解磷拮抗真菌分離鑒定及其對(duì)獼猴桃軟腐病的生防評(píng)價(jià)

卯婷婷 莫維弟 趙玳琳 王廿 陶剛

摘要：【目的】篩選可應(yīng)用于獼猴桃果實(shí)軟腐病的高效生防菌株，為獼猴桃軟腐病生防制劑研發(fā)提供菌種資源。【方法】采集有獼猴桃軟腐病發(fā)生的獼猴桃種植園健康植株根際土壤，利用解磷選擇性培養(yǎng)基分離土壤中解磷真菌，采用平板對(duì)峙法、菌落直徑法、繼代培養(yǎng)及發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)等從中篩選對(duì)獼猴桃軟腐病菌具有拮抗作用的菌株，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)拮抗菌株進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】從獼猴桃根際土壤中分離得到35株解磷真菌菌株，通過對(duì)峙培養(yǎng)從中篩選出5株對(duì)獼猴桃軟腐病菌具有拮抗作用且抑菌率超過50.00%的菌株，其中MHT0308菌株的抑菌效果最佳，對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達(dá)87.71%，復(fù)篩抑菌圈也明顯，抑菌直徑達(dá)33.50 mm;MHT0308菌株的含菌發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液均對(duì)靶標(biāo)菌生長有抑制作用，抑菌率分別達(dá)88.13%和80.87%;獼猴桃果實(shí)經(jīng)MHT0308菌株發(fā)酵液處理后對(duì)獼猴桃軟腐病的離體防效達(dá)87.00%;根據(jù)MHT0308菌株形態(tài)學(xué)特征結(jié)合其分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）?！窘Y(jié)論】MHT0308菌株對(duì)獼猴桃軟腐病具有較好的防治效果，可作為一種重要的生防菌資源用于獼猴桃軟腐病防治研究。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃軟腐病;解磷菌;抑菌作用;離體防效;木霉菌

中圖分類號(hào)： S436.634? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1748-08

Isolation and identification of phosphate-solubilizing antagonistic

fungus and its biocontrol effects against kiwifruit soft rot

MAO Ting-ting1， MO Wei-di2， ZHAO Dai-lin1， WANG Nian1， TAO Gang1*

（1Institute of Plant Protection，Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang? 550006， China;

2Agricultural College， Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The aim of the study was to screen the efficient biocontrol strains that could be applied to the green prevention and control of kiwifruit soft rot， and provide resources for biocontrol agent development for kiwifruit soft rot. 【Method】The healthy rhizosphere soil of kiwifruit plantation with kiwifruit soft rot was collected， and the phosphate- solubilizing fungus was separated from the soil using selective phosphate-degrading medium. At the same time， the antagonistic fungus against kiwifruit soft rot were screened by using plate confront culture， colony diameter inhibition assay， subculture and fermentation broth inhibition test. The fungi were classified through the morphological characteristics and molecular biology. 【Result】Thirty-five strains of phosphorus-releasing fungi were isolated from the rhizosphere soil of kiwifruit， five strains with an antagonistic effect on soft rot of kiwifruit and the inhibition rate more than 50.00% were selected through confrontation culture. Among them， MHT0308 strain had the best inhibitory effect and it had 87.71% control efficiency to soft rot of kiwifruit. And the inhibition zone was obvious with the inhibition diameter of 33.50 mm. Both sterilized and non-sterilized fermentation liquid of MHT0308 strain were effective against target pathogen hyphae， the inhibitory rates were 88.13% and 80.87%， respectively. The control effect of kiwifruit in vitro was 87.00% after trea-ted with MHT0308 fermentation broth. According to the morphological characteristics and molecular biology， the strain MHT0308 was identified as Trichoderma harzianum. 【Conclusion】Strain MHT0308 has sound control efficacy against kiwifruit soft rot and can be used as an important biocontrol resource for the prevention and treatment of kiwi soft rot.

