辣木葉乙醇提取物對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠模型血脂和氧化應(yīng)激影響的研究

戴麗芬 陸艷華 張曼 田福璐

摘 要： 該研究以低劑量（5 mg·kg-1）、中劑量（30 mg·kg-1）和高劑量（60 mg·kg-1）的辣木葉乙醇提取物（EE-MO）干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠動(dòng)物模型。結(jié)果表明：（1）高劑量的EE-MO顯著降低NAFLD小鼠的體重和肝濕重;EE-MO劑量依賴性地降低NAFLD小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量;高劑量的EE-MO除降低上述生化指標(biāo)外，還顯著降低血清中FFA含量。（2）HE和蘇丹紅Ⅲ染色發(fā)現(xiàn)，EE-MO處理后，模型組小鼠的肝脂肪病變和細(xì)胞損傷得到顯著改善。（3）EE-MO對(duì)NAFLD小鼠模型的血脂代謝具有改善作用。（4）高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟和血清的ROS和MDA的含量，誘導(dǎo)SOD、POD和CAT活性增加，降低GSH-Px活性。（5）低劑量、中劑量和高劑量的EE-MO依賴性地降低NAFLD小鼠肝臟和血清的ROS和MDA的含量，緩解氧化脅迫。（6）低劑量的EE-MO對(duì)SOD、POD、CAT和GSH-Px酶活性無(wú)顯著影響;中劑量和高劑量的EE-MO處理后，NAFLD小鼠的SOD、POD和CAT酶活性顯著下降，GSH-Px活性顯著增加;EE-MO可能通過(guò)GSH-Px抗氧化酶途徑緩解NAFLD小鼠的氧化脅迫。

關(guān)鍵詞： 辣木， 氧化應(yīng)急， 非酒精性脂肪肝， 血脂

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2019）07-0855-08

Abstract： Lower （5 mg·kg-1）， middle （30 mg·kg-1） and high （60 mg·kg-1） doses of ethanol extract of Moringa oleifera （EE-MO） leaves was used to interpose the high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） mice model. The results were as follows： （1） That oral administration of high dose EE-MO could significantly reduce body weight and wet liver weight of NAFLD mice; EE-MO treatment could decrease the TC， TG， HDL-C and LDL-C contents in serum of NAFLD mice in dose-dependant manner; Apart from decreasing the above parameters， high dose EE-MO treatment significantly reduced FFA content in serum of NAFLD mice. （2） HE and Sudan red Ⅲ staining showed that the fatty lesion and hepatocyte injury of NAFLD mice were improved by EE-MO treatment. （3） It was suggested that EE-MO treatment was capable of improving lipid metabolism of NAFLD mice. （4） High fat diet increased the contents of liver and serum ROS and MDA as well as the activities of SOD， POD and CAT. However， the GSH-Px activity was suppressed by high fat diet. （5） EE-MO treatment could decrease the ROS and MDA contents in liver and serum of NAFLD mice in dose-dependant manner. （6） Oral administration of low dose EE-MO exerted no effect on the activities of SOD， POD， CAT， and GSH-Px of NAFLD mice; However， oral administration of middle and high dose EE-MO significantly reduced the activities of SOD， POD and CAT， but increased the GSH-Px activity; It isuggested that the EE-MO treatment can alleviate the oxidative stress of NAFLD mice by regulating GSH-Px activity.

Key words： Moringa oleifera， oxidative stress， non-alcoholic fatty liver disease， blood fat

