健脾清化方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠P38MAPK信號(hào)通路的影響

余弘吉 何立群

摘要 目的：觀察健脾清化方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠P38MAPK的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：SD雄性大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，西藥組和中藥組，行UUO術(shù)制備單側(cè)輸尿管模型，并于術(shù)后7、14、21 d處死大鼠。生化法檢測(cè)大鼠血肌酐、尿素氮;HE、Masson染色觀察腎臟病理形態(tài);WB測(cè)腎組織p38、p-p38、TGF-β1蛋白表達(dá);免疫組化法觀察腎組織p38蛋白陽(yáng)性面積率。結(jié)果：與正常組比較，模型組SCr、BUN含量、p38、p-p38、TGF-β1表達(dá)、p38陽(yáng)性面積率均升高（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較：氯沙坦鉀組和健脾清化方組SCr、BUN含量、p38、p-p38、TGF-β1蛋白表達(dá)、p38陽(yáng)性面積率均降低（P<0.01，P<0.05）。HE、Masson示模型組腎小管明顯擴(kuò)張，腎盂腎盞明顯擴(kuò)張。結(jié)論：健脾清化方能改善單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠的腎臟病理改變，對(duì)腎臟損害有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其能下調(diào)SCr、BUN的含量、p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 健脾清化方;單側(cè)輸尿管梗阻模型;p38 MAPK信號(hào)通路;大鼠;實(shí)驗(yàn);影響

Abstract Objective：To observe the effects of Jianpi Qinghua decoction on P38MAPK in rats with unilateral ureteral obstruction and explore its mechanism.Methods：A total of 90 male SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，a western medicine group and a traditional Chinese medicine group，and the unilateral ureteral model was made by UUO surgery，and the rats were sacrificed at 7，14 and 21 days after surgery.The serum creatinine and urea nitrogen were detected by biochemical method; the pathological morphology of kidney was observed by HE and Masson staining; the expression of p38，p-p38 and TGF-β1 in renal tissue was measured by WB; the positive area ratio of p38 protein in renal tissue was observed by immunohistochemistry.Results：Compared with the normal group，the content of SCr，BUN，the expression of p38，p-p38，TGF-β1 and the positive area ratio of p38 protein in the model group were all increased（P<0.01，P<0.05）; Compared with the model group，the content of SCr，BUN，the protein expression of p38，p-p38，TGF-β1 and the positive area rate of p38 in both the western medicine group and the Jianpi Qinghua decoction group were all decreased（P<0.01，P<0.05）.HE and Masson showed that the renal tubules and the renal pelvis in the model group were significantly expanded.Conclusion：Jianpi Qinghua decoction can improve the renal pathological changes in the model rats with unilateral ureteral obstruction，which has a certain protective effect on kidney damage，and the mechanism may be related to down-regulate the protein expression of SCr，BUN，p38，p-p38 and TGF-β1.

Key Words Jianpi Qinghua decoction; Unilateral ureteral obstruction model; P38 MAPK signaling pathway; Rats; Experiment; Effect

中圖分類(lèi)號(hào)：R256.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.001

腎小管間質(zhì)纖維化是多種病因所致慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）進(jìn)展至終末期腎病的最后共同通路。腎功能的惡化，很大程度上取決于腎小管間質(zhì)纖維化的程度[1]。單側(cè)輸尿管梗阻（Uni-lateral Ureteral Obstruction，UUO）模型是經(jīng)典的腎小管間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型，為目前常用的腎間質(zhì)纖維化模型[2]。p38MAPK屬于MAPK（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）家族中的一個(gè)亞族，是廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi)的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)激酶。有研究表明[3]，p38MAPK在各種急慢性的炎性反應(yīng)過(guò)程中均能被被活化并參與炎性反應(yīng)的形成與持續(xù)發(fā)生。其活化與炎性反應(yīng)過(guò)程中的熱、痛、敏有著緊密的聯(lián)系[4]，p38MAPK介導(dǎo)了多種細(xì)胞內(nèi)信息的傳遞過(guò)程，能對(duì)許多細(xì)胞外刺激產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，能從胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性來(lái)改變相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而介導(dǎo)了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及死亡的全過(guò)程[5]。