Key words： kiwifruit soft rot; phosphate-solubilizing fungus; bacteriostatic effect; control effect in vitro; Trichoderma

0 引言

【研究意義】獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）又名長壽果、美容果，每100 g獼猴桃果肉中維生素C含量可達(dá)652～930 mg，故又被譽(yù)為維C之王（楊宗正，2018）。獼猴桃在我國陜西、甘肅、河南、廣西、廣東、福建、云南、貴州和四川等省（區(qū)）均有種植分布。近年來，獼猴桃種植面積逐漸擴(kuò)大，在產(chǎn)量和效益上升的同時(shí)，獼猴桃病害也日益突出，尤其是獼猴桃果實(shí)軟腐病作為儲(chǔ)藏期病害對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)危害尤為嚴(yán)重，通常采摘時(shí)無癥狀，儲(chǔ)藏期開始發(fā)病，發(fā)病率一般為20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%（馬松濤等，2000），直接影響獼猴桃的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前國內(nèi)外對(duì)該病害的防控主要以化學(xué)防治為主，研究表明，抗菌素402、退菌特、抗菌素401、波爾多液（余桂萍和周洪旗，2009），多菌靈（王小潔等，2017），肟菌酯戊唑醇、己唑醇、戊唑醇、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑（吳文能等，2018）等化學(xué)藥劑對(duì)獼猴桃軟腐病均有較好的防治效果。但化學(xué)藥劑的大量使用既增加了獼猴桃軟腐病菌的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，還容易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題。隨著人們對(duì)綠色食品的需求，生物防治逐漸在病害防控方面體現(xiàn)出其優(yōu)勢，因此，挖掘可利用的生防菌資源對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】獼猴桃軟腐病是一類真菌病害，不同國家及地區(qū)獼猴桃軟腐病病原菌存在明顯差異，主要有擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.）（Luongo et al.，2011）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）（Zhou et al.，2015）等真菌。李黎等（2016）對(duì)我國獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的28個(gè)果園樣本進(jìn)行病原菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)擬莖點(diǎn)霉菌（P. lithocarpus）是我國獼猴桃果實(shí)軟腐病的主要病原菌，葡萄座腔菌（B. dothidea）和小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）是次要病原菌，并且擬莖點(diǎn)霉菌是貴州、四川及江西等地區(qū)的主要為害病原菌。近年來，國內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)獼猴桃病害的生物防治進(jìn)行了研究，其中針對(duì)獼猴桃灰霉病的研究較多（Dodd et al.，2004;Kim et al.，2015），而對(duì)獼猴桃軟腐病的研究相對(duì)較少。Mohamed等（2011）發(fā)現(xiàn)用1-甲基環(huán)丙烯預(yù)處理后再用解淀粉芽孢桿菌處理可降低冷藏過程中獼猴桃軟腐病的發(fā)病率。何應(yīng)紅等（2016）在青蒿內(nèi)生真菌中篩選出一株對(duì)獼猴桃軟腐病有抑制作用的菌株青蒿21號(hào)，并進(jìn)一步證明其發(fā)酵液粗提物對(duì)該病原菌的抑菌活性達(dá)100%，但并未對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。胡容平等（2017）通過木霉與獼猴桃軟腐病菌的對(duì)峙培養(yǎng)及其難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)木霉菌株T156-37對(duì)獼猴桃軟腐病有較好的抑制效果，抑制率達(dá)66.11%，另一株菌株T163-8的代謝產(chǎn)物則表現(xiàn)出對(duì)獼猴桃軟腐病菌的拮抗優(yōu)勢，其抑制率達(dá)63.26%。王小潔等（2017）通過平板對(duì)峙法篩選發(fā)現(xiàn)多粘芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）對(duì)獼猴桃軟腐病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)外報(bào)道用于防治獼猴桃軟腐病的可用生物菌株資源較少，缺少可替代化學(xué)農(nóng)藥的高效生防制劑。為豐富可有效防控獼猴桃軟腐病害的生防微生物種類，進(jìn)一步為開展生防菌制劑研發(fā)提供菌種資源，有必要分離篩選更多不同類型的微生物功能菌。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用解磷菌的溶磷特性從土壤中選擇分離解磷菌株，并利用平板對(duì)峙法、菌落直徑法、繼代培養(yǎng)及發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)等從中篩選對(duì)獼猴桃軟腐病菌有拮抗作用的菌株，同時(shí)通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)拮抗菌株進(jìn)行鑒定，以期為獼猴桃軟腐病生防制劑研發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試材料 供試獼猴桃品種為貴長獼猴桃。供試獼猴桃軟腐病病菌為MHTRF160420，2015年10月分離自貴州省修文縣獼猴桃果園所采集的獼猴桃軟腐病果實(shí)病樣，保存于貴州省植物保護(hù)研究所植物病理研究室。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 解磷選擇性培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 0.03 g，（NH4）2SO4 0.50 g，磷酸鈣5.00 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15.00～20.00 g，pH 6.8～7.0。木霉培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，鏈霉素（Streptomytin）0.10 g，氯霉素（Chloramphenicol）0.30 g，玫瑰紅（Rose bengal）0.02 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。PD液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20.00 g，土豆200.00 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 獼猴桃軟腐病拮抗菌株的分離與篩選 解磷菌株篩選：在貴州省修文縣中哨村獼猴桃園區(qū)（東經(jīng)106°34′25″，北緯26°47′42″，海拔1314.0±3.0 m）選擇獼猴桃軟腐病等病害發(fā)生嚴(yán)重的地塊為土樣采集點(diǎn)，利用五點(diǎn)法采集健康植株的根際土壤。將土樣與無菌水以1∶10的比例稀釋，于150 r/min振蕩20 min后制成土壤初懸液備用，按逐級(jí)梯度稀釋法制備濃度為10-3、10-4和10-5的懸浮液，在冷凝的解磷選擇性培養(yǎng)基上涂布100 μL土壤懸浮液并置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)5板。培養(yǎng)2 d后開始觀察，純化保存有解磷圈產(chǎn)生的菌落，從而分離獲得解磷真菌菌株。

