高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶菌株的篩選及其生物學特性研究

袁海華 張保 張穎 敖新宇

摘?要：【目的】獲得高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶（LMLs，包括漆酶Lac、錳過氧化物酶MnP、木質(zhì)素過氧化物酶LiP）的菌株，為木腐菌菌種資源的合理開發(fā)和應用提供一定理論依據(jù)?！痉椒ā繉?株具有產(chǎn)LMLs能力的木腐菌進行產(chǎn)酶篩選，并對篩選出的菌株的生物學特性進行研究?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明：在9株木腐菌中，產(chǎn)LMLs能力較高的菌株分別為LS136（Lac：0.18 U·L-1、LiP：109.68 U·L-1、MnP：140.38 U·L-1）、LJ485（Lac：136.99 U·L-1、LiP：9.53 U·L-1、MnP：72.05 U·L-1）和LJ496（Lac：163.39 U·L-1、LiP：9.50 U·L-1、MnP：74.36 U·L-1）。生物學特性研究結(jié)果顯示3種菌株最適生長溫度均為25℃左右，適宜的生長pH值在4～8。此外，3種菌株對0～8 mmol·L-1的重金屬Cr3+、Pb2+以及0～4 mmol·L-1的Cu2+均有較強的耐受性。當Cr3+為1～4 mmol·L-1時，對LJ485和LJ496的生長具有一定的促進作用?！窘Y(jié)論】菌株LS136 、LJ485和LJ496分別屬于韌革菌屬Stereum sp.彩絨革蓋菌Trametes versicolor和小薄孔菌Antrodiella sp.，具有較強的產(chǎn)LMLs能力和一定的重金屬耐受性，為降解木質(zhì)素的菌株開發(fā)提供了菌種資源參考。

關(guān)鍵詞：木腐菌;木質(zhì)素降解酶;生物學特性

中圖分類號：Q 93文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-829-08

Abstract： 【Objective】To search for wood-rotting fungi that are highly effective in producing ligninolytic enzymes（ LMLs）， such asLac， MnP， and LiP. 【Methods】Nine strains of wood-rotting fungi with known ability to produce LMLs were screened and their biological characteristics studied. 【Results】The strains with high capacity of generating LMLs and their yields on each of the LMLs were found to be： LS136 （yielding Lac at 0.18 U·L-1， LiP at 109.68 U·L-1， and MnP at 140.38 U·L-1）， LJ485 （yielding Lac at 136.99 U·L-1， LiP at 9.53 U·L-1， and MnP at 72.05 U·L-1）， and LJ496 （yielding Lac at 163.39 U·L-1， LiP at 9.50 U·L-1， and MnP at 74.36 U·L-1）. The optimum growth temperature for the 3 fungal strains was approximately 25℃， and pH ranged 4 to 8.?The strains were all highly tolerant to Cr3+ or Pb2+ at concentrations of 0-8 mmoL·L-1 and Cu2+ at 0-4 mmoL·L-1. At the concentrations between 1-4 mmoL·L-1， Cr3+ promoted the growth of LJ485 and LJ496.?【Conclusion】 The identified LS136 was thought to be a Stereum ?sp.， LJ485 identified as Trametes versicolor， and LJ496 considered an Antrodiella sp.. They all demonstrated varying capacities of producing LMLs with a tolerance to heavy metals. The information would be useful for further investigation on the utilization of these lignin degrading fungi.

