一株鐵皮石斛內(nèi)生真菌的鑒定及對株型的影響

王偉英 邱珊蓮 鄒暉 戴藝民 林江波

摘?要：【目的】對連城冠豸山上生長較好的野生鐵皮石斛進行內(nèi)生真菌的分離，以獲得具有促生效果的菌株，為進一步研究瘤菌根菌屬與鐵皮石斛共生關(guān)系奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉⑦B城冠豸山野生鐵皮石斛根進行消毒后在PDA培養(yǎng)基上，對長出的內(nèi)生真菌分離純化，將一株純化菌株標記為T11，并通過形態(tài)特征與5.8SrDNA-ITS分子生物學(xué)方法進行鑒定，并將T11菌株接入液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)7 d，成菌液后澆灌無菌石斛盆栽苗進行共培養(yǎng)6個月，觀察石斛株型的變化?！窘Y(jié)果】PDA平板上培養(yǎng)的T11菌株的菌落乳白色，形成同心環(huán)，菌絲細胞為雙核，有隔，含有橢圓形念珠狀細胞，即從形態(tài)特征初步鑒定為瘤菌根菌屬Epulorhiza sp.，為無性態(tài)的膠膜菌Tulasnella calospora。以提取 T11菌株 DNA 為模板進行5.8SrDNA-ITS 序列擴增，擴增產(chǎn)物片段長度為630 bp，通過序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，T11與大花蕙蘭植物菌根真菌膠膜菌聚類在同一分支，親緣關(guān)系最為相近，其同源性達到99%。接菌后的石斛苗長勢較好，其株高、葉片數(shù)和葉寬都顯著增加?！窘Y(jié)論】從形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定得出T11菌株為蘭科菌根真菌擔子菌的瘤菌根菌屬，瘤菌根菌能促進鐵皮石斛苗的生長。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;內(nèi)生真菌;5.8SrDNA-ITS

中圖分類號：R 282文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-837-05

Abstract： 【Objective】An endophytic fungus from its symbiotic Dendrobium officinale plant was identified and studied for its effect on the morphology of the host. 【Method】The fungus was isolated from the disinfected roots of a wild D. officinale plant grown on top of Mt. Guanzhai in Liancheng county. It was further purified on a PDA medium and labeled as T11 to be identified by morphological and 5.8 SrDNA-ITS molecular biological methods. After a 7 d-culture in a shaking flask， the inoculated liquid was added to the aseptically potted seedlings of D. officinale. Growth of the seedlings was observed for 6 months. 【Result】 The milky white T11 colonies on the PDA plate had concentric rings on them. The T11 mycelial cells were binucleate， septate， and elliptical in shape. It was preliminarily identified as an Epulorhiza sp.， an asexual plastic film fungus of Tulasnella calospora. Subsequently， the 5.8SrDNA-ITS sequence amplified from the DNA extracted from T11 as template showed the PCR fragment to be 630bp in length. The sequence alignment and phylogenetic tree clustered T11 in the same branch as the T. calospora of Cymbidium， with a 99% genetic homology. With the T11 inoculation， the D. officinale seedlings grew well with significantly increased plant height， leaf count， and leaf width. 【Conclusion】The morphological and molecular biological characteristics of T11 indicated it to be an Epulorhiza sp.， the Basidiomycetes of orchidaceae mycorrhizal fungi， which is known to enhance the growth of D. officinale.

Key words：Dendrobium officinale; endophytic fungus; 5.8 SrDNA-ITS.

0?引言

【研究意義】鐵皮石斛Dendrobium officinale是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其經(jīng)濟價值和藥用價值頗高，具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血壓等功效。鐵皮石斛是一種典型的內(nèi)生菌根植物，需要與合適的真菌共生才能完成其生活史[1]。內(nèi)生真菌在鐵皮石斛的人工栽培、引種馴化以及資源再生和保護等方面具有重要的作用。

【前人研究進展】蘭科菌根系統(tǒng)中存在多種內(nèi)生真菌類型，主要屬擔子菌門、半知菌門和子囊菌門[2]，其中擔子菌類真菌為優(yōu)勢菌群。擔子菌膠膜菌科中的無性態(tài)屬瘤菌根菌屬Epulorhiza sp.以及瘤菌根菌屬的有性態(tài)膠膜菌屬Tulasnella是蘭科植物的主要共生真菌[3]。菌根真菌參與蘭科植物生長發(fā)育過程，主要表現(xiàn)為在自然條件下種子萌發(fā)、植株營養(yǎng)生長、生殖繁育均需與真菌共生形成菌根來提供必需的有機質(zhì)和碳水化合物[4-6]。