健脾清化方治療腎衰的主要病機(jī)在于“中氣式微、陰火乘土、正虛與濕熱濁毒膠著對(duì)壘、三焦壅塞”，其以益氣健脾、清熱利濕為組方原則，本課題組已有研究[6]證實(shí)其不僅能改善慢性腎衰病程中胃腸道不適癥狀，且能有效降低血肌酐、血脂等腎功能指標(biāo)，具有切實(shí)可信的臨床價(jià)值。本研究從p38MAPK信號(hào)通路觀察健脾清化方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻腎病模型大鼠的治療及其作用機(jī)制。為研究健脾清化方對(duì)p38MAPK介導(dǎo)單側(cè)輸尿管梗阻腎病模型大鼠的具體影響，本研究檢測(cè)大鼠血肌酐、尿素氮，腎臟p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達(dá)量，HE染色觀察大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變，免疫組化法觀察大鼠腎臟p38MAPK的陽(yáng)性面積，以期探討健脾清化方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻腎病模型大鼠腎衰的影響及其作用機(jī)制，為健脾清化方治療單側(cè)輸尿管梗阻、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（滬）2013-0016，專(zhuān)用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、水喂養(yǎng)，大鼠均分籠喂養(yǎng)，每籠5只，人工光循環(huán)，一天內(nèi)光照與黑暗時(shí)間均為12 h，濕度為（55±2）%，溫度為（21±2）℃。實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYCK（滬）2013-0016]。所有的操作均按照上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)編號(hào)：SZY201710012。

1.1.2 藥物 中藥由黨參15 g、生黃芪15 g、黃連3 g、制大黃9 g、草果仁6 g、蒼術(shù)10 g組成，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院（上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司）。上述中藥加水浸泡1 h，武火煮沸轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮30 min，將藥液濾出;再次加水煮沸后文火煎煮30 min，濾出藥液，2次藥液混合后煎煮濃縮至600 mL，保證濃縮液中生藥濃度為1.93 g/mL，高壓滅菌后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。氯沙坦鉀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)J20130048）。

1.1.3 試劑與儀器 兔多克隆p38MAPK、p-p38MAPK抗體;鼠多克隆抗體TGF-β1（Abcam，美國(guó)）;無(wú)水乙醇、石蠟（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;PVDF膜（Millipore公司）;ECL化學(xué)發(fā)光液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇海門(mén)市碧云天研究所）;5417R型離心機(jī)3K15（Eppendorf，德國(guó)）;Synergy2型多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國(guó)）;mini-protein tetra cell 1658004型小型垂直電泳槽（Bio-Rad，美國(guó)）;FluorChem M型自動(dòng)成像分析儀（ProteinSimple，美國(guó)）;Hitachi7080型全自動(dòng)生化儀（Tokyo，日本）;TP1020型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、2255型全自動(dòng)切片機(jī)（萊卡，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=18）、UUO模型組（n=72）。1）假手術(shù)組：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉后切開(kāi)左側(cè)腹腔，鈍性分離輸尿管后，將腎臟回納，逐層縫合關(guān)閉腹腔。2）UUO模型組：大鼠麻醉及其他手術(shù)操作同前，分離輸尿管后，于近腎臟側(cè)1/3處用4～0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎，再于遠(yuǎn)離腎臟側(cè)1/3處結(jié)扎，防止尿液返流，生理鹽水沖洗血液后消毒，將腎臟回納，逐層縫合關(guān)閉腹腔。造模結(jié)束后將模型組大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組（健脾清化方）、西藥組（氯沙坦鉀片），每組24只。

1.2.2 干預(yù)方法 造模后健脾清化方組灌胃量為生藥19.3 g/（kg·d），氯沙坦鉀組為33.3 g/（kg·d），假手術(shù)組和模型組分別予等體積的生理鹽水每天灌胃。4組大鼠分別于灌胃7、14、21 d后分批（n=6）處死。大鼠在第7、14、21天時(shí)，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后打開(kāi)腹腔，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，將血液置于碎冰上暫存，夾閉動(dòng)脈摘取左側(cè)腎臟，去除腎包膜后縱向剖開(kāi)腎臟，生理鹽水洗凈血液和潴留的尿液后，將其中1/2腎臟置于4%多聚甲醛溶液中室溫保存，另外1/2腎臟放入凍存管，置液氮中暫存，后轉(zhuǎn)置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 血肌酐（Serum Creatinine，Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）的測(cè)定 血液采集后離心取上清，用常規(guī)生化方法檢測(cè)血肌酐、尿素氮。