Key words：wood-rotting fungus; ligninolytic enzymes; biological characteristics

0?引言

【研究意義】在自然界中，參與木質(zhì)素降解的微生物包括細菌、真菌等，在這些微生物中，只有被稱為“白腐”的擔子菌類能夠有效解聚和礦化木質(zhì)素[1-2]。參與木質(zhì)素解聚的酶主要為催化非特異性反應的氧化酶類，大多數(shù)的白腐菌都能分泌胞外木質(zhì)素降解酶類，以及輔助降解酶類（如膠原氧化酶、過氧化氫產(chǎn)生酶）。在木質(zhì)素降解酶系中，主要的酶類有漆酶（Laccase， Lac）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase， LiP）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase， MnP）以及多功能過氧化物酶（Versatile peroxidase， VP）[3]。目前已經(jīng)報道并鑒定出數(shù)千種白腐菌，但其中只有十多種可以用來降解木質(zhì)素，這些真菌主要屬于栓菌屬Trametes、煙管菌屬Bjerkandera、平革菌屬Phanerochaete、側(cè)耳屬Pleurotus、香菇屬Lentinus和靈芝屬Ganoderm[4-5]?！厩叭搜芯窟M展】對白腐菌的產(chǎn)酶特性研究已有很多，如Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖（二糖）和單糖（葡萄糖）分別有助于菌株P(guān)hanerochaete chrysosporium 產(chǎn)生MnP和LiP，而多糖（纖維素）在整個研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)會抑制Phanerochaete chrysosporium LiP酶的產(chǎn)生。Janusz等[7]發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)物質(zhì)碳源和氮源缺乏的條件下，白腐菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的次生代謝途徑就會被激活。Galhaup等[8]向培養(yǎng)基中添加一定的Cu2+會促進Lac酶活提高。此外，由于白腐菌對木質(zhì)素的獨特降解效果，在農(nóng)業(yè)和部分工業(yè)的廢棄物處理中已有白腐菌的應用，如農(nóng)業(yè)廢棄物、制漿造紙工業(yè)、紡織工業(yè)等[9-11]。【本研究切入點】雖然白腐菌降解木質(zhì)素效果明顯，但能在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上應用的白腐菌資源還較少，其原因除了與菌株產(chǎn)酶種類和酶活力強弱有關(guān)外，還與菌株生長環(huán)境條件有關(guān)。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究在前期3種初篩結(jié)果（RB-亮藍染料培養(yǎng)基脫色法、鞣酸培養(yǎng)基顯色法和α-萘酚培養(yǎng)基顯色法）的基礎上，從云南省麗江市老君山自然保護區(qū)采集的82株木腐菌中初步篩選出了9株具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶（LMLs）能力的菌株，通過對該9株木腐菌進行LMLs酶活的測定，用以篩選獲得高產(chǎn)LMLs的菌株。再設置不同的培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)基pH值以及添加不同的重金屬等條件，研究高產(chǎn)LMLs的菌株在不同環(huán)境條件下的菌落生長情況，篩選具有高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶（LMLs）能力的菌株，為高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶菌株的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試菌株

菌株LS77多孔菌屬Polyporus sp.于2016年4月采自云南省麗江市老君山石頭鄉(xiāng);LS136韌革菌Stereum sp.、LS180靈芝屬Ganoderma sp.于2016年7月采自云南省麗江市老君山石頭鄉(xiāng);LJ367膠質(zhì)刺銀耳Pseudohydnum gelatinosum、LJ417（未鑒定出）、LJ460（未鑒定出）、LJ483褐褶孔菌屬Gloeophyllum sp.、LJ485彩絨革蓋菌Trametes versicolor、LJ496小薄孔菌Antrodiella sp.，均于2016年7月采自云南省麗江市老君山九河鄉(xiāng)。通過初篩以上供試菌株在RB-亮藍培養(yǎng)基、鞣酸培養(yǎng)基、α-萘酚培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生變色圈。

1.1.2?試驗試劑

無水葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、瓊脂、冰醋酸、醋酸鈉、乳酸、乳酸鈉、酒石酸鈉、酒石酸、硫酸錳、30%雙氧水、（CH3COO）2Cu·H2O、CrK（SO4）2·12H2O、Pb（CH3COO）2·3H2O、濃鹽酸、NaOH，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3?培養(yǎng)基

綜合PDA培養(yǎng)基（zPDA）：200 g土豆、20 g葡萄糖、3 g磷酸二氫鉀、1.5 g硫酸鎂、18 g瓊脂、0.05 g維生素B1、1 L蒸餾水，滅菌后取出并在無菌條件下用0.5 mol·L-1 HCl或0.5 mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)pH至7。

