三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達(dá)分析

吳圣楠?jiǎng)⒋髠?毅胡寶慶張建強(qiáng)王 艷王 婷

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031)

三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達(dá)分析

吳圣楠1劉大偉2劉 毅1胡寶慶2張建強(qiáng)1王 艷1王 婷1

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031)

利用3′RACE技術(shù), 對(duì)高通量轉(zhuǎn)錄組測序所得三角帆蚌HSP60基因(hcHSP60)長片段(2629 bp)進(jìn)行了3′末端克隆, 經(jīng)拼接得到hcHSP60 cDNA全長序列。采用多種分子生物學(xué)軟件對(duì)hcHSP60 cDNA全長序列進(jìn)行了特征分析, 并采用 RT-PCR技術(shù)檢測了其組織分布及經(jīng)冷熱應(yīng)激后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示, hcHSP60 cDNA全長為2807 bp, 其中開放閱讀框?yàn)?707 bp, 編碼568個(gè)氨基酸, 預(yù)測分子量大小為61.04 ku, pH 7.0時(shí)的理論等電點(diǎn)為5.63。序列中不存在信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列與光滑雙臍螺HSP60同源性最高(達(dá)82%), 而與牙鲆、白云金絲魚HSP60的同源性最低(為75%)。RT-PCR檢測結(jié)果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表達(dá)水平最高, 而在血液中的表達(dá)水平最低。30℃與35℃水溫處理三角帆蚌4h后, 各組織中hcHSP60表達(dá)水平明顯上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐熱應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。

三角帆蚌; 熱休克蛋白60; 序列分析; 表達(dá)

熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是生物體在受到物理或化學(xué)刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì), 又名應(yīng)激蛋白。根據(jù)分子量的不同, 可以將HSPs分為HSP90、HSP70、HSP60及小分子量HSP等若干家族[1]。HSPs首次從熱激果蠅幼蟲唾液腺部位分離得到[2]。HSPs分子在正常狀態(tài)下能幫助新生肽鏈折疊, 而在應(yīng)激狀態(tài)下, HSPs被大量誘導(dǎo), 其分子伴侶作用變大, 當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激時(shí),蛋白質(zhì)肽鏈由折疊變成延伸, 空間構(gòu)型也發(fā)生改變,進(jìn)而與突變蛋白結(jié)合, 使后者解離, 并通過多肽折疊、復(fù)性以維持細(xì)胞自穩(wěn)定, 從而防止細(xì)胞受損[3,4]。

HSP60分子是 HSPs家族中最為保守的分子伴侶蛋白, 大多數(shù)成員為組成型表達(dá)蛋白[5]。HSP60在真核生物中主要存在于線粒體中, 蛋白N-末端有一個(gè)線粒體定位序列, 能夠引導(dǎo)HSP60進(jìn)入線粒體中[6]。HSP60基因如發(fā)生突變, 會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙[7]。HSP60在細(xì)胞生命活動(dòng)中占據(jù)著非常重要的地位, 當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí), HSP60被大量合成,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng), 協(xié)助變性蛋白恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)[8]。迄今除了研究最多的細(xì)菌 HSP60, 還在赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)[9]、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[10]、草魚(Ctenopharyn odon idellus)[11]、凡納賓對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[12]等物種中克隆出HSP60全長序列, 并對(duì)它們的基因結(jié)構(gòu)、功能和組織表達(dá)進(jìn)行了研究, 而針對(duì)軟體動(dòng)物HSP60的研究則尚不多見。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國特有的淡水育珠蚌, 用其培育的珍珠質(zhì)量上佳, 近年淡水育珠蚌培育珍珠開始發(fā)展[13]。但日益嚴(yán)重的病害給我國淡水育珠產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。HSPs是生物體內(nèi)的重要抗感染和抗逆蛋白分子, 對(duì)三角帆蚌HSPs的深入研究有助于我國淡水育珠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究利用 3′RACE技術(shù), 對(duì)高通量轉(zhuǎn)錄組測序所得三角帆蚌 HSP60基因(hcHSP60)長片段(2629 bp)進(jìn)行了3′末端克隆, 經(jīng)拼接得到hcHSP60 cDNA全長序列, 采用多種分子生物學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行特征分析, 并采用 RT-PCR技術(shù)檢測了其在多種組織中的表達(dá)分布及在冷熱應(yīng)激后的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用三角帆蚌購自南昌市人民公園菜市場, 體長約10—15 cm。購回實(shí)驗(yàn)室后, 立即用自來水將蚌殼上的淤泥仔細(xì)刷洗干凈, 置于盛有曝氣自來水的水族箱(100 cm×60 cm×45 cm)中暫養(yǎng), 箱中水量不宜過多, 以剛剛淹沒蚌體為佳。每天用曝氣自來水換水1至2次, 充氣泵充氣飼養(yǎng), 暫養(yǎng)1周確認(rèn)蚌體健康無病之后方開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 核酸提取與cDNA模板合成