平板對(duì)峙法試驗(yàn)：以獼猴桃軟腐病菌MHTRF 160420為靶標(biāo)病原菌，分離保存的解磷真菌菌株為待測菌進(jìn)行平板培養(yǎng)，在PDA培養(yǎng)基兩側(cè)分別接種直徑為5 mm的病原菌及待測菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)7 d后，計(jì)算待測菌的抑制率，抑制率的計(jì)算參照梁建根等（2007）的方法，根據(jù)菌株抑制率初篩出獼猴桃軟腐病菌拮抗菌株，然后進(jìn)行抑菌圈復(fù)篩。

拮抗菌復(fù)篩試驗(yàn)：將獼猴桃軟腐病菌培養(yǎng)9 d以上待其產(chǎn)孢后，用無菌水洗脫制成1×106 CFU/mL的孢子懸液，按1∶10的比例將其與PDA培養(yǎng)基混勻后倒板，然后在含有病原菌的PDA培養(yǎng)基中央接種初篩拮抗效果較好的菌株，25 ℃黑暗培養(yǎng)，3 d后記錄抑菌圈直徑，篩選出效果最好的拮抗菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1. 2. 2 拮抗菌株繼代培養(yǎng)試驗(yàn) 對(duì)篩選獲得的拮抗菌進(jìn)行繼代培養(yǎng)，根據(jù)其生長速率，28 ℃培養(yǎng)條件下每生長3 d為1代，然后于菌落邊緣打取菌塊后繼續(xù)培養(yǎng)3 d為第2代，以此類推，繼代培養(yǎng)后獲得第1、5、10、15和20代拮抗菌株，用平板對(duì)峙法分別測定拮抗菌不同培養(yǎng)代數(shù)的拮抗活性，評(píng)估其拮抗性狀的遺傳穩(wěn)定性。