PD培養(yǎng)基：不添加瓊脂的zPDA培養(yǎng)基。

Cu2+培養(yǎng)基：稱取一定質(zhì)量的（CH3COO）2Cu·H2O分別置于5個裝有200 mL zPDA培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，分別配制成含有不同濃度（1、2、4、8、16 mmol·L-1）Cu2+的培養(yǎng)基，滅菌待用。

Cr3+培養(yǎng)基：稱取一定質(zhì)量的CrK（SO4）2·12H2O分別置于7個裝有200 mL zPDA培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，分別配制成含有不同濃度（0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1）Cr3+的培養(yǎng)基，滅菌待用。

Pb2+培養(yǎng)基：稱取一定質(zhì)量的Pb（CH3COO）2·3H2O分別置于6個裝有200 mL zPDA培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，分別配制成含有不同濃度（0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1）Pb2+的培養(yǎng)基，滅菌待用。

1.2?試驗方法

1.2.1?供試菌株的活化

將試管中的供試菌株接種于zPDA 培養(yǎng)基，25℃條件下培養(yǎng)至菌落長至2/3培養(yǎng)皿，備用。

1.2.2?菌株的酶活測定

（1）粗酶液的制備：

采用直徑為5 mm的打孔器取供試菌株的菌落外緣菌絲，接種于PD培養(yǎng)基，接種量為每個菌餅30 mL培養(yǎng)基，于25℃的恒溫搖床中培養(yǎng)21 d。每隔2 d取樣1次（10 mL）。發(fā)酵液在4℃條件下，4 000 r·min-1離心10 min，所得上清液即為待測粗酶液。

（2）酶活測定：

漆酶Lac活性[12-15]：在25℃條件下，移取0.5 mmol·L-1 ABTS測吸光度值的變化。以每分鐘1 μmol ABTS被轉(zhuǎn)化所需的酶量來表示1個Lac酶活力單位，消光系數(shù)為3.6×104 ?mol·L-1·cm-1。

錳過氧化物酶MnP活性[14]：在37℃條件下，分別加入1.8 mL 0.24 mol·L-1酒石酸緩沖液（pH 3.0）、24 mmol·L-1藜蘆醇0.1 mL、粗酶液1.0 mL，加入6 mmol·L-1過氧化氫0.1 mL后啟動反應，在310 nm處記錄吸光度值的變化。以每分鐘內(nèi)氧化1.0 μmol藜蘆醇所需酶量為一個LiP酶活力單位，消光系數(shù)為9.3×103 mol·L-1·cm-1。

木質(zhì)素過氧化物酶LiP活性[12]：向反應體系中加入0.11 mol·L-1乳酸鈉緩沖液（pH 4.5）1.8 mL、40 mmol·L-1硫酸錳溶液0.1 mL、粗酶液1.0 mL，預熱至37℃后加入1.6 mmol·L-1雙氧水0.1 mL啟動反應，在室溫條件下測定240 nm處吸光度值的改變。以每分鐘內(nèi)氧化1.0 μmol的Mn2+轉(zhuǎn)化成Mn3+所需酶量為一個MnP酶活力單位，消光系數(shù)為6.5×103 mol·L-1·cm-1。

1.2.3?生物學特性研究

（1）不同溫度、pH值對供試菌株生長的影響：

將篩選出的各菌株的菌餅分別接種于zPDA培養(yǎng)基上，于不同溫度（5、15、25、35、45、55℃）和不同pH值（3、4、5、6、7、8、9）條件下恒溫培養(yǎng)，采用十字交叉法，每隔1 d測量1次菌落直徑并記錄，直至其中一組長滿培養(yǎng)皿為止。

（2）不同重金屬離子對供試菌株的生長影響：

將篩選出的各菌株的菌餅分別接種于不同重金屬離子（Cu2+：1、2、4、8、16 mmol·L-1;Cr3+：0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1;Pb2+：0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1）的培養(yǎng)基上，于25℃條件下恒溫培養(yǎng)，采用十字交叉法，每隔1 d測量1次菌落直徑并記錄，直至其中一組長滿培養(yǎng)皿為止。