采用 Invitrogen公司的 Trizol試劑盒提取總RNA, 操作過程中(包括組織總 RNA提取以及應(yīng)用RNA的所有相關(guān)實(shí)驗(yàn))所用離心管及槍頭都經(jīng)1 g/L焦碳酸二乙酯(Diethylpryocarbonate, DEPC)水處理過夜, 琉璃器皿及金屬器械經(jīng)180℃高溫烘烤6h以上使RNase徹底失活。RNA的具體提取參考試劑盒的說明書進(jìn)行。cDNA合成按SMART cDNA Synthesis Kit操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.3 hcHSP60 cDNA全長獲得

始自 hcHSP60 cDNA 5′末端的 1條長段序列(2629 bp)由轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果獲得, 轉(zhuǎn)錄組測序工作由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。依據(jù)此序列, 采用Clontech公司的SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3′端序列。擴(kuò)增時(shí)共設(shè)計(jì)2條引物: HSP60-F1與HSP60-F2。首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶 SMARTScribe? Reverse Transcriptase和引物3′ CDS primer A 對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, 再使用引物 HSP60-F1和 UPM (Long引物和Short引物按1︰3比例混勻所得), 以上面合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增; 將第一輪 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 50倍, 然后用引物HSP60- F2和 UPM進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增, 將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化, 純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測序, 最后進(jìn)行全長序列拼接, 得到hcHSP60 cDNA全長序列。用于hcHSP60基因擴(kuò)增與表達(dá)的引物見表1。

表1 hcHSP60基因擴(kuò)增與表達(dá)所用引物Tab. 1 Primers used in amplification and expression of hcHSP60

1.4 hcHSP60基因序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 ExPASy(http://expasy.pku.edu.com)上軟件分析 hcHSP60氨基酸序列與開放閱讀框(ORF);采用NCBI BLASTp進(jìn)行序列同源基因搜索; 利用SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測分析信號(hào)肽, 用 TMHMM 軟件預(yù)測跨膜區(qū);利用ClustalW 1.83軟件比較hcHSP60與其他物種HSP60氨基酸序列同源性; 采用 Mega 4.0軟件的鄰接法(N-J法)構(gòu)建基于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹,并采用自展法(Bootstrap Method)對(duì)其可靠性進(jìn)行分析驗(yàn)證(1000個(gè)假重復(fù)數(shù))。用于氨基酸比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建的基因名稱及其 GenBank序列登錄號(hào)見表2。

1.5 hcHSP60在不同組織中的表達(dá)

從暫養(yǎng)蚌的水族箱中選取3個(gè)蚌, 取血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等 5種組織, 用 Trizol法提取總 RNA, 用紫外分光儀(UV-5100)測定濃度并統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL, 各取2 μL反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 利用RT-PCR法檢測室溫下(20 ℃)hcHSP60在三角帆蚌不同組織中的表達(dá), 引物見表 1。PCR擴(kuò)增條件: 94 ℃5min; 94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 90s, 40循環(huán); 72 ℃ 10min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.6 hcHSP60在冷熱應(yīng)激后的表達(dá)變化

將蚌分成7組(每組放置3個(gè)), 分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃及35℃等7種水溫,放置4h后分別取其血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等組織, Trizol法提取各組織的總 RNA, 利用RT-PCR法檢測hcHSP60在不同組織中的表達(dá)變化, PCR擴(kuò)增條件同1.5。

通過Quantity One軟件計(jì)算目的條帶和β-actin條帶的光密度比值, 結(jié)果使用SPSS20.0軟件中的單因素方差分析法(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, P＜0.05為顯著性差異。

表2 用于氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建的60基因登錄號(hào)Tab. 2 Genes of HSP60 used for multiple alignments and construction of phylogenetic tree