1.2.3.2 腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù) 腎臟組織病理，手術(shù)側(cè)腎臟置入4%多聚甲醛，浸泡24 h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，將包埋后的腎臟制成3 μm厚度的切片，脫蠟制水后，1）常規(guī)HE染色，每組大鼠制片6張，隨機(jī)選取6個(gè)互不重疊視野，光鏡下觀察大鼠腎小管和腎間質(zhì)病理改變;2）Masson染色，每組8張切片在200倍鏡視野下觀察6個(gè)互不重疊間質(zhì)視野，采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行圖像采集和半定量分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常;1分：陽(yáng)性面積<1/4;2分：陽(yáng)性面積在1/4～1/2之間;3分：陽(yáng)性面積>1/2。

1.2.3.3 Western Blot法檢測(cè)P38、P-P38、TGF-β1在腎臟組織的表達(dá) 從冰箱中取出腎臟，稱(chēng)取各組同等重量腎臟組織，放入提前配置后的裂解液中，將組織勻漿后離心取上清液，即為腎臟組織蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀讀取蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度定量結(jié)果，取各組蛋白樣品，加入適量的RIPA、上樣緩沖液，使蛋白樣品為均一濃度。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，加封閉液搖床10 min，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，TBST洗膜后分別加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌后，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯色分析。利用Image J軟件分析灰度值，進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值，作為樣品蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.4 免疫組化法觀察肺組織p38MAPK蛋白表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗滌3次;用pH 6.0檸檬酸緩沖液（CB）熱誘導(dǎo)修復(fù)，室溫自然冷卻后洗滌3次;0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫20 min;PBS洗滌3次;20%正常羊血清室溫孵育30 min;滴加p38MAPK一抗（1∶200）37 ℃孵育2 h;PBS洗滌3次;EnVision試劑（HRP/R）37 ℃ 30 min;PBS洗滌3次;DAB顯色8～12 min;蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化;吹干后，樹(shù)脂封片;鏡下觀察，背景呈紫藍(lán)色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像采集和定量分析。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇不相重疊的6個(gè)視野，計(jì)算每例樣本蛋白染色陽(yáng)性面積率（陽(yáng)性細(xì)胞面積÷總面積）作為比較參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組與組之間采用單因素方差分析。任意2組患者之間若滿足正態(tài)分布且方差齊，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);若方差不齊，需校正方差分析;若不符合正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 假手術(shù)組大鼠術(shù)后精神狀況良好，活動(dòng)自如，被毛光澤，進(jìn)食良好，體質(zhì)量隨時(shí)間緩慢增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未死亡。模型組、西藥組、中藥組大鼠均出現(xiàn)不同程度精神不振，喜靜懶動(dòng)，被毛蓬亂無(wú)光澤，體質(zhì)量不隨時(shí)間均勻增長(zhǎng);與模型組、西藥組比較，中藥組大鼠飲食稍增多，體質(zhì)量略重;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于操作不當(dāng)及造模的病理?yè)p害，模型組死亡3只，西藥組死亡2只，中藥組死亡2只。

