右美托咪定聯(lián)合亞低溫處理對膿毒癥模型大鼠肺組織中HMGB1、TLR4及Trem—1水平的影響

黎仕煥 李繁 黃奕第

摘 要 目的：探討右美托咪定聯(lián)合亞低溫處理對膿毒癥模型大鼠肺組織中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll樣受體4（TLR4）及髓樣細胞觸發(fā)受體1（Trem-1）水平的影響。方法：采用隨機數(shù)字表法將100只SD大鼠分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、右美托咪定組（2 μg/kg）、亞低溫組（生理鹽水+全身噴灑涼水致肛溫32～35 ℃）和聯(lián)合組（右美托咪定2 μg/kg+全身噴灑涼水致肛溫32～35 ℃），每組20只。除假手術組行假手術外，其余各組大鼠復制膿毒癥模型，結扎切開后頸靜脈泵入相應藥物及維持相應體溫。術后6 h采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血漿中白細胞介素1（IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度；稱質量計算肺濕質量/干質量比（W/D）；采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理切片，并進行肺損傷評分；采用免疫比濁法測定肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，采用Western blot法測定肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠血漿中IL-1、IL-6、TNF-α濃度，W/D，肺損傷評分，肺組織中MPO活性和HMGB1、TLR4、Trem-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；肺組織切片顯示，肺泡壁明顯增厚，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，血管明顯擴張、充血。與模型組比較，右美托咪定組、亞低溫組和聯(lián)合組大鼠上述指標均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；肺組織病理改變程度明顯減輕。與右美托咪定組、亞低溫組比較，聯(lián)合組大鼠上述指標降低程度更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；肺泡壁增厚和炎性細胞浸潤明顯減輕，血管未出現(xiàn)擴張、充血。結論：右美托咪定聯(lián)合亞低溫處理可明顯改善膿毒癥模型大鼠肺損傷，下調(diào)肺組織中HMGB1、TLR4、Trem-1蛋白表達，且聯(lián)合處理改善效果優(yōu)于單獨處理。

關鍵詞 右美托咪定；亞低溫；膿毒癥；大鼠；高遷移率族蛋白B1；Toll樣受體4；髓樣細胞觸發(fā)受體1

Effects of Dexmedetomidine Combined with Mild Hypothermia on the Levels of HMGB1， TLR4 and Trem-1 in Lung Tissues of Sepsis Model Rats

LI Shihuan1，LI Fan1，HUANG Yidi2（1.Dept. of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570311， China；2.Dept. of Anatomy， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of dexmedetomidine combined with mild hypothermia on the levels of High mobility group box 1 protein （HMGB1）， Toll like receptor 4 （TLR4） and Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 （Trem-1） in lung tissues of sepsis model rats. METHODS： Totally 100 SD rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， dexmedetomidine group （2 μg/kg）， mild hypothermia group （normal saline+anal temperature 32-35 ℃ caused by whole body spraying of cold water） and combination group （dexmedetomidine 2 μg/kg+anal temperature 32-35 ℃ caused by whole body spraying of cold water）， with 20 rats in each group. Except that sham operation group received sham operation， sepsis model was induced in other groups. After ligation and incision， the corresponding drugs were pumped into the jugular vein and the corresponding body temperature was maintained. Plasma samples were collected 6 h after operation. Interleukin 1 （IL-1）， IL-6， tumor necrosis factor α （TNF-α） were determined by ELISA. The lung wet mass/dry mass ratio （W/D） was calculated by weighing the mass. Lung tissue sections were observed by HE staining， and lung injury scores were scored. The activity of MPO in lung tissue was determined by immunoturbidimetry. The expression of HMGB1，TLR4 and Trem-1 protein was determined by Western blot. RESULTS： Compared with sham operation group， the contents of IL-1， IL-6 and TNF-α， W/D， lung injury score， MPO activity， the protein expression of HMGB1， TLR4 and Trem-1 were increased significantly， with statistical significance （P<0.05）； lung tissue section showed that alveolar wall was obviously thickened； a large number of inflammatory cells infiltrated； blood vessels were obviously dilated and congested. Compared with model group， above indexes of rats in dexmedetomidine group， mild hypothermia group and combination group were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）； the degree of pathological changes in lung tissue was significantly reduced. Compared with dexmedetomidine group and mild hypothermia group， above indexes of combination group were decreased more significantly， with statistical significance （P<0.05）. Alveolar walls were thickened， inflammatory cell infiltration was relieved significantly and no vascular diatation and congestion was found. CONCLUSIONS： Dexmedetomidine combined with mild hypothermia can significantly improve lung injury in sepsis model rats， and down-regulate the protein expression of HMGB1， TLR4 and Trem-1. Therapeutic efficacy of combination therapy is better than single therapy.