2 結(jié)果

2.1 hcHSP60 cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列特征

以三角帆蚌血液組織總 RNA為模板, 通過 3′RACE-PCR擴(kuò)增, 獲得長度為178 bp擴(kuò)增片段, 序列拼接獲得的hcHSP60基因cDNA全長為2807 bp (GenBank登錄號(hào): KF941200), 其中5′端非翻譯區(qū)69 bp, 3′端非翻譯區(qū) 1031 bp, 有典型的加尾信號(hào)(AATAAA)和 PolyA尾巴。該基因開放閱讀框?yàn)?707 bp, 編碼 568個(gè)氨基酸, 預(yù)測分子量大小為61.04 ku, pH 7.0時(shí)的理論等電點(diǎn)為5.63。多重比對(duì)結(jié)果證明 hcHSP60符合 HSP60s所有特征。使用SignalP 4.0預(yù)測hcHSP60無信號(hào)肽, TMHMM預(yù)測hcHSP60無跨膜區(qū)。

2.2 序列同源性

利用Clustal X1.8和GeneDoc軟件對(duì)13個(gè)物種的HSP60氨基酸序列進(jìn)行了同源比對(duì)(表2)。hcHSP60氨基酸序列與光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata) HSP60的同源性最高, 達(dá)82%; 與牙鲆(Paralichthys olivaceus)與白云金絲魚(Tanichthys albonubes) HSP60的同源性最低, 為75%。

2.3 HSP60系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖1 HSP60系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of HSP60 gene

應(yīng)用Mega4.0軟件按鄰接法構(gòu)建了HSP60系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示, 所列物種分為4個(gè)分支, 其中, hcHSP60與光滑雙臍螺 HSP60在一個(gè)分支上,表明在所選的物種中, hcHSP60與光滑雙臍螺HSP60之間的分子進(jìn)化地位最近。

2.4 hcHSP60組織表達(dá)

提取室溫條件下(20 )℃ 的三角帆蚌血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等5種組織總RNA, 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 利用RT-PCR, 分別擴(kuò)增得到長度為141 bp的hcHSP60片段和長度為145 bp的β-actin片段(圖2)。從圖4可以看出, hcHSP60在各個(gè)組織中均有表達(dá), 以肝胰腺中的表達(dá)水平最高, 其次為肌肉、外套膜及鰓, 而在血液中的表達(dá)最低。

2.5 冷熱應(yīng)激后的hcHSP60表達(dá)變化

由圖3可以看出, 經(jīng)30℃或35℃刺激4h后, 各組織中hcHSP60的表達(dá)水平明顯高于其他幾種溫度下的表達(dá)。其中, 血液 hcHSP60表達(dá)峰值出現(xiàn)于35 , ℃ 而其他4種組織中的hcHSP60表達(dá)峰值皆出現(xiàn)于30℃。

3 討論

HSP60廣泛存在于原核生物和真核生物中, 是HSPs家族中最為保守的司細(xì)胞保護(hù)作用之伴侶蛋白分子[5]。不同物種的HSP60基因結(jié)構(gòu)非常保守, 赤點(diǎn)石斑魚HSP60 基因編碼578個(gè)氨基酸[7], 三疣梭子蟹的HSP60基因編碼577個(gè)氨基酸[10]。本研究所克隆hcHSP60開放閱讀框編碼568個(gè)氨基酸, 蛋白分子量為61 ku, 等電點(diǎn)為5.63。氨基酸序列比對(duì)顯示hcHSP60和其他物種HSP60氨基酸序列有較高的相似性, 都在70%以上, 與光滑雙臍螺HSP60相似性高達(dá)82%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明hcHSP60與同屬軟體動(dòng)物的光滑雙臍螺聚為一支,表明本研究所克隆的hcHSP60確為熱休克蛋白60家族成員。

圖2 hcHSP60在三角帆蚌不同組織中的表達(dá)Fig. 2 The expression of hcHSP60 in different tissues of H. cumingii

圖3 hcHSP60基因在冷熱應(yīng)激后的表達(dá)Fig. 3 The expression of hcHSP60 under different water temperature

hcHSP60作為 HSP60家族中的一員, 含有HSP60家族信號(hào)位點(diǎn)(AAVEEGIVPGGG), 而其序列中不存在信號(hào)肽, 說明它不是分泌蛋白。依據(jù)hcHSP60含有ATP/ADP結(jié)合位點(diǎn)(D G V T V A K),基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)(E G M K F D R G Y I S P Y), 線粒體定位序列(A A V E E G I V P G G G)等事實(shí), 表明其作用位點(diǎn)也存在于細(xì)胞線粒體中[14]。hcHSP60氨基酸序列中有 1個(gè)典型的 C末端 GGM重復(fù)序列(GGMGGGM), 還有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和N-型天冬酞胺糖基化位點(diǎn)。有研究表明HSP60能借助上述位點(diǎn)激活免疫相關(guān)因子IL-8、IL-12、IL-15、B7、MLP、MZP 和NO等, 通過發(fā)動(dòng)天然免疫反應(yīng)來抵御細(xì)菌的入侵[15,16]。