2.2 觀察大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 取材時(shí)可見(jiàn)，手術(shù)側(cè)大鼠腎臟表面有囊狀隆起，顏色深紅，體積增大，觸摸有波動(dòng)感，剖開(kāi)腎臟可見(jiàn)大量血性膿性積液，腎盂腎盞破壞消失，僅殘留少量腎皮質(zhì)。1）HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。與假手術(shù)組比較，模型組腎小管明顯擴(kuò)張，呈不規(guī)則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞;腎盂腎盞明顯擴(kuò)張，集合管、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀甚至消失;腎間質(zhì)有大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生;腎小球數(shù)量減少，形狀不規(guī)則，在造模后21 d大鼠腎臟切片中，高倍視野下僅見(jiàn)少量殘余腎小球，且有硬化和球管融合。與模型組比較，氯沙坦鉀組、健脾清化方組腎小管擴(kuò)張程度減輕，炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。見(jiàn)圖1。2）Masson染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組腎小管間質(zhì)無(wú)明顯纖維化改變，腎小球無(wú)異常。模型組腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)有脫落壞死的上皮細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞;腎小球體積增大，形狀不規(guī)則;氯沙坦鉀組和健脾清化方組腎小管擴(kuò)張及萎縮減輕，間質(zhì)內(nèi)纖維化組織和炎性細(xì)胞減少，殘余腎小球形態(tài)完整規(guī)則。見(jiàn)圖2。膠原陽(yáng)性染色面積可見(jiàn)：與假手術(shù)組比較，7 d、14 d、21 d模型組陽(yáng)性面積率均顯著增高（P<0.01）;與模型組比較：氯沙坦鉀組和健脾清化方組陽(yáng)性面積率均降低（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 檢測(cè)大鼠血肌酐、尿素氮水平 與假手術(shù)組比較，造模后7 d、14 d、21 d模型組血肌酐升高（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較，造模后14 d、21 d健脾清化方組與氯沙坦鉀組血肌酐降低（P<0.05），造模后7 d健脾清化方組無(wú)差異，氯沙坦鉀組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，造模后7 d、14 d、21 d模型組血尿素氮顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，造模后造模后7 d、14 d、21 d健脾清化方組和氯沙坦鉀組血尿素氮均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 Western Blot法檢測(cè)P38、P-P38、TGF-β1在腎臟組織的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組p38、p-p38、TGF-β1表達(dá)均升高（P<0.05，P<0.01），且隨著時(shí)間增加表達(dá)逐漸升高;與模型組比較，氯沙坦鉀組、健脾清化方組p38、p-p38、TGF-β1表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)圖3。

2.5 免疫組化法觀察肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，p38MAPK陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，主要位于細(xì)胞漿、帶有一些核著色。p38MAPK在假手術(shù)組切片中，表達(dá)較少，呈陰性表達(dá)（-）。而在單側(cè)輸尿管梗阻模型組切片中，其表達(dá)明顯增多，呈弱陽(yáng)性表達(dá)（+），彌漫或散在分布;主要分布在小管及間質(zhì)等部位。西藥組和中藥組P38MAPK的表達(dá)較模型組少。見(jiàn)圖4。陽(yáng)性面積率可見(jiàn)：與假手術(shù)組比較，模型組陽(yáng)性面積率明顯升高（P<0.05，P<0.01），且隨著時(shí)間增加，陽(yáng)性面積率亦升高;與模型組比較，氯沙坦鉀組和健脾清化方組陽(yáng)性面積率均降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

腎臟纖維化是所有形式的終末期腎?。‥SRD）最終方向，也是多種腎臟疾病最終導(dǎo)致終末期腎病的主要途徑和共同的病理改變[7]。而腎臟纖維化的產(chǎn)生是由于多種原因?qū)е录?xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，超過(guò)了腎臟自身代償?shù)那宄芰?，最終造成腎病終末期不可逆的病理改變[8]。單側(cè)輸尿管梗阻模型是經(jīng)典的腎小管間質(zhì)纖維化的大鼠模型，以腎小管的損傷變性和間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞的增生為主要病理基礎(chǔ)，其具有造模時(shí)間短，造模嚴(yán)重程度可控性好的特點(diǎn)，能夠較好地模擬慢性腎衰竭的腎臟纖維化的病理過(guò)程[9]。鄒朝霞[10]等認(rèn)為，在間質(zhì)纖維化進(jìn)展過(guò)程中，腎纖維化程度與腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量息息相關(guān)，上皮細(xì)胞凋亡的數(shù)量越多，纖維化程度就越重，而在纖維化進(jìn)程中，腎小管的擴(kuò)張及后期的萎縮也會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。本研究中，HE染色結(jié)果顯示：模型組腎小管明顯擴(kuò)張，呈不規(guī)則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞;腎盂腎盞明顯擴(kuò)張，集合管、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀甚至消失;腎間質(zhì)有大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生;腎小球數(shù)量減少，形狀不規(guī)則，在造模后21 d大鼠腎臟切片中，高倍視野下僅見(jiàn)少量殘余腎小球，且有硬化和球管融合。Masson染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組腎小管間質(zhì)無(wú)明顯纖維化改變，腎小球無(wú)異常。模型組腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)有脫落壞死的上皮細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞;腎小球體積增大，形狀不規(guī)則;氯沙坦鉀組和健脾清化方組腎小管擴(kuò)張及萎縮減輕，間質(zhì)內(nèi)纖維化組織和炎性細(xì)胞減少，殘余腎小球形態(tài)完整規(guī)則。

