崗梅根和莖超臨界CO2萃取物中低極性揮發(fā)性成分比較及其對IEC—6細胞增殖活性的影響

馬洪艷 汪天呈 李武國 劉嘉煒

摘 要 目的：比較崗梅根和莖的超臨界CO2萃取物中的低極性揮發(fā)性化學(xué)成分及其體外對大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6增殖活性的影響，為充分利用崗梅野生資源和擴大其藥用部位提供參考。方法：采用超臨界CO2萃取法提取崗梅根和莖中的低極性揮發(fā)性化學(xué)成分，通過氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）分析其化學(xué)成分組成。以IEC-6細胞為對象，采用不同質(zhì)量濃度的崗梅根或莖超臨界CO2萃取物（0、1、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL）處理細胞，以MTT法檢測細胞相對活力，繪制細胞增殖曲線圖并計算各萃取物的半數(shù)有效濃度（EC50）。結(jié)果：通過GC-MS分析技術(shù)從崗梅根和莖超臨界CO2萃取物中分別鑒定出62、46個低極性揮發(fā)性化學(xué)成分，其中共有成分24個，主要為壬酸（根、莖中分別含14.18%、6.14%）、辛酸（根、莖中分別含10.59%、4.35%）、己酸（根、莖中分別含8.63%、10.86%）、丹皮酚（根、莖中分別含7.79%、6.00%）、2-甲基-3-苯基-丙醇（根、莖中分別含6.30%、0.58%）、乙酸（根、莖中分別含1.72%、33.77%）等。細胞體外試驗結(jié)果顯示，崗梅根和莖超臨界CO2萃取物質(zhì)量濃度較低（≤60 μg/mL）時，能顯著促進IEC-6細胞增殖，EC50分別為16.35、20.20 μg/mL；而當質(zhì)量濃度較高（≥80 μg/mL）時，則表現(xiàn)出細胞毒活性，對IEC-6細胞增殖呈抑制作用。結(jié)論：崗梅根和莖中的低極性揮發(fā)性化學(xué)成分種類相似，其萃取物對IEC-6細胞的體外生物活性也相似；短鏈脂肪酸很可能是其促進細胞增殖的活性成分，而丹皮酚則可能是其細胞毒活性成分。

關(guān)鍵詞 崗梅；根；莖；低級性；揮發(fā)性成分；超臨界CO2萃??；氣質(zhì)聯(lián)用；IEC-6細胞；細胞增殖

Comparison of Low-polarity Volatile Constituents in Supercritical CO2 Extract from the Roots and Stem of Ilex asprella and Its Effects on the Proliferation of IEC-6 Cells

MA Hongyan，WANG Tiancheng，LI Wuguo，LIU Jiawei（Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering， Guangzhou University of TCM/Key Lab of Chinese Medicinal Resource from Lingnan/ Lingnan Pharmaceutical Research and Development Laboratory， National Center for Engineering and Technology of Chinese Patent Medicine， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare low-polarity volatile constituents in supercritical CO2 extract from the roots and stem of Ilex asprella and its effects on the proliferation of IEC-6 in vitro， and to provide reference for making full use of wild resources of I. asprella and expanding its medicinal parts. METHODS： The low-polarity volatile constituents were extracted from the root and stem of I. asprella with supercritical fluid CO2 extraction（SFE-CO2）. The chemical constituents were analyzed by GC-MS. IEC-6 cells were treated with different concentrations of supercritical CO2 extracts （0， 1， 5， 10， 20， 40， 60， 80， 100 μg/mL） from roots or stems of I. asprella. MTT assay was used to detect the relative viability， and cell proliferation curve was drawn and EC50 of each extract were calculated. RESULTS： Sixty-two and forty-six low-polarity volatile constituents were identified from supercritical CO2 extract in the roots and stem of I. asprella with GC-MS； there were 24 common constituents totally， mainly including pelargonic acid（14.18% and 6.14%），octanoic acid（10.59% and 4.35%），hexanoic acid（8.63% and 10.86%），paeonol（7.79% and 6.00%），2-methyl-3-phenyl-propanal（6.3% and 0.58%），acetic acid（1.72% and 33.77%） in root and stem， respectively. The results of cell culture in vitro showed that when the concentration of supercritical CO2 extract from the roots and stems of I. asprella was lower （≤60 μg/mL）， it could significantly promote the proliferation of IEC-6 cells and their EC50 were 16.35， 20.20 μg/mL， respectively； when the concentration of the extract was higher （≥80 μg/mL）， it showed cytotoxicity and inhibited the proliferation of IEC-6 cells. CONCLUSIONS： There are similar species of volatile constituents in roots and stems of I. asprella and similar in vitro bioactivity of the supercritical CO2 extracts to IEC-6 cells. The short-chain fatty acids may be the active ingredient to promote cell proliferation， while paeonol may be the cytotoxic active ingredient.