辣木（Moringa oleifera）為辣木科辣木屬植物，有“奇跡之樹(shù)”的美稱(chēng)，是一種有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物。辣木原產(chǎn)于印度，從20世紀(jì)開(kāi)始，我國(guó)的云南、廣東、廣西、福建、貴州、臺(tái)灣等?。▍^(qū)）開(kāi)展了辣木引種種植和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)研究。辣木渾身是寶，根皮是傳統(tǒng)醫(yī)藥原料，嫩葉和嫩果是味道和營(yíng)養(yǎng)都豐富的蔬菜，種子富含植物油，在國(guó)際市場(chǎng)上十分緊俏。據(jù)測(cè)定，辣木的蛋白質(zhì)含量為牛奶的2倍、鈣為牛奶的4倍、鉀為香蕉的2倍、鐵為波菜的2倍、維生素C為柑桔的7倍、維生素A為胡蘿卜的4倍、維生素E分別是螺旋藻和黃豆粉的70倍和40倍（劉昌芬和李國(guó)華，2004）?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明，辣木有退熱、消炎、排石、利尿、降壓、降血脂和抗氧化等功效。在印度和非洲國(guó)家辣木常用于治療糖尿病、高血壓、心血管病和肥胖癥等（Anwar et al.， 2007; Fahey， 2005; Ghasi et al.， 2000;Song et al.，2017）。楊倩等（2017）發(fā)現(xiàn)，不同劑量的辣木水提取物能降低高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量。正常的SD大鼠喂食辣木葉粉后，血清中甘油三酯和膽固醇含量顯著低于對(duì)照組（張幸怡等，2016）。此外，辣木提取物還具有較好的抗氧化作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉乙醇提取物（ethanol extract of Moringa oleifera， EE-MO）對(duì)DPPH、ABTS和OH自由基的清除率與正對(duì)照BHT相似（周偉等，2017）。辣木莖葉中的水溶性多糖對(duì)羥自由基及超氧陰離子均有清除作用，且具有劑量依賴性（梁鵬和甄潤(rùn)英，2013）。在大鼠腎和心肌缺血再灌注模型中，辣木籽提取物能顯著降低模型組動(dòng)物血清的MDA含量，增加血清及腎或心臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，緩解氧化脅迫（曲震理， 2016; 曲震理等， 2017）。

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的進(jìn)展是一個(gè)緩慢的過(guò)程，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纖維化和肝硬化，部分患者甚至可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，我國(guó)的NAFLD發(fā)病率明顯上升且呈年輕化趨勢(shì)，現(xiàn)在NAFLD已經(jīng)成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。 NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為主要與胰島素抵抗（IR）、氧化應(yīng)激、炎癥作用、庫(kù)普弗細(xì)胞與細(xì)胞因子、脂代謝紊亂和鐵超載等相關(guān)（Loomba & Sanyala，2013）。其中，氧化應(yīng)激和脂代謝紊亂在NAFLD肝細(xì)胞損傷過(guò)程中具有十分重要的作用。本文主要研究EE-MO對(duì)NAFLD小鼠模型血脂和氧化應(yīng)激的影響，探索EE-MO在改善NAFLD癥狀方面的有效性，并揭示可能的機(jī)理，為辣木的進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 EE-MO的制備

辣木葉購(gòu)于云南省昆明市螺螄灣藥材市場(chǎng)。稱(chēng)取2.5 kg干燥的辣木葉，粉碎后，加95%乙醇室溫提取3次（每次為6 L，24 h）。合并提取液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇至無(wú)醇味。醇提物用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥粉末狀的醇提物。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組

共有55只SPF級(jí)小鼠，隨機(jī)選取10只為正常對(duì)照組 （N-CK），其余45只為模型組。參考鐘嵐等（2000）的方法復(fù)制脂肪肝大鼠模型，用88%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇制成的混合飼料，經(jīng)機(jī)器生產(chǎn)壓制成條狀，制成高脂飼料。正常組始終喂以普通飼料，模型組喂以高脂肪飼料。模型組從第5周開(kāi)始從背部后側(cè)注射40%的CCl4豆油溶液，正常組注射純豆油溶液，注射劑量為2 μL·g-1，每周2次，共3周。造模8周后，隨機(jī)選擇5只模型組小鼠處死，取出肝臟做病理切片，檢查模型是否復(fù)制成功，確定成功后，從第8周開(kāi)始，將模型組分為模型對(duì)照組（M-CK）、低劑量辣木葉處理組（D-LM）、中劑量辣木葉處理組（Z-LM）和高劑量辣木葉處理組（G-LM）。每天早上9：00，D-LM、Z-LM和G-LM處理組小鼠分別用5、30和60 mg·kg-1的辣木葉提取物灌胃，M-CK處理組給予等體積的生理鹽水灌胃。處理期間，N-CK組小鼠繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)，所有模型組的小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)。持續(xù)2周后，將所有小鼠處死，取其血液和肝臟組織，做后續(xù)生化指標(biāo)和病理學(xué)檢測(cè)。

1.3 血液和肝組織生理生化指標(biāo)檢測(cè)

TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量與ALT和AST活性均采用試劑盒測(cè)定。所有操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。其中，TC和TG含量所用試劑盒購(gòu)于上海生物工程技術(shù)有限公司。HDL-C、LDL-C和FFA含量所用試劑盒購(gòu)于大連TAKARA公司。ALT和AST活性測(cè)定所用試劑盒購(gòu)于中國(guó)上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.4 抗氧化物酶活性測(cè)定

用氮藍(lán)四唑法測(cè)定SOD酶活性，用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD酶活性，用紫外速率法測(cè)定CAT酶活性，用分光光度計(jì)比色法測(cè)定GSH-Px活性。

1.5 MDA和ROS含量測(cè)定

脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸分光光度法測(cè)定，ROS含量采用Luminol化學(xué)發(fā)光法測(cè)定（Faulkner & Fridovich，1993）。

1.6 HE染色

將肝臟組織碎片放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液浸泡固定24 h，取出，用自來(lái)水沖洗4 h后，依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇浸泡脫水。將脫水后的標(biāo)本用二甲苯浸泡2次（每次15 min）。用石蠟包埋后，進(jìn)行切片。切片先依次放入二甲苯I和II進(jìn)行浸泡脫蠟，然后用95%、85%、70%和50%的梯度酒精溶液中依次浸泡2 min蒸餾水沖洗2 min。標(biāo)本經(jīng)蘇木素浸染5～15 min和1%伊紅水浸染1～5 min，脫水，透明后進(jìn)行鏡檢。

1.7 蘇丹紅Ⅲ染色

參照馬羽萍等（2010）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠模型體重和肝濕重的影響

如表1所示，高脂飲食8周后，M-CK組小鼠的體重顯著高于N-CK組。用低劑量的EE-MO干預(yù)2周后，小鼠體重與M-CK組相比無(wú)顯著性差異。用中、 高劑量的EE-MO干預(yù)2周后， 小鼠的體重與M-CK組相比有下降的趨勢(shì)，雖然Z-LM組小鼠的體重與M-CK組相比仍無(wú)顯著性差異，但G-LM組小鼠體重顯著低于M-CK組。肝濕重與體重的變化趨勢(shì)類(lèi)似，M-CK組小鼠的肝濕重顯著高于N-CK組。用EE-MO干預(yù)2周后，D-LM和Z-LM組與M-CK組小鼠肝濕重?zé)o顯著性差異，而G-LM組肝濕重顯著低于M-CK組。

2.2 EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠模型肝TC、TG、HDL-C、LDL-C及FFA含量的影響

如圖1：A所示，高脂飲食8周后，M-CK組小鼠血清的TC和TG含量均顯著高于N-CK組。EE-MO能夠劑量依賴性降低模型組小鼠血清TC和TG的含量。血清LDL-C和HDL-C含量的變化趨勢(shì)與TC和TG含量變化趨勢(shì)類(lèi)似。M-CK組小鼠血清的LDL-C和HDL-C含量均顯著高于N-CK組，用EE-MO處理后，NAFLD小鼠模型的LDL-C和HDL-C含量均顯著降低 （圖1：B）。高脂飲食后，M-CK組血清的FFA含量顯著高于N-CK。用不同劑量提取物處理后，D-LM和Z-LM組的血清FFA含量與M-CK組無(wú)顯著性差異，而G-LM組顯著低于M-CK組 （圖1：C）。

2.3 EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠模型血清ALT和AST活性的影響

如圖2所示，NAFLD小鼠模型血清ALT和AST的變化趨勢(shì)類(lèi)似，高脂飲食誘導(dǎo)血清ALT和AST活性均顯著增加。EE-MO處理后，NAFLD小鼠模型的ALT和AST活性顯著下降，且具有劑量依賴性，即血清ALT和AST的活性大小順序?yàn)镈-LM>Z-LM>G-LM。