【本研究切入點】連城冠豸山鐵皮石斛是我國第二個獲得地理標志的石斛品種，其品質(zhì)較好。近年來由于過度采摘導(dǎo)致冠豸山野生鐵皮石斛瀕臨滅絕，因此對冠豸山的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌群研究就顯得尤為重要。了解連城冠豸山鐵皮石斛的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群，對冠豸山鐵皮石斛的保護和人工栽培，以及保持其內(nèi)生真菌資源多樣性具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從連城冠豸山長勢較好的野生鐵皮石斛根部分離到一株內(nèi)生真菌T11，通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)方法進行鑒定，并測試T11對盆栽組培苗生長的影響，以期為研究內(nèi)生真菌與鐵皮石斛產(chǎn)量、品質(zhì)之間的相關(guān)性提供思路。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試材料為冠豸山野生鐵皮石斛，接菌試驗所用石斛苗為冠豸山野生鐵皮石斛種苗。

1.2?試驗方法

1.2.1?石斛內(nèi)生真菌的分離與純化

剪取野生鐵皮石斛根，用自來水流水沖洗去除表面附著物，晾干表面水分。按常規(guī)無菌操作進行表面消毒：75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗1次，無菌濾紙吸干表面水分;0.1%升汞浸泡5 min，無菌水沖洗2次，無菌濾紙吸干表面水分。在超凈臺上切成約1 cm長的小段，接入PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3～7 d。挑取切口處新長出的菌絲尖端，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)3～5代后獲得純菌株。

1.2.2?石斛內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定

挑取已分離純化的T11 的新生菌絲，接種到 PDA 平板中央，倒置于 28℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并記錄其菌落大小、顏色、邊緣菌絲形態(tài)及是否產(chǎn)生色素等特征。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)特征對分離菌株進行初步鑒定。菌種標本保藏于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所。

1.2.3?石斛內(nèi)生真菌的分子鑒定

采用CTAB法提取內(nèi)生真菌基因組DNA。采用真菌ITS 序列通用引物ITS1 （5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′） 和 ITS4 （5′-T-CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3′）來擴增5.8S rDNA-ITS基因片段。PCR擴增條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片斷，檢驗產(chǎn)物膠回收情況。將PCR膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選單克隆進行擴繁，對單克隆進行PCR驗證，挑選陽性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測得的 ITS 序列通過 BLAST 軟件進行同源序列比較。

1.2.4?石斛盆栽苗的準備

泥炭土高溫滅菌后裝入未使用過的花盆，將鐵皮石斛組培苗種在花盆中，每盆種3叢，每叢3株石斛苗，培育半年后接菌。

1.2.5?菌液培育與接菌處理

配制液體PDA培養(yǎng)液，接入瘤菌根菌，放入搖床，180 r·min-1、28℃，震蕩培育7 d后用粉碎機攪碎大塊菌絲至均勻，用5 mL移液槍將菌液接種在石斛的根基部，每叢分3點各接5 mL，接12盆。接菌的為處理組，未接菌的為對照組。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

基本特征：菌絲細胞為雙核。在PDA培養(yǎng)基上菌落表面光滑，邊緣整齊，厚薄均勻，無氣生菌絲，菌落乳白色，形成同心環(huán)，具有香味（圖1-A）。菌絲培養(yǎng)7 d，平均生長速度為0.12～0.14 mm·h-1，菌絲具有直角或者銳角分枝，有隔，含有橢圓形念珠狀細胞，念珠狀細胞鏈一般5個細胞（圖1-B）。按照《真菌鑒定手冊》[7]初步認為T11為瘤菌根菌屬Epulorhiza sp.菌株。