KEYWORDS Ilex asprella； Root； Stem； Low polarity； Volatile constituents； SFE-CO2； GC-MS； IEC-6 cell； Cell proliferation

崗梅為冬青科冬青屬落葉灌木梅葉冬青[Ilex asprella（Hook. et Arn.）Champ. ex Benth]，屬于多年生木本植物，生于海拔400～1 000 m的山地疏林中或路旁灌叢中，主產(chǎn)于我國浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西、香港、臺灣等地，在菲律賓群島等東南亞地區(qū)也有分布[1]。崗梅傳統(tǒng)藥用部位為其根部，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為崗梅根入藥能清熱解毒、活血生津，常用于防治風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染等疾病[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，崗梅根提取物及其分離化合物具有抗病毒、抗炎、腫瘤細胞毒性、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生物活性[4-6]。崗梅根為三九感冒靈、王老吉和加多寶等中成藥及涼茶飲品的主要原料，是嶺南地區(qū)大宗藥材之一，在藥材市場的需求量日益劇增，使得野生崗梅被過度采伐，其植物資源逐年減少，其藥材資源嚴重匱乏，難以滿足臨床需求。已有研究顯示，崗梅根主要含有三萜酸、三萜皂苷、黃酮等極性化學(xué)成分，而崗梅莖所含化學(xué)成分與根相似[6-10]。然而崗梅根和莖中的低極性揮發(fā)性成分研究鮮有報道。為了擴大崗梅藥用部位，充分開發(fā)利用崗梅藥材資源，本課題通過超臨界CO2萃取崗梅根和莖中的低極性揮發(fā)性成分，以氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）鑒定并比較其化學(xué)成分異同，進一步評價其對大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6增殖活性的影響，以期為擴大崗梅藥用部位提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HA121-50-05型超臨界流體萃取儀（江蘇華安科研儀器有限公司）；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；ME204型萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XR205SM-DR型十萬分之一電子天平（瑞士Precisa公司）；Voyager型GC-MS聯(lián)用儀（美國Finnigan公司）；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41型相差倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；TC10型細胞計數(shù)儀、iMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器公司）。

1.2 藥材與試劑

崗梅藥材于2012年11月采于廣東從化市三埡塘，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物教研室彭光天博士鑒定為冬青科冬青屬植物梅葉冬青[Ilex asprella（Hook. et Arn.）Champ. ex Benth]的干燥根和莖。

DMEM培養(yǎng)基（批號：C11995）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：C10010）、胎牛血清（FBS，批號：10099）、0.25%Trypsin-EDTA（批號：25200）、青-鏈霉素雙抗溶液（批號：15140）均為美國Gibco公司產(chǎn)品；CO2（上海源葉生物科技有限公司，純度：99.999%）；MTT（美國Sigma公司，批號：M2128）；95%乙醇、無水硫酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）、乙醚等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6細胞株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所李茹柳研究員惠贈，液氮保存。

2 方法

2.1 崗梅根和莖的超臨界CO2萃取

取崗梅根510 g、莖505 g，粉碎，過50目篩，裝入超臨界萃取釜中。采用經(jīng)前期預(yù)試驗優(yōu)化所得工藝參數(shù)進行超臨界CO2萃?。狠腿毫?0 MPa、萃取溫度為45 ℃，加入一定量95%乙醇作為夾帶劑，萃取時間為2 h。其中分離釜Ⅰ的溫度為45 ℃，壓力為5.4 MPa；分離釜Ⅱ的溫度為50 ℃，壓力為5.4 MPa。