2.4 EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠模型血清及肝臟ROS和MDA含量的影響

如圖3：A所示，高脂飲食引起血清ROS含量顯著增加。用EE-MO處理后，D-LM組處理小鼠血清ROS與M-CK組相比無(wú)顯著差異。Z-LM和G-LM處理組血清ROS含量顯著低于D-LM組，且G-LM組小鼠血清ROS含量低于Z-LM。高脂肪飲食后， M-CK組小鼠肝臟ROS含量顯著高于N-CK組。低劑量EE-MO處理后，D-LM組小鼠肝臟ROS含量與M-CK組相比顯著降低。中、高劑量EE-MO處理后，Z-LM和G-LM處理組小鼠肝臟ROS含量與D-LM組相比進(jìn)一步降低，且G-LM組小鼠肝臟ROS含量低于Z-LM （圖3：B）。EE-MO能夠劑量依賴性地降低NAFLD小鼠模型肝臟ROS含量。血清和肝臟MDA含量與小鼠肝臟ROS含量變化趨勢(shì)相似，高脂飲食誘導(dǎo)了血液和肝臟組織MDA含量增加，而EE-MO劑量依賴性地降低了NAFLD小鼠模型血液和肝臟組織MDA含量（圖3：C，D）。

2.5 EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠抗氧化物酶活性的影響

如表2所示，M-CK組血清和肝臟SOD、CAT和POD活性顯著高于N-CK組，高脂飲食誘導(dǎo)了上述抗氧化物酶活性增加。D-LM組小鼠血清和肝臟的SOD、CAT和POD活性與M-CK組相比均無(wú)顯著性差異。Z-LM組的血清和肝臟SOD、CAT和POD活性與M-CK組相比顯著下降。類(lèi)似地，G-LM組血清和肝臟的SOD、CAT和POD活性進(jìn)一步下降，顯著低于Z-LM和M-CK。G-LM組肝臟的SOD、CAT和POD活性恢復(fù)到N-CK組水平。M-CK組肝臟和血清的GSH-Px活性顯著低于N-CK組，高脂飲食抑制GSH-Px活性。EE-MO處理后，D-LM組肝臟和血清GSH-Px活性與M-CK組無(wú)顯著差異。Z-LM和G-LM組肝臟和血清GSH-Px活性顯著高于M-CK組，且G-LM組GSH-Px活性高于Z-LM組。中、高劑量的EE-MO可以恢復(fù)高脂飲食對(duì)GSH-Px活性的抑制作用。

2.6 EE-MO處理干預(yù)后肝臟的HE染色

如圖4所示，N-CK組的小鼠肝索以中央靜脈為中心排列規(guī)則，肝細(xì)胞大小均勻，多數(shù)肝細(xì)胞只見(jiàn)一個(gè)細(xì)胞核，部分細(xì)胞可見(jiàn)雙核。高脂肪飲食8周后，M-CK組小鼠幾乎全部肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞彌漫性腫大致肝小葉結(jié)構(gòu)不清。肝細(xì)胞腫大，有氣球樣變。用低劑量的EE-MO干預(yù)2周后，D-LM組小鼠肝臟仍然有大量肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，體積增大，肝索排列紊亂。肝細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有一定量大小不等的脂肪空泡。Z-LM組小鼠肝細(xì)胞一定量的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞腫大變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少量大小不等的脂肪空泡。肝索排列稍紊亂。G-LM組小鼠肝索以中央靜脈為中心排列規(guī)則，有少量肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪性變，胞核呈圓形。

2.7 EE-MO處理干預(yù)后對(duì)肝臟脂肪病變的影響

蘇丹Ⅲ染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-CK組小鼠的肝臟染色后并無(wú)明顯的橘紅色，表明肝臟并沒(méi)有發(fā)生明顯的脂肪病變。M-CK小鼠的肝臟染色后，大部分組織變成橘紅色，肝臟發(fā)生了明顯的脂肪病變。用低劑量的EE-MO干預(yù)2周后，大部分肝臟仍然染成橘紅色，但染色面積和著色程度低于M-CK組。用中、高劑量的EE-MO干預(yù)后，肝臟的染色面積和著色程度低于D-LM，但Z-LM和G-LM處理組之間無(wú)顯著差異（圖5）。

3 討論

NAFLD在歐美國(guó)家發(fā)生率極高，隨著亞健康生活方式的流行、肥胖人口增加，NAFLD 在我國(guó)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，NAFLD患者10 a內(nèi)進(jìn)展至肝硬化的概率約為25%，需早期采取干預(yù)措施。