HSP60廣泛存在與各種生物體內(nèi), 而不同生物體HSP60在不同組織中的表達(dá)水平各異。赤點(diǎn)石斑魚HSP60在肝、腸、鰓、頭腎、胃、腦、脾中均有表達(dá), 以腦中的表達(dá)量最高[9]。三疣梭子蟹 HSP60在肝、心、腹肌、觸角腺、鰓、腸、附肢肌肉中皆有表達(dá), 以觸角腺和腸中的表達(dá)量最高[10]。而本研究則發(fā)現(xiàn)hcHSP60在三角帆蚌的血液、肝胰腺、鰓、外套膜及肌肉中均有表達(dá), 而以肝胰腺中的表達(dá)水平最高。推測肝胰腺在三角帆蚌保護(hù)機(jī)體細(xì)胞及其損傷修復(fù)方面起重要作用。

HSPs是一類應(yīng)激蛋白, 可通過傳遞自身“危險(xiǎn)信號(hào)”, 觸發(fā)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)激反應(yīng)。多種應(yīng)激因子, 如重金屬、細(xì)菌、熱休克都能誘導(dǎo)HSPs的表達(dá)。褶紋冠蚌在熱刺激后, 其HSP70在組織中的表達(dá)量明顯提高, 以鰓組織中的表達(dá)量增加最多, 血淋巴次之, 而肌肉的表達(dá)量增加最少[17]。極端嗜熱菌(Pyrococcus furiosus)能生活在98℃的高溫下, 最主要的HSPs分子為HSP60及HSP20, 表明HSP60在提高細(xì)菌耐熱能力方面起著重要作用[18,19]。本研究的結(jié)果表明, 在相對(duì)較高水溫(30℃與 35 )℃下放置4h后, 三角帆蚌各組織中hcHSP60表達(dá)量明顯升高,表明hcHSP60在抗熱應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。有研究表明, 冷應(yīng)激可引起雞肝臟HSP60表達(dá)顯著增加[20]、福壽螺個(gè)別組織HSP60急劇上升[21], 而本文用較低水溫(5℃、10℃及 15 )℃處理 4h后, 發(fā)現(xiàn)各組織中hcHSP60的表達(dá)與20℃或25℃處理組之間相比并無明顯變化, 零度及零度以下水溫應(yīng)激能否刺激hcHSP60的表達(dá)上調(diào), 有待于進(jìn)一步的研究。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF HEAT SHOCK PROTEIN 60 GENE FROM HYRIOPSIS CUMINGII

WU Sheng-Nan1, LIU Da-Wei2, LIU Yi1, HU Bao-Qing2, ZHANG Jian-Qiang1, WANG Yan1and WANG Ting1
(1. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Heat shock protein 60 (HSP60) is an important molecular chaperone protein that mainly exists in the mitochondria of organism. In the present study, the cDNA sequence of Hyriopsis cumingii HSP60 (hcHSP60) was cloned by 3′ rapid amplification of cDNA ends methods (3′-RACE) based on a long chain sequence of hcHSP60 (2629 bp) and was determined by high flux sequencing for transcriptome of H. cumingii blood cells, and its expression in the different tissues was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results showed that the full-length cDNA of hcHSP60 was 2807 bp that contains an open reading frame of 1707 bp, encoding a protein of 568 amino acid residues with 61.04 ku of predicted molecular weight and 5.63 of the theoretical isoelectric point, which was predicted to have no signal peptide and transmembrane helices. The deduced amino acid sequence of hcHSP60 shares the highest identity (82%) with HSP60 of Biomphalaria glabrata, and the phylogenetic analysis demonstrated that they were clustered in a same clade. The results of RT-PCR indicated that hcHSP60 was constitutively expressed in all 5 examined tissues of H. cumingii with the highest expression in hepatopancreas. The expression of hcHSP60 in all detected tissues was up-regulated obviously by higher water temperature, suggesting that it may play an important role in the stress response against heat.

Hyriopsis cumingii; Heat shock protein 60; Sequence analysis; Expression

Q781

A

1000-3207(2014)05-0897-06

10.7541/2014.134

2013-08-11;

2014-03-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060359); 江西省自然科學(xué)基金(20122BAB204017)資助

吳圣楠(1992—), 女, 江西鷹潭人; 碩士研究生; 主要從事分子免疫學(xué)研究。E-mail: wusn2013@163.com

劉毅, E-mail: yiliusan@sina.com