1. 2. 3 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性試驗(yàn) 將活化好的拮抗菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，25 ℃下150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)7 d，利用單層無菌紗布過濾掉發(fā)酵液中的菌絲塊，將濾液分為兩份，一份放入10000 r/min的離心機(jī)中離心3 min，充分離心2次，得到的上清液為不含菌體發(fā)酵液，主要含有拮抗菌的次生代謝產(chǎn)物;另一份濾液再過一次無菌單層紗布后，放入3000 r/min的離心機(jī)中離心3～5 s，并利用血球計(jì)數(shù)板將其發(fā)酵濾液分生孢子濃度調(diào)整為1×106 CFU/mL，獲得的上清液為含有菌體發(fā)酵液。以獼猴桃軟腐病菌為指示菌，用菌落直徑法測定拮抗菌兩種發(fā)酵液的抑菌特性。

兩種發(fā)酵液抑菌活性測定：分別將拮抗菌的兩種發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按體積1∶10的比例混勻后倒板，冷凝后在中央接種獼猴桃軟腐病菌菌餅，以普通PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，將處理與對(duì)照同時(shí)放于25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，調(diào)查獼猴桃軟腐病菌的菌落生長直徑，計(jì)算兩種發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病菌菌絲生長的抑制率，每處理3次重復(fù)。

1. 2. 4 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病的離體防效測定 取新鮮健康的獼猴桃果實(shí)用75%酒精浸泡30～60 s，然后用無菌水浸洗3次，擦干果實(shí)表面水分，用接種針過火消毒后刺傷果皮，每果刺孔數(shù)相同，待獼猴桃表皮毛軟化后將其分為兩組，一組用1.2.3試驗(yàn)中制得的無菌發(fā)酵液噴霧整個(gè)獼猴桃果實(shí)后于傷口處接種獼猴桃軟腐病菌菌餅，另一組噴霧無菌水后接種獼猴桃軟腐病菌作為對(duì)照，兩組同時(shí)放入用無菌紗布保濕的保鮮盒中，用保鮮膜密封保鮮，置于溫度26 ℃、相對(duì)濕度90%的恒溫室中12 h光照黑暗交替培養(yǎng)，每處理重復(fù)3組，每組設(shè)6次重復(fù)。3 d后開始觀察獼猴桃的發(fā)病情況，7 d后調(diào)查獼猴桃軟腐病發(fā)病率及拮抗菌發(fā)酵液的防治效果。

1. 2. 5 拮抗菌株鑒定 形態(tài)學(xué)方法鑒定：刮取新生長3 d的菌落邊緣菌絲，用1%葡萄糖溶液制成拮抗菌菌懸液，吸取1滴菌懸液制片并觀察其菌絲形態(tài);將1%葡萄糖溶液倒入平板后用無菌刷洗菌落，制成孢子懸浮液后，吸1滴孢子懸浮液制片并觀察分生孢子形態(tài)特征。

分子生物學(xué)方法鑒定：在冷凝的PDA培養(yǎng)基上鋪無菌玻璃紙，在培養(yǎng)基中央隔離接種拮抗菌，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，收集約20 mg菌絲體用液氮研磨成粉末加入到15 mL的無菌離心管中，利用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)步驟抽提獲得拮抗菌DNA備用。PCR擴(kuò)增和反應(yīng)體系參照White等（1990）的方法。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游通用引物ITS1和ITS4各1.0 μL，無菌水9.5 μL。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建及進(jìn)化分析：先將測得的拮抗菌株ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性檢索，利用拮抗菌株的ITS序列及GenBank相近似真菌的ITS序列在MEGA 7.0中采用ClustalW進(jìn)行對(duì)齊，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用自舉法對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1000次，進(jìn)而分析拮抗菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2. 1 解磷拮抗菌株對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑菌作用