“二次打擊”學(xué)說(shuō)作為NAFLD的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制，已被廣泛接受。脂類(lèi)在肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集（第一次打擊）觸發(fā)了一系列細(xì)胞毒素事件。第二次打擊為氧化應(yīng)激反應(yīng)，是在第一次打擊基礎(chǔ)上，由活性氧誘導(dǎo)的發(fā)生在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)急是NAFLD病理進(jìn)展的一個(gè)重要原因（Nd，2003）。本研究中，考察了EE-MO對(duì)NAFLD小鼠模型氧化脅迫的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)了血清和肝臟組織ROS和MDA的積累，表明NAFLD小鼠模型發(fā)生了氧化應(yīng)急事件。EE-MO能夠劑量依賴性地降低血清和肝臟組織ROS和MDA的積累，緩解氧化脅迫。對(duì)經(jīng)典抗氧化物酶SOD、CAT和POD進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)三種抗氧化物酶活性顯著增加，可能是因?yàn)楦咧嬍痴T導(dǎo)了大量ROS的積累，生物體需要通過(guò)增加抗氧化物酶的活性，清除過(guò)剩的ROS。用低劑量的EE-MO處理后，D-LM處理組血清和肝臟的抗氧化物酶活性與M-CK組無(wú)顯著性差異。用中、高劑量的EE-MO處理后，Z-LM和G-LM處理組血清和肝臟的經(jīng)典抗氧化物酶SOD、POD和CAT活性與M-CK組相比有下降的趨勢(shì)，G-LM處理組血清的SOD、POD和CAT甚至恢復(fù)到N-CK水平。雖然高脂肪誘導(dǎo)了NAFLD小鼠血清和肝臟組織抗氧化物酶活性的增加，但中、高劑量EE-MO處理后NAFLD小鼠的SOD、POD和CAT酶活性低于N-CK組，EE-MO并不是通過(guò)增加SOD、POD和CAT活性清除ROS，緩解氧化脅迫。此外，還發(fā)現(xiàn)高脂飲食抑制GSH-Px活性。EE-MO處理后，血清和肝臟的GSH-Px活性相比模型組顯著增加。GSH-Px是除上述經(jīng)典抗氧化物酶外生物體內(nèi)存在的另一種重要的過(guò)氧化物分解酶。在正常情況下，肝內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡中，GSH-Px特異地催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜及其功能的作用。血清和肝臟 GSH-Px活性在STZ誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型中活性顯著下降，用藥物干預(yù)后其活性恢復(fù)到對(duì)照水平（Videla et al.，2004;Wang et al.，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)，EE-MO處理能劑量依賴性地恢復(fù)高脂飲食對(duì)小鼠肝臟和血清GSH-Px活性的抑制作用，暗示本研究中GSH-Px可能在緩解小鼠NAFLD模型的氧化應(yīng)激中起著關(guān)鍵作用。此外，EE-MO中含有黃酮、多糖和花青素等二次還原性代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物也可能通過(guò)非酶途徑清除NAFLD小鼠體內(nèi)的ROS，緩解氧化脅迫（陳瑞嬌，2006;陳瑞嬌等，2007;劉昌芬和李國(guó)華，2004）。

除氧化脅迫外，血脂代謝異常是NAFLD病理進(jìn)展的另一個(gè)重要原因。在第一次打擊學(xué)說(shuō)中，胰島素抵抗導(dǎo)致肝臟脂肪變性，進(jìn)而出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂和肝損傷。本研究還考察了EE-MO處理對(duì)NAFLD小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA的影響，結(jié)果表明高脂飲食誘導(dǎo)了血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量的影響，這與前人的研究結(jié)果一致（Chao et al.，2014;Li et al.，2013）。低、中和高劑量的EE-MO處理后，F(xiàn)FA含量與M-CK組差別大，但高劑量的EE-MO處理后，F(xiàn)FA含量顯著降低。低、中和高劑量EE-MO均可降低NAFLD小鼠模型血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量，減少脂肪在肝臟中的積累，可以通過(guò)HE和蘇丹紅Ⅲ染色進(jìn)一步證實(shí)。上述結(jié)果證實(shí)EE-MO處理能有效改善NAFLD小鼠模型的血脂代謝。

本研究首次表明EE-MO處理能夠有效緩解NAFLD的氧化應(yīng)急和血脂代謝紊亂，中、高劑量的EE-MO緩解效果優(yōu)于低劑量處理。然而，本研究中用EE-MO對(duì)NAFLD小鼠模型僅進(jìn)行了2周處理，雖然在整個(gè)處理期間，沒(méi)有小鼠發(fā)生死亡，但是在高劑量處理下，是否EE-MO會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性還值得進(jìn)一步研究。

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