健脾清化方是上海曙光醫(yī)院蔡淦教授根據(jù)多年臨床實(shí)踐精心組方而成的治療慢性腎衰病程中脾腎同病癥狀的復(fù)方，體現(xiàn)了“從脾論治”的中醫(yī)治則治法，其具有斡旋中土以利下焦開(kāi)合，剛?cè)岵?jì)以救樞機(jī)乖戾之臨床價(jià)值。馬曉紅等[11]觀察健脾清化方對(duì)5/6腎切除大鼠模型的影響，結(jié)果表明健脾清化方可明顯降低5/6腎切除大鼠24 h尿蛋白量、降低尿素氮、肌酐水平，表明該方具有改善腎切除大鼠腎功能的作用。徐蝶衣等[12]認(rèn)為，健脾清化方能夠延緩慢性腎衰的機(jī)制主要在于其能改善腎衰患者臨床癥狀及腎臟功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，減慢腎臟纖維化的進(jìn)展速度，改善腎臟微炎性反應(yīng)狀態(tài)以及糾正腎性貧血等方面，且中藥制劑具有不良反應(yīng)較小的優(yōu)勢(shì)，顯示出良好的前景。本研究也表明健脾清化方與單側(cè)輸尿管梗阻模型組大鼠在肌酐、尿素氮水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），但隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，肌酐、尿素氮的水平仍有增長(zhǎng)。

促絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族，是傳遞細(xì)胞信號(hào)的重要物質(zhì)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在天然免疫和特異性免疫應(yīng)答中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均起著重要的調(diào)節(jié)作用。p38MAPK是MAPK超家族中重要的一員，與機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)周期的長(zhǎng)短、細(xì)胞分化的速率、凋亡及腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。激素、G蛋白偶聯(lián)受體、氧化應(yīng)激反應(yīng)等許多因素均能激活p38MAPK信號(hào)通路[13-14]。同時(shí)作為p38MAPK下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）也參與了單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠腎纖維化的病理過(guò)程，其主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)，其中TGF-β1是被認(rèn)為是促進(jìn)腎小球和腎間質(zhì)纖維化的最重要的細(xì)胞因子之一[15]。婁強(qiáng)等[16]認(rèn)為，順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷模型中，p38MAPK的磷酸化促使機(jī)體產(chǎn)生酸性的外部環(huán)境，并增加凋亡相關(guān)蛋白的剪切和表達(dá)，而p38MAPK抑制劑可降低細(xì)胞凋亡，減少凋亡相關(guān)蛋白的激活并減輕細(xì)胞外環(huán)境的酸度，提示p38MAPK在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中發(fā)揮重要作用，并可作為潛在的治療藥物性腎損傷的藥物靶標(biāo)。本研究表明，行單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)后大鼠p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達(dá)量均升高，而健脾清化方組大鼠p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達(dá)量相對(duì)降低，表明健脾清化方可以通過(guò)降低p38MAPK信號(hào)通路的活化表達(dá)減輕腎臟炎性反應(yīng)，從而改善腎臟病理狀態(tài)，達(dá)到治療目的。本研究中，健脾清化方無(wú)不同劑量分組，其量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

可見(jiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻刺激可活化p38MAPK，并促使其磷酸化，同時(shí)可激活下游TGF-β1，促使機(jī)體發(fā)生了一系列炎性反應(yīng)和病理形態(tài)改變，進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，引起機(jī)體的疾病狀態(tài)。綜合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)健脾清化方可調(diào)控該通路的關(guān)鍵蛋白以及相關(guān)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而這也可能正是健脾清化方防治單側(cè)輸尿管梗阻腎病的機(jī)制之一，為本病的臨床辨治與靶標(biāo)判定提供方向。

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