2?結(jié)果與分析

2.1?降解木質(zhì)素菌株的復篩結(jié)果

9株木腐菌在21 d內(nèi)的LMLs酶活變化結(jié)果如表1～3所示。

表1顯示：不同菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的Lac活力存在很大的差異。菌株LS136、LS180、LJ367以及LJ460在21 d內(nèi)都未檢測到Lac酶活或與其余5個菌株相比，Lac酶活力很低。在其余5株菌中，LS77與LJ483的酶活相對較低，分別在第18 d、6 d時達到最大酶活57.96 U·L-1、20.76 U·L-1;菌株LJ417在0～15 d內(nèi)，Lac酶活很低，其差異均不顯著（P>0.05），在15～21 d內(nèi)，隨著時間的增加，Lac的酶活迅速升高，在第21 d時，Lac酶活達到127.38 U·L-1與第18 d的Lac酶活值存在顯著差異（P<0.05）;菌株LJ485在0～12 d內(nèi)，隨著時間的增加，Lac酶活迅速升高，并在第12 d時達到最大值，最大酶活為136.99 U·L-1，在12～21 d內(nèi)，菌株LJ485的Lac酶活趨于穩(wěn)定，無顯著差異;菌株LJ496在0～9 d內(nèi)，隨著時間的增加，Lac酶活迅速升高，在9～15 d內(nèi)，隨著時間的增加，Lac酶活緩慢升高，并于15 d達到最大酶活163.39 U·L-1，但與第12 d的Lac酶活值（161.28 U·L-1）相比，其差異不顯著，因此，可認為在第12 d時達到最大酶活，隨著時間的繼續(xù)延長，菌株LJ496的Lac酶活開始緩慢下降。

菌株LS136在0～9 d內(nèi)，隨著時間的增加，其LiP酶活緩慢增加，在9～15 d內(nèi)，LiP酶活隨著時間的延長，出現(xiàn)迅速升高的現(xiàn)象，并于15 d達到最大酶活109.68 U·L-1，隨著時間的繼續(xù)增加，菌株LS136的LiP酶活迅速下降。與菌株LS136相比，其余8株菌的LiP酶活相對較低，其中LS77、LS180、LJ367、LJ485、LJ496在3～21 d內(nèi)均沒有顯著差異（P>0.05）。菌株LS136、LJ485、LJ496的MnP酶活均高于其余6株菌。其中菌株LS136的MnP酶活是最強的，其MnP酶活在前15 d內(nèi)酶活迅速升高，6～15 d內(nèi)無顯著差異，在第15 d時達最大值140.38 U·L-1，隨后MnP酶活開始下降;菌株LJ485的MnP酶活在前9 d內(nèi)迅速升高，在第9 d時達到最大值72.05 U·L-1，隨后MnP酶活開始緩慢下降;菌株LJ496在0～15 d內(nèi)，隨著時間的增加，MnP酶活不斷升高，并在15 d時達到最大酶活74.36 U·L-1，繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，其MnP酶活開始降低。

通過對9株木腐菌的LMLs活力測定結(jié)果表明：不同菌株所產(chǎn)生的LMLs活力具有較大差異;綜合3種酶活研究，從9個菌株中復篩選出產(chǎn)酶能力較好的菌株有LS136、LJ485和LJ496。

2.2?溫度對供試菌株生長的影響

在不同溫度條件下，將復篩的供試菌株分別接種于pH值7的zPDA培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，記錄不同供試菌株在不同時間下的生長情況，分別采用每種菌生長滿培養(yǎng)皿時所處時間點的數(shù)據(jù)制表，其結(jié)果見表2。由表2可知，菌株LS136、LJ485、LJ496在15～25℃條件下均能生長，此外，菌株LJ485在35℃條件下仍能緩慢生長，表明該菌株對環(huán)境溫度有一定的耐受性;在培養(yǎng)溫度為5～25℃，3株供試菌株的生長速度隨著培養(yǎng)溫度的升高而顯著加快（P<0.05），均在25℃達到最大。表明3種供試菌株對溫度較為敏感，且最適生長溫度均為25℃。此時的菌落生長速度依次為LJ485（15.00 mm·d-1）=LJ496（15.00 mm·d-1）>LS136（11.25 mm·d-1），在25～35℃內(nèi)，隨著環(huán)境溫度的增大，菌落生長速度顯著下降（P<0.05），且在該段溫度內(nèi)，菌落生長速度依次為LJ485>LJ496>LS136。

