Blot檢測蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)24 h后，棄去上清液，并用PBS漂洗3次，RIPA裂解液：PMSF=50∶1的比例，在冰上裂解細(xì)胞5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min后收集細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞收取上清液，并通過BCA方法測定蛋白濃度并定量。每份樣品蛋白上樣量均為40 μg，蛋白marker 5 μL，電泳80 V 120 min后，濕轉(zhuǎn)250 mA轉(zhuǎn)膜2 h，蛋白被轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與FN（ab2413，1∶500），Col-I（ab34710，1∶5 000），Smad 2/3（ab63672，1∶1 000），GAPDH（weiao，1∶2 000）一抗在4 ℃搖床孵育過夜。第2天TBST漂洗3次，10 min/次，再加入二抗，室溫下孵育1 h，并用TBST漂洗3次，10 min/次后曝光。GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測基因表達(dá) 按照Trizol試劑使用方法，提取各組細(xì)胞的總RNA。酶標(biāo)儀檢測RNA濃度及純度，確保A260 nm/A280 nm在1.8～2.0為合格，表明RNA未降解。將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采取20 μL體系，PCR擴增反應(yīng)：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 34 s退火延伸，40個循環(huán)。引物由上海生工生物工程有限公司合成（引物序列見表1）。結(jié)果用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct大黃素組-△Ct空白對照組，各組mRNA的相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中空白對照組的數(shù)值設(shè)為1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間均數(shù)比較，滿足正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析（One way ANOVA），如果進(jìn)一步比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對NRK-49F細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組比較，濃度為160、320 μmol/L的大黃素對NRK-49F

2.2 大黃素對TGF-β1誘導(dǎo)下NRK-49F細(xì)胞FN，Col-I，Smad 2/3蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，經(jīng)TGF-β1刺激的模型組細(xì)胞增殖，F(xiàn)N，Col-I，Smad 2/3蛋白都較對照組高表達(dá)（P<0.01）。而與模型組比較，各濃度大黃素均可下調(diào)FN，Col-I，Smad 2/3蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。圖1和表3。

2.3 大黃素對TGF-β1誘導(dǎo)下NRK-49F細(xì)胞FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，TGF-β1刺激后的NRK-49F細(xì)胞分泌的FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.01）;與模型組比較，各濃度大黃素給藥組均可明顯抑制FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA的表達(dá)，且大黃素給藥濃度越大，相關(guān)基因表達(dá)量越低（P<0.05，P<0.01）。見表4。

3 討論

腎功能的惡化程度與腎間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)。腎纖維化是一種多信號通路傳導(dǎo)、多細(xì)胞因子介導(dǎo)、多因素驅(qū)動的慢性腎病，包括腎間質(zhì)纖維化、腎小球和腎小管硬化，最終都將發(fā)展成為慢性腎衰竭[9]。腎纖維化的典型病理特征是間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，系膜增厚，固有細(xì)胞數(shù)量減少和ECM過度沉積。腎小球毛細(xì)血管因此損傷，血流量減少，腎小球毛細(xì)血管硬化，微循環(huán)出現(xiàn)障礙，最終腎臟萎縮、表面凹凸不平及變硬，出現(xiàn)腎臟結(jié)構(gòu)被破壞及功能喪失[10-12]。腎臟纖維化是由多種原因?qū)е录?xì)胞外基質(zhì)過度沉積而引起，超過了其自身的代償能力，造成腎臟不可逆的腎臟病變。

在中醫(yī)學(xué)中并無“腎纖維化”的病名，屬于“關(guān)格”“水腫”“腰痛”“淋證”等范疇。病因為正氣不足，又感受外邪。其發(fā)病機制主要表現(xiàn)在“虛、濕、瘀、毒”4方面，其中“虛”是腎纖維化的起始因素，“濕”和“瘀”是病理基礎(chǔ)，“毒”是加重腎纖維化的重要方面。近些年一些專家學(xué)者提出腎纖維化與腎絡(luò)微型癥積理論，微型癥積與氣虛、氣滯、血瘀等密切相關(guān)。氣虛或氣運不暢通，氣虛可致瘀，氣滯也致瘀，腎臟脈絡(luò)瘀阻，久瘀則積。腎主水，一旦腎臟受損，不可避免地導(dǎo)致水液代謝失調(diào)，津液不暢，濕邪與毒邪內(nèi)停。日久成痰，痰伏于腎絡(luò)，日久積聚生成痰毒、瘀毒，而導(dǎo)致微型癥積[13]。

腎臟固有的成纖維樣細(xì)胞包括系膜細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞等，其中TGF-β1是重要的誘導(dǎo)因素，腎纖維化進(jìn)展的多種途徑可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活為肌纖維母細(xì)胞表型。TGF-β1可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，膠原蛋白的產(chǎn)生，阻斷TGF-β1可以延緩腎纖維化的進(jìn)程[14-17]。肌成纖維細(xì)胞能夠分泌大量的ECM，包括FN，Col-I等[18]。TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞，一方面增加ECM成分合成，另一方面通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)來抑制ECM降解[19-20]。TGF-β1能夠直接增強腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，引起細(xì)胞外基質(zhì)的異常積聚和腎小球基底膜的增厚，導(dǎo)致腎纖維化[21-22]。TGF-β1有I型受體（TβR-I）、II型受體（TβR-II）和III型受體（TβR-III），其中Smad2/3是TGF-β1通路下游的重要遞質(zhì)，也是主要的效應(yīng)蛋白，其在腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中起著非常重要的作用[23-26]。當(dāng)TGF-β1受體被激活時，P-Smad 2和P-Smad 3可以與Smad 4結(jié)合，復(fù)合物的形成轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄[27-28]。大黃素作為中藥大黃活性成分之一，是中藥大黃蒽醌類物質(zhì)，有減輕腎臟損傷的功能，且具有顯著的抗腎臟纖維化的作用[29-31]。Ⅰ型膠原蛋白是ECM的主要成分，當(dāng)機體保護(hù)炎性反應(yīng)受損的組織時，成纖維細(xì)胞異常性聚集活化，許多細(xì)胞因子開始刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，諸如I型膠原蛋白等等，因此說腎纖維化是I型膠原在腎小球和腎小管過度表達(dá)的最終結(jié)果[32-34]。

本實驗中，外源性的TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞株活化，結(jié)果顯示與空白對照組比較，模型組（單純TGF-β1刺激組）成纖維細(xì)胞大量增殖，F(xiàn)N，Col-I，Smad 2/3蛋白及基因分泌明顯增加。大黃素組較模型組FN，Col-I，Smad 2/3蛋白及基因表達(dá)明顯降低，表明大黃素可以抑制NRK-49F成纖維細(xì)胞的增殖;且大黃素濃度越高，抑制作用越強，又說明大黃素能夠有效延緩慢性腎纖維化的進(jìn)展。在后期研究中，本課題組將對大黃素對其他膠原蛋白和TGF-β1信號通路下游作進(jìn)一步研究，以開發(fā)其在臨床的應(yīng)用價值。

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（2019-04-10收稿 責(zé)任編輯：王明）