KEYWORDS Dexmedetomidine； Mild hypothermia； Sepsis； Rats； High mobility group box 1 protein； Toll like receptor 4； Triggering receptor expressed on myeloid cells 1

膿毒癥是重癥監(jiān)護室中常見的疾病之一，主要是由革蘭氏陽性菌嚴重感染導致的全身炎癥反應所致。雖然目前新型抗菌藥物不斷出現(xiàn)，但仍無法有效降低膿毒癥的病死率[1]。由于目前膿毒癥發(fā)病機制仍未完全闡明，可能與免疫功能障礙、基因多態(tài)性、凝血功能異常、全身炎癥反應網(wǎng)絡、神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、氧代謝異常等密切相關[2]。因此單一的治療手段往往不能取得良好的治療效果。

右美托咪定作為α腎上腺素能受體激動藥，能夠降低肺部組織炎癥反應及氧化應激反應，發(fā)揮保護肺組織的作用[3]。已有研究報道，亞低溫處理在膿毒癥的治療中也對內(nèi)臟器官具有一定的保護作用[4]；右美托咪定與亞低溫聯(lián)用能降低體內(nèi)炎癥反應，增強對肺組織的保護作用[5]，但其作用機制尚不清楚。有研究表明，高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1 protein，HMGB1）、Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）及髓樣細胞觸發(fā)受體1（Triggering receptor expressed on myeloid cells 1，Trem-1）在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[6-8]。因此，本研究選取肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達水平為觀測指標，旨在探討右美托咪定聯(lián)合亞低溫處理對膿毒癥模型大鼠肺組織保護的效果及作用機制，以期指導臨床合理制訂治療膿毒癥的方案。

1 材料

1.1 儀器

HX300動物呼吸機、BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)（上海益聯(lián)科教設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸右美托咪定注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：17060532，規(guī)格：2 mL ∶ 200 μg）；白細胞介素1（IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20170052、20170057、20171203）；兔源HMGB1、TLR4、Trem-1、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab21546、ab17721、ab43298、ab31204）；抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（碧云天生物技術有限公司，批號：A0425）；髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（南京建成工程研究所，批號：20171215）。

1.3 動物

SPF級健康SD 大鼠100只，♂，體質量250～330 g，購自南京君科生物工程有限公司，實驗動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（蘇）2013-9871，本研究經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理會批準，動物處置符合動物倫理學標準。

2 方法

2.1 膿毒癥模型的復制

參考文獻[5]中彌慢性腹膜炎致膿毒癥模型的方法，取術前禁食12 h、但不禁水的大鼠，按40 mg/kg腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取仰臥位固定，氣管插管后連接動物呼吸機機械通氣，依據(jù)實驗鼠呼吸強度及頻率，對呼吸參數(shù)進行調(diào)整，以保證血壓和心率穩(wěn)定。切開右頸靜脈并置預留管。切開右頸動脈，連接生物機能實驗系統(tǒng)，記錄大鼠心電圖、平均動脈壓及心率，于腹部正中切開約為2 cm的切口，鈍性分離盲腸，于盲腸游離端1/3處進行結扎，并在遠端處行0.5 cm切口，按壓盲腸使糞便充溢腹腔，隨后將腸管回置于腹腔，注射5 mL生理鹽水后，輕晃大鼠身體，促使其產(chǎn)生彌漫性腹膜炎，隨后縫合腹部切口。

2.2 分組與給藥

取100只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、右美托咪定組、亞低溫組及聯(lián)合組，每組20只。假手術組大鼠行假手術，只開腹進行盲腸翻動卻不結扎切開，以1 mL/h流速頸靜脈泵入生理鹽水；模型組大鼠盲腸結扎切開后，以1 mL/h流速頸靜脈泵入生理鹽水；右美托咪定組大鼠盲腸結扎切開后，頸靜脈泵入2 μg/kg右美托咪定[5]； 亞低溫組大鼠盲腸結扎切開后，以1 mL/h流速頸靜脈泵入生理鹽水同時用物理降溫法誘導亞低溫，即造模后立即全身噴灑涼水（4 ℃），將體溫在30 min內(nèi)下降，且保持肛溫在32～35 ℃；聯(lián)合組大鼠操作方法分別參照右美托咪定組及亞低溫組，在泵入2 μg/kg右美托咪定后立即予以亞低溫操作。