2.3?pH值對供試菌株生長的影響

在25℃條件下，將3種供試菌株分別接種于不同pH值的zPDA培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，記錄不同供試菌株在不同時間下的詳細生長情況，分別采用每種菌生長滿培養(yǎng)皿時所處時間點的數(shù)據(jù)制表，其結(jié)果見表3。

由表3可知，3個菌株表現(xiàn)出一定的廣譜性，在pH4～8的范圍內(nèi)均能生長，但不同菌株具有一定的差異性。在試驗pH值范圍內(nèi)，菌株LJ496是3種供試菌株里生長速度最快的，且在pH值為5～8時，始終保持穩(wěn)定的生長速度，無顯著性差異（P>0.05） ;菌株LJ485在pH值為3～6時，隨著pH值的增大，菌落生長速度顯著加快（P<0.05），于pH值為6時，達到最大值（13.8 mm·d-1），繼續(xù)增大pH值，菌落生長速度顯著下降（P<0.05）;菌株LS136在pH值為3～6時，隨著pH值的增大，菌落生長速度顯著加快（P<0.05），于pH值6～7內(nèi)趨于穩(wěn)定并無顯著差異（P>0.05），繼續(xù)增大pH值時，LS136菌落生長速度顯著下降（P<0.05）。結(jié)果表明，3種供試菌株具有較廣的pH適應范圍。

2.4?重金屬離子對供試菌株生長的影響

在pH值為7、溫度為25℃的培養(yǎng)條件下，將3種供試菌株分別接種于不同濃度的Cu2+、Cr3+、Pb2+培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，記錄不同供試菌株在不同時間的詳細生長情況，分別采用每種菌長滿培養(yǎng)皿時所處時間點的數(shù)據(jù)制表，其結(jié)果見表4～6。

由表4可知，在1～4 mmol·L-1的Cu2+濃度范圍內(nèi)，3種供試菌株均能生長，與8～16 mmol·L-1的濃度范圍內(nèi)的菌株生長速度有顯著差異（P<0.05）;在8～16 mmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，3種供試菌株均不能生長，無顯著差異（P>0.05）;在Cu2+濃度為1～8 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著濃度持續(xù)增高，3種供試菌株的生長速度都急速下降，且在該濃度范圍內(nèi)，菌落生長速度大小依次為：LJ496>LJ485>LS136;繼續(xù)增大Cu2+濃度，菌落生長速度不再變化。結(jié)果表明，3種供試菌株對Cu2+濃度較為敏感，耐受性較弱。

由表5可知，在0.25～16 mmol·L-1的Cr3+濃度范圍內(nèi)，供試菌株LS136和LJ496均能生長;在1～16 mmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，供試菌株LJ485也能生長;菌株LS136在0.25～2.00 mmol·L-1 的Cr3+濃度范圍內(nèi)，其生長速度較快并無顯著差異（P>0.05），隨著濃度增高，生長速度顯著降低（P<0.05）。在0.25～4.00 mmol·L-1的Cr3+濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，菌株LJ485、LJ496的生長速度緩慢提高，在4 mmol·L-1的Cr3+濃度下，其生長速度增加達到最大值（分別為13.5、15.0 mm·d-1），濃度繼續(xù)增加濃度，其生長速度均顯著下降（P<0.05）;結(jié)果表明，一定濃度下的Cr3+能夠促進菌株LJ485和菌株LJ496的生長，3種供試菌株對Cr3+濃度均不敏感，耐受性較強。

