高效液相色譜和超高效液相色譜法測(cè)定乳制品中三聚氰胺含量的對(duì)比

摘要：目的 建立測(cè)定三聚氰胺含量的超高效液相色譜（UPLC）法，并與高效液相色譜（HPLC）法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。方法 HPLC條件為Agilent Zorbax SB_C18柱（250 mm × 4.6 mm ，5μm）以離子對(duì)試劑緩沖溶液與乙腈為流動(dòng)相（95：5）;流速1.0mL/min;UPLC條件為 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）;以離子對(duì)試劑緩沖溶液與乙腈為流動(dòng)相（95：5）;流速0.5mL/min。結(jié)果 兩種方法所得含量測(cè)定結(jié)果一致。HPLC法和UPLC法回收率分別為92.9% （RSD=0.84，n=6）和95.3%（RSD=0.48，n=6）。結(jié)論 UPLC法與HPLC法相比在具備準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的同時(shí)，更加快速、靈敏、并且大大減少了有機(jī)溶劑的消耗，因此可以成功替代HPLC法測(cè)定三聚氰胺的含量。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜法、高效液相色譜法、三聚氰胺、含量測(cè)定、比對(duì)

1? 引言

三聚氰胺（英文名Melamine），簡(jiǎn)稱三胺，又名蜜胺、氰尿酰胺。分子式C3N3H6，分子量126.12。白色結(jié)晶粉末，無味，相對(duì)密度1570kg/m3。微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對(duì)身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。[1，2]

但由于目前食品檢測(cè)中測(cè)定蛋白質(zhì)的凱氏定氮法是通過測(cè)定樣品中氮原子含量來間接推算出蛋白質(zhì)含量的，而此方法無法識(shí)別氮的來源，蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，而是三聚氰胺含氮量高達(dá)66.67%，少量添加即可大大提高產(chǎn)品的含氮量，不法商人借此提升食品檢測(cè)蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，從而通過檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)[3]。

而對(duì)于三聚氰胺的測(cè)定方法有很多，例如液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，其中毛細(xì)管電泳法和分光光度法靈敏度低，只可滿足一般檢測(cè)要求;氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生化步驟，操作繁瑣;ELISA則只適用于大批樣快速篩選檢測(cè)，若為陽性需進(jìn)一步確證[4]。而液相色譜法為國標(biāo)中乳與乳制品檢測(cè)的推薦方法，可定性定量[5]，但普通液相色譜法仍有測(cè)定樣品周期長(zhǎng)，產(chǎn)生廢液量大的缺點(diǎn)，故本文對(duì)原有HPLC方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化并優(yōu)化，建立超高效液相色譜（UPLC）法，為乳制品中三聚氰胺含量的測(cè)定提供更快速、高效、靈敏和環(huán)保的方法。

2? 材料

2.1 儀器

島津LC_20AB型高效液相色譜儀（日本 島津）;Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀（美國 沃特世）;AG285 型天平（瑞士 梅特勒）;超純水儀（美國 密理博）。

2.2 試劑

三聚氰胺對(duì)照品（CAS 108-78-01，純度大于99.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、辛烷磺酸鈉（色譜純）、超純水。

3? 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

3.1.1 HPLC色譜條件：色譜柱為 Agilent Zorbax SB_C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;以離子對(duì)試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L，pH為3.0）與乙腈為流動(dòng)相，V：V=95：5;流速1.0mL/min;柱溫40℃;波長(zhǎng)240nm;進(jìn)樣量10μL

3.1.2 UPLC色譜條件：色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）;以離子對(duì)試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L，pH為3.0）與乙腈為流動(dòng)相，V：V=95：5;流速0.5mL/min;柱溫40℃;波長(zhǎng)240nm;進(jìn)樣量0.5μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶，用甲醇水溶液（1：1）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到濃度為0.2、2.0、10.0、20.0、30.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，過微孔濾膜后備用。在HPLC條件下三聚氰胺的保留時(shí)間為15.12min，在UPLC條件下保留時(shí)間為1.12min，見下圖。

3.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲并振蕩后，以4000r/min離心10min，上清液過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次以3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干，用6mL氨化甲醇（5%）溶液洗脫。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜備用。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察

HPLC方法：按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣10.0μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.69×105+3.07×105 ，r2=0.9989，三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

UPLC方法：按“3.1.2”項(xiàng)下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣0.5μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.84×103+1.35×103，r2= 0.9999，三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4.2 精密度試驗(yàn)

HPLC方法：取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時(shí)間的RSD為15.21min，峰面積的RSD為0.20%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

UPLC方法：取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時(shí)間的RSD為1.12min，峰面積的RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取濃度為20.0μg/mL的標(biāo)液，照“3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶測(cè)定三聚氰胺的含量，HPLC和UPLC的RSD分別 0.58%、0.44%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

HPLC方法：取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，分別于0，2，4，8，10，12，24h注入HPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.66%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

UPLC方法：取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，分別于0，2，4，8，10，12，24h注入U(xiǎn)PLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液做加標(biāo)回收試驗(yàn)，取六個(gè)平行樣，分別加入定量三聚氰胺對(duì)照品，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定回收率，結(jié)果見表1。

3.4.6 樣品含量的測(cè)定

取不同品牌不同批次的乳制品20批，分別按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并分別按照HPLC和UPLC色譜檢測(cè)條件，測(cè)定其中三聚氰胺的含量，用外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果表明HPLC和UPLC均未檢出三聚氰胺，見圖2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比HPLC和UPLC法對(duì)乳制品中三聚氰胺含量的測(cè)定結(jié)果表明，兩種方法的精密度、準(zhǔn)確性等方面的差異不大，但在靈敏度方面UPLC明顯高于HPLC，并且UPLC還具有分析時(shí)間短，流動(dòng)相消耗量低的優(yōu)點(diǎn)，而在對(duì)乳制品的實(shí)際檢驗(yàn)中，UPLC更能顯現(xiàn)出環(huán)保、高效的優(yōu)點(diǎn)，可以在對(duì)市面流通乳制品質(zhì)量的控制中得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1].王延吉.有機(jī)化工原料[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004

[2].王箴.化工辭典（第四版）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[3].杜偉.三聚氰胺檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜質(zhì)，2009，19（1）：236-239.

[4].蘇敏，楊娟，姚志楊，張學(xué)軍，等.乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，22（6）：66-68.

[5].GB/T22388-2008.原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法[S].

作者簡(jiǎn)介：馮小麗（1988—），女，陜西延安人，本科，助理工程師，主要從事食品檢測(cè)工作。