響應(yīng)面優(yōu)化食用菌多酚的提取及抗氧化活性評價

王晶波 秦文 王麗媛 楊倬 卓勤 宮照龍 沈葹

摘 要：目的：優(yōu)化食用菌多酚的超聲波法提取工藝，對比不同食用菌多酚的抗氧化活性。方法：以多酚提取率為指標(biāo)，采用超聲波法，通過單因素試驗及響應(yīng)面分析，確定超聲波法的最佳工藝流程。采用Folin-Ciocalteu比色法檢測多種食用菌的多酚提取率，并以對DPPH·清除能力評價食用菌多酚的抗氧化活性。結(jié)果：響應(yīng)面試驗確定超聲波法的最佳提取條件為乙醇濃度為85%、超聲時間為38 min、液料比為44∶1mL/g，多酚提取率可達(dá)5.258 mg/g，與模型理論預(yù)測值（5.236 mg/g）的相對誤差僅為1.28%，表明該工藝穩(wěn)定、可靠。食用菌多酚提取率與抗氧化能力檢測結(jié)果表明，超聲波法得到的食用菌多酚都具有抗氧化活性，且抗氧化能力與多酚提取率之間的相關(guān)性顯著，其中黃牛肝菌單位毫克多酚的DPPH·清除能力最強(qiáng)。結(jié)論：通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波法提取食用菌多酚的工藝條件，保持了食用菌多酚的抗氧化活性，是一種可行、實用和高效的食用菌多酚提取方法。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面;食用菌多酚;超聲波法;抗氧化活性

我國是食用菌生產(chǎn)和消費大國，食用菌的產(chǎn)量十分豐富，在2013年已經(jīng)達(dá)3 169.7萬t，占到了全球總產(chǎn)量的70%以上[1]，我國食用菌種類繁多，大型食（藥）用菌共有966種[2]，是我國的重要生物資源，也是科學(xué)研究的重要類群。食用菌味道鮮美，脂肪含量極低，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦質(zhì)元素、多糖、多酚、黃酮和生物堿等多種生物活性成分，具有較多的藥用價值及較好的保健功能[3-7]。其中，食用菌多酚是食用菌中提取的具有兩親結(jié)構(gòu)和諸多衍生化反應(yīng)活性的一類次生代謝產(chǎn)物。大量研究表明，食用菌多酚具有抗氧化[8-10]、抗病毒[11]、抗腫瘤[12]和抗菌[13]等作用。多酚的提取方法多種多樣，包括經(jīng)典的有機(jī)溶劑提取法[14-15]、超聲波法、微波法和酶解法等[16]，提取方法常常受有機(jī)溶劑種類及濃度、提取時間、液料比、提取次數(shù)等因素的影響，使得多酚提取率的高低不同，耗費的時間、物力以及成本也不同。超聲波技術(shù)作為一種有效的提取方法，可大大縮短提取時間，提高提取效率，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究[17]。目前，相關(guān)研究多采用有機(jī)溶劑提取法，超聲波法研究得比較少，還需要進(jìn)一步的深入探索。同時，多酚含量的差異性與食用菌的種類與提取工藝密切相關(guān)，優(yōu)化食用菌多酚的提取工藝、比較不同食用菌的多酚提取率，對于進(jìn)一步研究食用菌多酚的功能作用提供基礎(chǔ)。

本研究以食用菌多酚提取率為指標(biāo)，先采用單因素試驗確定超聲波法提取食用菌多酚的因素和水平，再采用響應(yīng)面法確定超聲波法的最佳提取工藝，同時還對比了多種食用菌多酚提取率和抗氧化能力，證實超聲波法未破壞食用菌多酚的生物活性，為食用菌多酚的分離純化、功能性研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

食用菌樣品（市售），分別購自云南、河北、北京和吉林，將樣品去除雜質(zhì)沙泥，60 ℃烘干、粉碎，過120目篩后置陰涼干燥處備用。20種食用菌按照順序分別為灰樹花、栗蘑、口蘑、花菇、香菇、紅蘑菇、松蘑、元蘑、松毛菌、鹿茸菌、茶樹菇、黃牛肝菌、姬松茸、黑松露、雞油菌、羊肚菌、猴頭菇、黑虎掌菌、竹蓀和金針菇。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（89.9%），中國食品藥品檢定院;左旋抗壞血酸（SLBL9227V），Sigma Aldrich公司;無水乙醇，北京化工廠;Folin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、 PBS（pH=7.4），Sigma Aldrich公司;過硫酸鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

酶標(biāo)儀SpectraMax i3x，基因有限公司;離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5810R，艾本德中國有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9240B型，上海森信實驗儀器有限公司;電子天平METTLER TOLEDO-ME403E，梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（功率600w，頻率40 000Hz），昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 多酚含量檢測