由表6可知，菌株LS136和菌株LJ485在所選的Pb2+試驗濃度范圍內(nèi)均能生長，其中菌株LS136在0.5～4 mmol·L-1 Pb2+濃度范圍內(nèi)的生長速度顯著較高（P<0.05），菌株LJ485在1 mmol·L-1 Pb2+條件下的生長速度顯著比其余濃度條件下的生長速度大（P<0.05）;菌株LJ496在0.5～8.0 mmol·L-1 的Pb2+濃度范圍內(nèi)能夠持續(xù)生長，但在16 mmol·L-1的Pb2+上無法生長。此外菌株LJ496在0.5～2.0 mmol·L-1 Pb2+濃度范圍內(nèi)的生長速度顯著高于4～16 mmol·L-1 Pb2+濃度范圍內(nèi)的生長速度（P<0.05）。在Pb2+的試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，3種供試菌株的生長速度均出現(xiàn)顯著下降趨勢（P<0.05）;在Pb2+濃度為0.5～8.0 mmol·L-1時，菌落生長速度大小依次為：LJ496>LJ485>LS136，繼續(xù)增大濃度時，菌落生長速度大小變?yōu)椋篖J485>LS136>LJ496。研究結(jié)果表明，3種供試菌株對Pb2+的耐受性均較強，且菌株LJ496對Pb2+的抗性比另外2株較弱。

3?討?論

菌株LS136屬于韌革菌屬Stereum sp.，其產(chǎn)Lac能力很弱，但具有較強的產(chǎn)LiP和MnP能力。菌株LJ485和LJ496分別屬于彩絨革蓋菌Trametes versicolor和小薄孔菌Antrodiella sp.，但是具有相似的產(chǎn)酶能力，均能產(chǎn)Lac和MnP，且酶活大小相近。這些結(jié)果表明，不同的菌株產(chǎn)LMLs的種類可能存在差異，產(chǎn)LMLs能力相似的菌株也可能來源于不同屬。其原因除了可能與菌株攜帶的遺傳信息相關(guān)外，還可能與環(huán)境中的誘導因子相關(guān)。此外，Lac、LiP和MnP分別屬于不同系列的同工酶，故LJ485和LJ496所產(chǎn)的LMLs是否相同還有待進一步研究。由于木質(zhì)素的天然降解過程是由多種菌參與完成，因此，在后續(xù)研究中可以嘗試將3種菌株進行組合，彌補不同菌株產(chǎn)不同LMLs能力的差異，研究組合后的復合菌系的產(chǎn)酶能力強弱及其對木質(zhì)素的降解效果。此外，在已報道的國內(nèi)外高效木質(zhì)素降解菌中，關(guān)于小薄孔菌屬的報道非常稀少，而本研究中篩選出的小薄孔菌屬具有較強的產(chǎn)LMLs能力，為降解木質(zhì)素的菌株開發(fā)提供了菌種資源。

目前，通過利用白腐菌對多環(huán)芳烴（PAHs）類污染物的降解研究已有很多，但是很少有研究關(guān)注環(huán)境中的影響因素對菌株生長的影響。當環(huán)境中同時存在多種的污染物時，如：工業(yè)設施和公路附近的污染土壤中常伴有高濃度的重金屬離子存在[16]，這在利用白腐菌進行環(huán)境生物修復時是不可忽視的影響因素。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，重金屬鎘Cd、銅Cu、汞Hg不僅對土壤微生物群落有影響，同時對白腐菌也具有一定的毒性，會影響白腐菌的生長[17-18]。因此，在對白腐菌進行生物降解研究的同時，探索環(huán)境因子對白腐菌的生長影響具有重要意義。本研究通過對高產(chǎn)LMLs的3種菌株進行生物學特性研究，發(fā)現(xiàn)溫度對3種菌株的生長影響較大，酸堿度次之，不同的重金屬離子對3種菌的影響也不同，其中，一定濃度條件下的Cr3+對菌株LJ485和LJ496具有促進生長速度的作用，其原因有待進一步研究。