2.3 檢測指標

2.3.1 血清生化指標 手術后6 h，各組隨機選取5只大鼠，采集腹主動脈血，肝素抗凝，4 ℃下4 000 r/min低溫離心10 min，取上清液進行測定。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定IL-1、IL-6、TNF-α濃度，操作步驟及數(shù)據(jù)處理參照相應的試劑盒說明書進行。

2.3.2 肺損傷指標 手術后6 h，在各組剩余15只大鼠中隨機取5只，除頭部以外其余部位均浸沒于75%乙醇中2～3 min，隨后于無菌操作臺上剝離胸腔皮膚及組織，暴露心臟，用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗右心室，取雙側肺組織，液氮處理后取相同位置的右肺上葉組織，剪碎，加入裂解液勻漿30 min后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，放入-80 ℃冰箱備用。①組織解凍后，用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液制成10%組織勻漿，與磷酸鈉緩沖液混勻后離心。沉淀物懸于磷酸鉀緩沖液中，采用比色法，嚴格按照試劑盒說明書操作測定MPO活性。②右肺中葉組織統(tǒng)一稱質量后放入錫紙在 65 ℃烤箱中烘烤24 h，再次稱質量，計算肺濕/干質量比（W/D）。③將剩余肺組織以30 cm H2O壓力將4%多聚甲醛灌注于支氣管中，結扎后再用4%多聚甲醛溶液固定2～3 h，隨后參照文獻[9]制成肺組織病理蘇木精-伊紅（HE）染色切片，觀察病理變化，并按文獻[10]進行肺損傷評分。

2.3.3 肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達 手術后6 h，從各組剩余10只大鼠中隨機取5只，取肺組織樣本，液氮處理后儲存在-80 ℃冰箱中。測定時現(xiàn)將組織剪碎，加入裂解液勻漿30 min后4 ℃、13 000 r/min離心。采用Western blot法對組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達量進行檢測。提取組織中總蛋白，定量電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上后，室溫孵育2 h，加入兔源HMGB1、TLR4、Trem-1、β-actin單克隆抗體（稀釋比例均為1 ∶ 2 000），4 ℃低溫過夜并用TBST緩沖液漂洗后加入抗兔IgG抗體（稀釋比例為1 ∶ 500），密閉孵育2 h，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色。用Scion Image軟件對蛋白條帶進行分析，以目標蛋白與內(nèi)參（β-actin）的比值進行定量分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間采用單因素方差分析比較，組間兩兩比較使用SNK檢驗。當P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 血清生化指標

與假手術組比較，其余各組大鼠的IL-1、IL-6、TNF-α濃度均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，右美托咪定組、亞低溫組和聯(lián)合組大鼠的IL-1、IL-6、TNF-α濃度均明顯降低（P<0.05）。與右美托咪定組或亞低溫組比較，聯(lián)合組大鼠的IL-1、IL-6、TNF-α濃度均明顯降低（P<0.05）。各組大鼠的IL-1、IL-6、TNF-α濃度測定結果見表1。

3.2 肺損傷情況

3.2.1 肺組織病理變化 假手術組大鼠肺泡結構完整，組織呈正常形態(tài)，未見炎性細胞浸潤及肺泡壁增厚；模型組大鼠肺泡壁明顯增厚，且出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，病理改變最為嚴重，血管明顯擴張、充血；右美托咪定組和亞低溫組大鼠可見肺泡壁輕度增厚，但炎性細胞浸潤較模型組降低，病理改變程度較模型組減輕，血管出現(xiàn)輕度擴張、充血；聯(lián)合組大鼠血管未出現(xiàn)擴張、充血，且肺泡壁輕度增厚及炎性細胞浸潤較模型組、右美托咪定組、亞低溫組降低，病理改變程度較模型組減輕。各組大鼠肺組織病理切片圖見圖1。

3.2.2 W/D、MPO活性、肺損傷評分 與假手術組比較，模型組、右美托咪定組和亞低溫組大鼠的W/D、MPO活性、肺損傷評分均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，右美托咪定組、亞低溫組和聯(lián)合組大鼠的W/D、MPO活性、肺損傷評分均明顯降低（P<0.05）。與右美托咪定組或亞低溫組比較，聯(lián)合組大鼠的W/D、MPO活性、肺損傷評分均明顯降低（P<0.05）。各組大鼠的W/D、MPO活性、肺損傷評分測定結果見表2。