2.2 崗梅根和莖超臨界CO2萃取物的GC-MS分析

2.2.1 樣品溶液的制備 將“2.1”項下所得超臨界CO2萃取物在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，得提取物浸膏。取適量浸膏，用乙醚配制成50 mg/mL（按浸膏質(zhì)量計算）的溶液，加適量無水Na2SO4脫水干燥，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。取濾液備用于GC-MS分析檢測。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為TG WAXMS石英毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，立刻以10 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；進樣口溫度為220 ℃；載氣為高純度氮氣，載氣體積流量為2 mL/min（恒流模式）；分流進樣，分流比為15 ∶ 1；進樣量為1 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度為200 ℃；接口溫度為240 ℃；電離子為電子轟擊（EI）源，電子轟擊能量為70 eV；掃描方式為Full Scan，掃描速度為1 975.50 amu/s，掃描范圍為19～450 amu，溶劑延遲時間為3 min。

2.2.4 低極性揮發(fā)性成分的相對含量計算 采用NIST Search 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫軟件對化學(xué)成分進行檢索匹配，并結(jié)合相關(guān)文獻，人工解析質(zhì)譜圖譜，鑒定并確證化合物結(jié)構(gòu)；采用峰面積歸一法計算各化學(xué)成分的相對百分含量。

2.3 崗梅根和莖超臨界CO2萃取物對IEC-6細胞增殖活性的影響考察

2.3.1 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 取液氮保存的IEC-6細胞，在37 ℃水浴中解凍（≤1 min），加入4～6 mL完全培養(yǎng)液（含10%FBS+雙抗的DMEM培養(yǎng)基）中，1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，次日換液。待細胞生長至約80%融合時，用0.25%Trypsin-EDTA 1 mL消化傳代，備用。

2.3.2 萃取物對細胞增殖活性的影響考察 采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞進行消化計數(shù)，然后按1×104個/孔接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。將細胞分為空白對照組和給藥組，每組平行設(shè)置3個孔。吸棄各孔中的完全培養(yǎng)液，空白對照組加入含0.4%DMSO+10%FBS的DMEM培養(yǎng)基200 μL，給藥組加入含梯度質(zhì)量濃度的崗梅根或莖萃取物（終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL，按浸膏質(zhì)量計算，劑量根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果制定）的完全培養(yǎng)液200 μL，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完畢后，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液（以PBS為溶劑配制）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。采用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度（OD）值，以此表示細胞相對活力；同時，以藥物濃度對數(shù)值為橫坐標、相對細胞活力為縱坐標，采用GraphPad Prism軟件繪制細胞增殖曲線并計算各萃取物的半數(shù)有效濃度（EC50）。

3 結(jié)果

3.1 超臨界CO2萃取物的GC-MS分析結(jié)果

3.1.1 崗梅根 經(jīng)超臨界CO2流體萃取得到崗梅根萃取物3.29 g，產(chǎn)率為0.65%。經(jīng)GC-MS分析，共分離得到70個峰。鑒定并確證其中62個化合物的結(jié)構(gòu)，按面積歸一化法計算，這62個化合物含量之和占檢出化學(xué)成分總量的相對百分含量為97.70%；其中的主要成分為2-甲基-3-苯基-丙醇（2-methyl-3-phenyl-propanal）、己酸（Hexanoic acid）、庚酸（Heptylic acid）、辛酸（Octanoic acid）、壬酸（Pelargonic acid）和丹皮酚（Paeonol）等，分別占檢出化學(xué)成分總量的6.30%、8.65%、3.58%、10.59%、14.18%和7.79%。崗梅根超臨界CO2萃取物的總離子流圖譜見圖1A，GC-MS分析結(jié)果見表1。

3.1.2 崗梅莖 經(jīng)超臨界CO2流體萃取得到崗梅莖萃取物1.39 g，產(chǎn)率為0.28%。經(jīng)GC-MS分析，共分離得到53個峰。鑒定并確證其中46個化合物的結(jié)構(gòu)，按面積歸一化法計算，這46個化合物含量之和占檢出化學(xué)成分總量的相對百分含量為94.46%；其中的主要成分為乙酸（Acetic acid）、己酸（Hexanoic acid）、辛酸（Octanoic acid）、壬酸（Pelargonic acid）和丹皮酚（Paeonol）等，分別占檢出化學(xué)成分總量的33.77%、10.86%、4.35%、6.14%和6.00%。崗梅莖超臨界CO2萃取物的總離子流圖譜見圖1B，GC-MS分析結(jié)果見表1。