2.2?菌株的分子鑒定

以提取 T11菌株 DNA 為模板進行 ITS 序列擴增，PCR電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物在630 bp左右的位置有清晰條帶（圖2）。對PCR產(chǎn)物進行測序，并將所得核心片段序列（圖3）提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）進行Blast比對，選取GenBank中與T11的ITS序列同源性高的系列菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，與T11相似性較高的序列主要分布在膠膜菌屬。由圖4可見，T11與大花蕙蘭植物菌根真菌膠膜菌Tulasnella calospora（EF393621.1）聚類在同一分支，親緣關(guān)系最為相近，其同源性達到99%。而膠膜菌真菌對應(yīng)的無性態(tài)即為瘤菌根菌，故可判斷該菌株為瘤菌根菌屬Epulorhiza sp.。

2.3?T11對鐵皮石斛的株型的影響

隨機選取各12盤進行試驗，接菌前在株型上沒有明顯差別（圖5-A）;石斛苗在接菌共培養(yǎng)3個月后，接菌處理的植株生長較快，其株高、葉片數(shù)都與對照的差異極顯著，但葉片寬度上沒有明顯差別（圖5-B）;共培養(yǎng)6個月后，接菌植株生長速度較快（圖5-C）。由表1可知，3個月株高增加了5.96 cm，而對照只增加了2.68 cm，差異極顯著。植株長高后的葉片數(shù)也相應(yīng)增多，接菌植株的葉片數(shù)與對照的葉片數(shù)差異極顯著。葉片寬度變化不大，在3個月時接菌植株與對照的葉寬無明顯差異，6個月時接菌植株的葉片寬度大于對照的寬度。試驗表明澆灌瘤菌根菌能促進鐵皮石斛植株的生長，有效促進了植株高度、葉片數(shù)和葉寬的增加，說明瘤菌根菌具有促生作用。

3?討?論

目前鑒定未知菌主要是根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子鑒定的手段來確定，分子鑒定對內(nèi)生真菌鑒定最有效的方法是對ITS-rDNA序列片段進行分析[8-10]。本研究中的T11真菌形態(tài)學(xué)特征符合瘤菌根菌屬的真菌形態(tài)學(xué)特征，經(jīng)誘導(dǎo)未見產(chǎn)孢，為無性型屬。通過ITS-rDNA序列比對并構(gòu)建進化樹表明，T11菌株與大花蕙蘭植物菌根真菌膠膜菌屬親緣關(guān)系最近，而膠膜菌屬是瘤菌根菌屬的有性態(tài)[5]，因此確定本研究中的T11菌株為瘤菌根菌屬。

瘤菌根菌屬存在于多種蘭科植物中，在石斛的生長發(fā)育中起著重要的作用。本研究通過接瘤菌根菌于石斛盆栽苗后，從表型觀察可以得出瘤菌根菌可促進鐵皮石斛的生長，使植株的株高、葉片數(shù)和葉寬都有顯著增加，這與朱鑫敏[11]研究結(jié)果一致，其研究得出接瘤菌根菌可極大地促進鐵皮石斛組培苗的生長。內(nèi)生真菌促進植物生長的原因可能是菌根真菌一定程度上影響了植物的調(diào)控系統(tǒng)，使光合作用增強，物質(zhì)代謝加快[12-13]。也可能是內(nèi)生真菌與植物根系形成共生關(guān)系后促進了根系對物質(zhì)的吸收[14-15]。

鑒于鐵皮石斛是我國珍稀瀕危的藥材品種，本研究分離鑒定鐵皮石斛的內(nèi)生真菌，不僅豐富了鐵皮石斛的內(nèi)生真菌的種類資源，對揭示連城鐵皮石斛道地性形成的因素提供了研究方向，也為今后進一步揭示內(nèi)生真菌對鐵皮石斛的抗性和營養(yǎng)成分等的影響奠定基礎(chǔ)，對規(guī)?；斯ぴ耘嗪唾|(zhì)量控制都有著重大意義。

參考文獻：

[1]宋爭.石斛與美孢膠膜菌共生關(guān)系研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2017.

SONG Z. Research on Symbiotic Relationship of ?Dendrobium sp. and ?Tulasnella calospora[D].Beijing：Chinese Academy of Forestry，2017.（in Chinese）

[2]張輯.中國蘭屬植物內(nèi)生菌多樣性研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2012.

ZHANG J.Study on the diversity of endophytic bacteria of orchid in China[D].Beijing：Chinese Academy of Forestry，2012.（in Chinese）

[3]許璐， 田佳妮， 王濤，等. 膠膜菌屬真菌與蘭科植物的共生體系建立[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2017， 31（5）：876-883.