采用Folin-Ciocalteu比色法測定，在96孔板上分別加入30 μL的多酚提取液樣品、150 μLFolin-Ciocalteu試劑（0.2N）和120 μL碳酸鈉溶液（75 g/L），室溫暗處反應(yīng)2h后，在酶標(biāo)儀于760 nm下測定吸光度，以沒食子酸（8.75、17.5、35、70、140、280 μg/mL）為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取多酚含量以每克食用菌中沒食子酸當(dāng)量計。

1.3 超聲波法提取食用菌多酚工藝單因素試驗

1.3.1 不同乙醇濃度對食用菌多酚提取的影響 稱取8份1 g香菇粉末，按照液料比為40∶1、超聲時間為30 min，加入不同濃度的乙醇-水溶液，分別為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %和100 % （v/v），超聲提取后4 500 r/min離心15 min，吸取上清液并用70 %乙醇溶液定容至50 mL，測定多酚含量并計算多酚提取率（以每克香菇多酚含量計）。

1.3.2 不同超聲時間對食用菌多酚提取的影響 稱取8 份1 g香菇粉末，按照液料比為40∶1，加入70%的乙醇溶液，分別超聲10、20、30、40、50、60、70、80 min后4 500 r/min離心15 min，吸取上清液并用70%乙醇溶液定容至50 mL，測定多酚含量并計算多酚提取率。

1.3.3 不同液料比對食用菌多酚提取的影響 稱取5份1 g香菇粉末，分別按照料液比1∶20、1∶30、1∶40 、1∶50和1∶60加入70%乙醇溶液，超聲30 min后4 500 r/min離心15 min，吸取上清液并用70%乙醇溶液定容至100 mL，測定多酚含量并計算多酚提取率。

1.4 超聲波法提取食用菌多酚工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，響應(yīng)面試驗采用香菇干粉1g，選取乙醇濃度（A）、超聲時間（B）和液料比（C）這3個因素，以多酚提取率為響應(yīng)面值，利用Design-Expert 8軟件設(shè)計三因素三水平17個試驗點5個中心點的響應(yīng)面優(yōu)化試驗（表1）。

1.5 多種食用菌多酚提取率檢測

每種食用菌均稱取1g干粉，采用響應(yīng)面法分析得到的最佳工藝條件提取食用菌多酚，重復(fù)3次，采用1.2法測定多酚含量，對比20種食用菌的多酚提取率，食用菌多酚提取液-20 ℃保存，1周內(nèi)待測。

1.6 多種食用菌多酚DPPH·清除能力檢測

取15 μL樣品多酚提取液于96孔板中，每孔加入225 μL的0.02 mg/mL的DPPH·，室溫避光反應(yīng)15 min，于517 nm測吸光度值，以乙醇代替樣品溶液做空白對照，采用抗壞血酸（5、10、20、30、40、50 mg/L）作為陽性對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抗壞血酸當(dāng)量（mg AEAC/g）計算多酚含量，同時計算1 g食用菌提取的多酚對DPPH·清除率，計算公式為式（1）：

DPPH·清除率=（OD空白-OD樣品）/OD空白*100%（1）

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在760nm處測定吸光度值，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.007 5x+0.030 4，R2=0.995 9。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度、超聲時間和液料比的增加，多酚提取率變化比較規(guī)則，均為先增加后減少，在乙醇濃度為80%、超聲時間為40min和液料比為40∶1時達(dá)到最大，因此，乙醇濃度80%、超聲時間40min和液料比為40∶1為最佳工藝參數(shù)。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化食用菌超聲波法提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計方案 根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，以提高食用菌多酚提取率為目的，考察乙醇濃度（A）、超聲時間（B）和液料比（C）對食用菌多酚提取率的影響，按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗（表2）。利用Design-Expert 8軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到以食用菌多酚提取率為響應(yīng)值的回歸方程：

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型方差分析 從表3可以看出，超聲波提取食用菌多酚試驗?zāi)Ｐ头浅ｏ@著（F=22.44，P=0.000 2<0.01），失擬項不顯著（F=0.081，P=0.966 7>0.05），R2=0.966 5，R2Adj=0.923 4，表明該模型擬合程度良好，受其他因素影響較小，建模成功，結(jié)果可靠，因此可以用該模型對食用菌多酚的超聲波法提取工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測。方差分析中的顯著性表明，一次項A（P=0.001 4）、C（P=0.004 5）、交互項AC（P=0.001 4）、二次項A2（P=0.001 1）、C2（P<0.000 1）對多酚提取率的影響極顯著，交互項BC（P=0.013 7）、二次項B2（P=0.038 3）對多酚提取率的影響顯著，而B（P=0.302 9）、交互項AB（P=0.124 6）的P>0.05，說明對結(jié)果影響不顯著。由方差分析結(jié)果中的F值和P值可知，影響食用菌多酚的主次順序依次為乙醇濃度、液料比和超聲時間，其中乙醇濃度和液料比對響應(yīng)值影響比較大。