3.2 超臨界CO2萃取物對IEC-6細胞增殖活性的影響考察結(jié)果

結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為1～60 μg/mL的崗梅根和莖超臨界CO2萃取物進行處理后，細胞相對活力隨藥物質(zhì)量濃度升高而升高，表明上述質(zhì)量濃度的萃取物能促進細胞增殖，且呈量效關(guān)系，其EC50分別為16.35、20.20 μg/mL；但當質(zhì)量濃度為80～100 μg/mL的萃取物進行處理后，細胞相對活力隨藥物質(zhì)量濃度升高而降低，表明兩者均能抑制細胞增殖活性，表現(xiàn)出一定的細胞毒活性。不同質(zhì)量濃度崗梅根和莖超臨界CO2萃取物作用下的細胞增殖曲線見圖2。

4 討論

崗梅為嶺南地區(qū)地產(chǎn)藥材，以根入藥，是多種中成藥和保健品飲料的重要原料。但崗梅生長緩慢、藥材產(chǎn)量低，加之目前對其野生資源的過度采伐，導(dǎo)致其藥材資源嚴重匱乏、日趨瀕危。因此，擴大崗梅藥用部位成為解決上述問題的思路之一。已有研究證實，崗梅根和莖中含有相似種類的極性化學(xué)成分[6-10]。為進一步探討崗梅根和莖所含化學(xué)成分的異同，本研究分析比較了兩者所含低極性揮發(fā)性化學(xué)成分，并評價了其萃取物在體外對IEC-6細胞增殖活性的影響。

本研究采用超臨界CO2萃取崗梅根和莖的低極性揮發(fā)性成分，利用GC-MS法分析鑒定其化合物結(jié)構(gòu)，從崗梅根和莖中分別鑒定并確證了62、46個化合物，分別占總檢出化學(xué)成分的97.54%、96.54%，這些化合物均主要為有機酸類、萜類、醇類、酯類和酮類等；兩者的共有成分有24個，分別共占總檢出化學(xué)成分的相對百分含量為72.48%、75.87%，均包括壬酸、辛酸、己酸、丹皮酚、2-甲基-3-苯基-丙醇、乙酸等共有成分，表明崗梅根和莖的低極性揮發(fā)性化學(xué)成分種類和含量相似。

體外細胞試驗結(jié)果顯示，崗梅根和莖的超臨界CO2萃取物質(zhì)量濃度≤60 μg/mL時，能顯著促進IEC-6細胞增殖；而當萃取物質(zhì)量濃度≥80 μg/mL時，則表現(xiàn)出明顯細胞毒性，對IEC-6細胞增殖呈抑制作用。通過GC-MS分析表明，崗梅根和莖超臨界CO2萃取物均含有較豐富的揮發(fā)性短鏈脂肪酸如乙酸、己酸、辛酸和戊酸等。研究表明，這些短鏈脂肪酸具有營養(yǎng)腸生理作用，是腸上皮細胞的主要能量來源[11]；辛酸是低分子量脂肪酸，具有促進P12神經(jīng)細胞神經(jīng)突觸成長的活性[12]；戊酸能促進倉鼠卵巢細胞（CHO）的蛋白質(zhì)合成和細胞增殖[13]。較高含量的短鏈脂肪酸很可能是崗梅根和莖超臨界CO2萃取物中促進IEC-6細胞增殖的活性成分，也可能是崗梅的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時，丹皮酚也是崗梅根和莖超臨界CO2萃取物中相對含量較高的化學(xué)成分，分別占7.79%、6.00%，該化合物很可能是萃取物中的細胞毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)。研究證明，丹皮酚能通過下調(diào)ErbB2并抑制核因子κB（NF-κB）信號通路，從而抑制胃癌細胞SGC-7901細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡[14]；還能通過抑制金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的表達水平，從而抑制胃癌細胞 BGC823 的增殖、遷移和侵襲[15]。據(jù)此推測，丹皮酚可能也是崗梅根和莖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有待后續(xù)進一步深入研究。

綜上所述，崗梅根和莖中所含低極性揮發(fā)性化學(xué)成分種類相似，其超臨界CO2萃取物對IEC-6細胞增殖活性的影響作用也相似。本研究可為擴大崗梅藥用部位和充分利用其野生資源提供參考。

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（收稿日期：2018-11-28 修回日期：2019-02-26）

（編輯：段思怡）