XU L， TIAN J N，WANG T，et al.Symbiosis Established Between Orchid and Tulasnella spp.Fungi[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2017，31（5）：0876-0883.（in Chinese）

[4]吳慧鳳，宋希強，劉紅霞.鐵皮石斛種子的室內(nèi)共生萌發(fā)[J].生態(tài)學(xué)報，2012，32（8）：2491-2497.

WU H F， SONG X Q， LIU H X.Ex～situ symbiotic seed germination of Dendrobium catenatum[J]. Acta Ecologica Sinica，2012，32（8）：2491-2497.（in Chinese）

[5]ARDITTI J， GHANI A K A. Tansley review no. 110.?Numerical and physical properties of orchid seeds and their biological implications[J]. New Phytologist， 2010， 145（3）：367-421.

[6]RASMUSSEN H N，RASMUSSEN F N.Orchid mycorrhiza：implications of a mycophagous life style[J].Oikos，2009，118（3）：334-345.

[7]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

WEI J C.Fungal Identification Manual[M].Shanghai：Shanghai science and technology press，1979.（in Chinese）

[8]王芝娜，李杰，張銀杰.中國蘭屬植物菌根真菌的rDNA ITS分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2013， 41（4）：191-196.

WANG Z N，LI J，ZHANG Y J.rDNA ITS analysis of mycorrhizal fungi of genus cymbidium from China[J]. Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edtion），2013， 41（4）：191-196.（in Chinese）

[9]李潞濱，胡陶，唐征，等.我國部分蘭屬植物菌根真菌rDNA ITS序列分析[J].林業(yè)科學(xué)， 2008， 44（2）：160-164.

LI L B，HU T，TANG Z，et al. rDNA ITS analysis of of mycorrhizal fungi in cymbidium platnts[J].Forestry Science，

2008， 44（2）：160-164.（in Chinese）

[10]王倩. 蘭科菌根真菌的分離鑒定及其與中國蘭屬植物共生關(guān)系的研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

WANG Q.Study on isolation and identification of orchid mycorrhizal fungi and the symbiotic relationship between mycorrhizal fungi and cymbidium[D].Baoding：hebei agricultural university， 2010.（in Chinese）

[11]朱鑫敏，胡虹，李樹云，等.內(nèi)生真菌與兩種兜蘭共培養(yǎng)過程中的相互作用[J].植物分類與資源學(xué)報，2012，34（2）：171-178.

ZHU X M， HU H， LI S Y，et al.Interaction between Endophytic Fungi and Seedlings of Two Species of Paphiopedilum during Symbiotic Culture[J].Plant Diversity and Resources，2012，34（2）：171-178.（in Chinese）

[12]高川，郭順星，張靖，等.福建金線蓮與菌根真菌互作過程中的蛋白組研究[J].中國中藥雜志，2012， 37（24）：3717-3722.

GAO C，GUO S X，ZHANG J，et al.Proteome analysis on interaction between Anoectochilus roxburghii and Mycorrhizal fungus[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2012， 37（24）：3717-3722.（in Chinese）

[13]喻靜，蔣海俠，張保錢，等.兩株鐵皮石斛內(nèi)生真菌對組培苗和原球莖生長的影響[J].植物病理學(xué)報， 2017， 47（4）：541-550.

YU J，JIANG H X，ZHANG B Q，et al.Characterization of endophytic fungi from dendrobium officinale and study of their influence on growth of seedling and protocorm[J]. ， 2017， 47（4）：541-550.（in Chinese）

[14]吳靜萍，錢吉，鄭師章.蘭花菌根菌分泌物成分的初步分析[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2002， 13（7）：845-848.

WU J P，QIAN J，ZHENG S Z.A preliminary study on ingredient of secretion from fungi of orchid mycorrhiza[J].Journal of applied ecology，2002， 13（7）：845-848.（in Chinese）

[15]金輝，許忠祥，陳金花，等.鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用[J]. 植物生態(tài)學(xué)報， 2009， 33（3）：433-441.

JIN H，XU Z X，CHEN J H，et al.Inter raction between tissue-cultured seedings of dendrobium officinale and mycorrhizal fungus（epulorhiza sp.）during symbiotic culture[J].Journal of Plant Ecology，2009，33（3）：433-441.（in Chinese）

（責任編輯：林海清）