2.3.3 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化 響應(yīng)面圖中等高線圖的形狀反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著;3D曲面圖的陡峭程度表明因素對多酚提取率的影響程度，陡峭表明影響大，平緩表明影響小。圖2b乙醇濃度和液料比交互作用的響應(yīng)面坡度陡峭，等高線圖是橢圓形，說明二者交互作用極顯著;同一乙醇濃度下，隨液料比增加，多酚提取率增加，達(dá)到最佳后開始減小;與之相比，同一液料比的水平下，隨著乙醇濃度增加，多酚提取率增加，達(dá)到最佳后開始減小。同理，圖2c超聲時間和液料比3D曲面圖較陡峭，等高線圖是橢圓形，說明二者交互作用顯著;圖2a乙醇濃度和超聲時間3D曲面圖比較平緩，等高線圖近似圓形，說明二者交互作用不顯著，這些與響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果是一致的。

2.3.4 響應(yīng)面最佳提取工藝條件和驗證試驗 通過軟件分析得到超聲波法提取食用菌多酚最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度84.97 %、超聲時間37.71 min、液料比43.71 mL/g，在此條件下多酚提取率為5.326 mg/g。為了操作方便，修改最佳工藝為乙醇濃度85%、超聲時間38 min、液料比44∶1mL/g，在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗，所得提取率平均值為5.258 mg/g，實測值與預(yù)測值相對誤差為1.28 %，說明該優(yōu)化工藝條件能很好地預(yù)測食用菌多酚提取情況。

2.4 20種食用菌多酚提取率和抗氧化能力檢測

采用超聲波提取法最佳工藝乙醇濃度85 %、超聲時間38 min、液料比44∶1mL/g條件下提取20種食用菌多酚，紅蘑菇、口蘑、松蘑、黑虎掌菌和姬松茸的多酚提取率高，達(dá)到12.33±0.46 mg/g，比多酚提取率低的香菇（5.26±0.10 mg/g）高出2.34倍。此超聲波法未破壞食用菌多酚的抗氧化活性，20種食用菌多酚均具有不同程度的抗氧化能力，其中黃牛肝菌、口蘑、松蘑、松毛菌和姬松茸對DPPH·清除能力強(qiáng)，相當(dāng)于（69.33～56.44mg）抗壞血酸的DPPH·清除能力，對20種食用菌的多酚提取率和DPPH·清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，抗氧化能力與食用菌多酚提取率之間的相關(guān)性顯著（R=0.774 8），多酚提取率高，抗氧化能力強(qiáng)，其中尤以黃牛肝菌抗氧化能力強(qiáng)，單位毫克多酚的DPPH·清除能力達(dá)到7.27 mg AEAC/mg，然后依次是松毛菌、口蘑、姬松茸和松蘑，均具有很強(qiáng)的抗氧化能力（表4）。

3 結(jié)論

超聲提取法提取主要是利用超聲波空化產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁及整個生物體瞬間破裂，同時超聲波產(chǎn)生振動作用加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，加速植物中的有效成分進(jìn)入溶劑，使其進(jìn)一步增大了有效成分進(jìn)入溶劑。所用儀器簡單，操作方便，超聲波儀自動化程度較高，便于大規(guī)模生產(chǎn)[18]。本研究采用響應(yīng)面法對食用菌多酚超聲波法提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了食用菌多酚提取率與乙醇濃度、超聲時間和液料比這3種因素的二次回歸模型。由該模型確定了超聲波法提取食用菌多酚的最佳工藝條件為乙醇濃度85%、超聲時間38 min、液料比44∶1mL/g，經(jīng)驗證，該條件下得到的多酚提取率與模型理論值相對誤差僅為1.28%，說明該模型能較好地預(yù)測實際多酚提取率，用響應(yīng)面法優(yōu)化食用菌多酚的超聲波法準(zhǔn)確可行。另外，超聲波法在提取過程中無需高溫，避免高溫對食用菌多酚分子的結(jié)構(gòu)破壞，能夠有效地提取多酚，保持多酚的活性，對比20種食用菌干粉的多酚提取率和DPPH·清除能力，結(jié)果表明，抗氧化能力與多酚提取率之間的相關(guān)性顯著，多酚提取率高，抗氧化能力強(qiáng)，黃牛肝菌單位毫克多酚的DPPH·清除能力最為顯著，其次是紅乳牛肝菌、口蘑、姬松茸和松蘑，是值得進(jìn)一步開發(fā)研究的食用菌菌種。

綜上所述，通過優(yōu)化提取條件，超聲波法提高了食用菌多酚提取量，未破壞多酚的生物活性，是一種可行、實用和高效的食用菌多酚提取方法，可以在食用菌多酚的工業(yè)化生產(chǎn)積極推廣應(yīng)用，為今后對食用菌的進(jìn)一步開發(fā)利用和功能研究提供參考。

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