4?結(jié)?論

通過對9株木腐菌的3種LMLs酶活測定，結(jié)果顯示產(chǎn)酶能力較強的菌株有LS136、LJ485和LJ496。通過設置不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值和不同濃度的重金屬（Cu2+、Cr3+、Pb2+）培養(yǎng)基，記錄3種高產(chǎn)LMLs菌株（LS136、LJ485和LJ496）的菌落生長速度影響，結(jié)果顯示3種供試菌株最適生長溫度均為25℃左右，最適生長pH值為4～8;在試驗濃度范圍內(nèi)，3種菌株對Cr3+、Cu2+、Pb2+均有較強的耐受性，其中對Cu2+的耐受性較弱;此外，Cr3+在1～4 mmol·L-1一定濃度范圍內(nèi)，對LJ485和LJ496的生長具有一定的促進作用。

參考文獻：

[1]MILLATI R， SYAMSIAH S， NIKLASSON C， et al. Biological pretreatment of lignocelluloses with white-rot fungi and its applications：a review[J]. BioResources， 2011， 6（4）：5224-5259.

[2]GUILLN F， MARTNEZ M J， GUTIRREZ A， et al. Biodegradation of lignocellu-losics：microbial， chemical， and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin[J]. International Microbiology， 2005， 8：195-204.

[3]WONG D W S. Structure and action mechanism of ligninolytic enzymes[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2009， 157（2）：174-209.

[4]D′SOUZA T M， MERRITT C S， REDDY C A. Lignin-modifying enzymes of the white rot basidiomycete Ganoderma lucidum[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1999， 65（12）：5307-5313.

[5]ADASKAVEG J E， GILBERTSON R L， BLANCHETTE R A. Comparative studies of delignification caused by Ganoderma species[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1990， 56（6）：1932-1943.

[6]WANG F， AI M， YANG G， et al. Influence of Carbon Source on the Production of Extracellular Ligninolytic Enzymes by Phanerochaete chrysosporium[J]. BioResources， 2016， 11（3）：5676-5686.

[7]JANUSZ G， KUCHARZYK K H， PAWLIK A， et al. Fungal laccase， manganese peroxidase and lignin peroxidase：gene expression and regulation[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2013， 52（1）：1-12.

[8]GALHAUP C， HALTRICH D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2001， 56（1-2）：225-232.

[9]SELINHEIMO E， KRUUS K， BUCHERT J， et al. Effects of laccase， xylanase and their combination on the rheological properties of wheat doughs[J]. Journal of Cereal Science， 2006， 43（2）：152-159.

[10]BAJPAI P. Application of enzymes in the pulp and paper industry[J]. Biotechnology Progress， 1999， 15（2）：147-157.

[11]JEBAPRIYA G R， GNANADOSS J J. Bioremediation of textile dye using white rot fungi：A review[J].International Journal of Current Research and Review， 2013， 5（3）：1-13.

[12]GAI Y P， ZHANG W T， MU Z M， et al. Involvement of ligninolytic enzymes in degradation of wheat straw by Trametes trogii[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（1）：85-95.

[13]ZOUARI-MECHICHI H， MECHICHI T， DHOUIB A， et al. Laccase purification and characterization from Trametes trogii isolated in Tunisia：decolorization of textile dyes by the purified enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2006， 39（1）：141-148.

[14]TIEN M， KIRK T K. Lignin Peroxidase of Phanerochaete Chrysosporium[M]. Methods in enzymology. Academic Press， 1988， 161：238-249.

[15]MURUGESAN K， NAM I H， KIM Y M， et al. Decolorization of reactive dyes by a thermostable laccase produced by Ganoderma lucidum in solid state culture[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2007， 40（7）：1662-1672.

[16]MARCEL KOELEMAN，WILLEM JANSSEN vd LAAK，HANNAH IETSWAART. Dispersion of PAH and heavy metals along motorways in the Netherlands-an overview[J]. Science of the Total Environment，1999，235（1）：347-349.

[17]BALDRIAN P， GABRIEL J. Effect of heavy metals on the growth of selected wood-rotting basidiomycetes[J]. Folia Microbiologica， 1997， 42（5）：521-523.

[18]MANDAL T K， BALDRIAN P， GABRIEL J， et al. Effect of mercury on the growth of wood-rotting basidiomycetes Pleurotus ostreatus， Pycnoporus cinnabarinus and Serpula lacrymans[J]. Chemosphere， 1998， 36（3）：435-440.

（責任編輯：張?梅）