3.3 肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達

與假手術組比較，其余各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，右美托咪定組、亞低溫組和聯(lián)合組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。與右美托咪定組或亞低溫組比較，聯(lián)合組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4及Trem-1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4、Trem-1蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表3。

4 討論

肺是膿毒癥時最易累及的器官，當膿毒癥發(fā)生時，肺損傷的發(fā)生幾率最高[11]。本研究中觀察各組大鼠肺組織病理切片顯示，模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯炎癥反應，肺泡壁增厚明顯，血管擴張充血嚴重。當發(fā)生膿毒癥時，肺泡巨噬細胞釋放IL-1、IL-6、TNF-α，通過促進多形核白細胞在肺組織中活化、積聚導致蛋白激酶、自由基等毒性物質釋放，引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征[12]。因此，控制膿毒癥病情擴散的重要手段就是降低體內(nèi)炎癥因子水平。對比假手術組與模型組大鼠肺組織中炎癥因子水平后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血漿中IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯升高，說明膿毒癥造模成功?？疾觳煌o藥組與模型組之間大鼠肺組織中炎癥因子水平后發(fā)現(xiàn)，亞低溫組、右美托咪定組及聯(lián)合組大鼠血漿中IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯降低，且聯(lián)合組大鼠血漿中IL-1、IL-6、TNF-α水平最低。提示亞低溫與右美托咪定聯(lián)合治療有助于降低體內(nèi)炎癥水平，緩解應激反應水平。

相關報道顯示，右美托咪定通過激活α受體發(fā)揮下調(diào)HMGB1表達量的作用[13]，亞低溫處理也具有下調(diào)HMGB1表達量的特點[14]，上述結果在本研究中也得到了相應證實。與模型組比較，右美托咪定組及亞低溫組大鼠肺組織中HMGB1表達量明顯降低（P<0.05）。由于TLR-4為HMGB1/TLR-4/核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路下游的因子，當體內(nèi)HMGB1與TLR-4結合后會激活NF-κB通路，進而促進炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）的釋放，因此使用右美托咪定或亞低溫處理后，大鼠肺組織中HMGB1受到抑制，進而下調(diào)通路中TLR-4水平，降低組織中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，從而降低體內(nèi)炎癥水平，保護肺組織。此外，研究中聯(lián)合組大鼠肺組織中HMGB1與TLR-4表達量明顯低于右美托咪定組、亞低溫組，提示亞低溫與右美托咪定聯(lián)合處理具有協(xié)同下調(diào)HMGB1與TLR-4表達量的作用。分析原因可能由于：（1）經(jīng)亞低溫處理后可通過抑制體內(nèi)炎癥反應與右美托咪定發(fā)揮協(xié)同作用[4]；（2）亞低溫處理能夠降低代謝率從而降低毒性物質釋放，發(fā)揮抑制HMGB1/TLR-4/NF-κB信號通路作用[14]。（3）右美托咪定的抗交感興奮及鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用能有效緩解低溫治療性寒戰(zhàn)，增強機體免疫能力，緩解亞低溫處理潛在的機體損傷。

此外，觀察各組大鼠肺組織中Trem-1水平后發(fā)現(xiàn)，使用右美托咪定組及亞低溫組大鼠肺組織中Trem-1表達量明顯低于模型組，這可能是由于右美托咪定具有抑制TREM-1/DAP12 炎癥信號通路激活的作用所致[16]。研究報道，當TREM-1/DAP12 炎癥信號通路受到抑制時，通路下游的IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放降低，發(fā)揮保護膿毒癥模型大鼠內(nèi)臟器官的作用，能有效提高大鼠生存率[17]。此外，Trem-1與TLR4在膿毒癥所致的炎癥反應放大過程中具有一定的協(xié)同作用，Trem-1分子的激活需要與TLR4配體結合實現(xiàn)，因此，當機體TLR4水平降低時，Trem-1分子水平也會隨之下調(diào)[18-19]。本研究結果顯示，與模型組比較，右美托咪定組、亞低溫組及聯(lián)合組大鼠肺組織中Trem-1水平均隨TLR4水平降低而降低。

綜上所述，右美托咪定聯(lián)合亞低溫處理可明顯改善膿毒癥模型大鼠肺損傷，下調(diào)肺組織中HMGB1、TLR4、Trem-1蛋白表達，且聯(lián)合處理改善效果優(yōu)于單獨處理。

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（收稿日期：2018-11-15 修回日期：2019-02-18）

（編輯：鄒麗娟）