從獼猴桃根際土樣中分離得到35株解磷真菌菌株，對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果（表1）顯示，從35株解磷真菌中共篩選出5株對(duì)獼猴桃軟腐病菌有拮抗作用且抑菌率超過50.00%的菌株，其中對(duì)峙抑菌效果最好的為MHT0308菌株，其對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達(dá)87.71%，其次為MHT0946菌株，兩者對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑菌率差異不顯著（P>0.05，下同），但均顯著高于其他3株菌株（P<0.05，下同）。5株菌株均能產(chǎn)生抑菌圈，其中MHT0308菌株所產(chǎn)生的抑菌圈最大（圖1），其復(fù)篩抑菌圈直徑在培養(yǎng)第3 d時(shí)達(dá)33.50 mm，而MHT0946菌株復(fù)篩第3 d的抑菌圈直徑為24.90 mm（圖2），復(fù)篩效果稍差。經(jīng)對(duì)峙初篩及抑菌圈復(fù)篩兩次篩選后，最終選擇MHT0308菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 MHT0308菌株繼代培養(yǎng)結(jié)果

對(duì)2.1中篩選獲得拮抗效果最好的MHT0308菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果（圖3）表明，MHT0308菌株子代拮抗病原菌能力在第10代之前無顯著差異，其對(duì)獼猴桃軟腐病的抑制率僅從第1代的87.71%變?yōu)榈?0代的86.64%，第15代開始對(duì)獼猴桃軟腐病菌的拮抗能力稍有下降，其抑菌率為85.02%，MHT0308菌株一直繼代培養(yǎng)至20代時(shí)仍有較強(qiáng)的拮抗能力，抑菌率為84.92%。試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然MHT0308菌株隨著繼代數(shù)的增加，其拮抗能力稍有下降，但對(duì)獼猴桃軟腐病菌的拮抗能力總體趨于穩(wěn)定，故可判定MHT0308菌株對(duì)獼猴桃軟腐病的拮抗能力遺傳較穩(wěn)定，有利于菌株的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用。

2. 3 MHT0308菌株發(fā)酵液的抑菌特性

菌落直徑法測定結(jié)果（表2、圖4-a和圖4-b）顯示，MHT0308菌株的含菌和無菌發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病菌均具有抑制作用，其中含菌發(fā)酵液的抑菌效果較好，獼猴桃軟腐病菌受到明顯抑制，其抑菌率為88.13%，而無菌發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑制率也在80.00%以上。表明MHT0308菌株發(fā)酵液中產(chǎn)生的某些次生代謝產(chǎn)物具有主要抑菌活性，此特性有利于該菌株的下一步應(yīng)用研發(fā)。

2. 4 MHT0308菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病的離體防效

MHT0308菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病的離體防效試驗(yàn)結(jié)果（表3和圖5）表明，其發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病有明顯的防治效果，噴霧MHT0308菌株發(fā)酵液后再接種獼猴桃軟腐病菌處理的發(fā)病程度很輕，而未噴霧MHT0308菌株發(fā)酵液處理第3 d開始顯癥時(shí)，其針刺處仍然光潔無顯癥;第10 d未噴霧MHT0308菌株發(fā)酵液處理的病情指數(shù)達(dá)78.90，且獼猴桃果實(shí)開始從里向外軟爛變色，而經(jīng)MHT0308菌株發(fā)酵液處理的獼猴桃果實(shí)只有輕微顯癥，其病情指數(shù)僅為10.30，對(duì)獼猴桃軟腐病的防效達(dá)87.00%，且經(jīng)發(fā)酵液處理過的獼猴桃果實(shí)連續(xù)存放15 d以上不腐爛?？梢?，MHT0308菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃果實(shí)軟腐病有防效，可進(jìn)一步研發(fā)作為獼猴桃儲(chǔ)藏期病害的有效生防菌劑。

2. 5 MHT0308菌株鑒定結(jié)果

2. 5. 1 形態(tài)特征鑒定結(jié)果 MHT0308菌株在PDA培養(yǎng)基上菌絲呈放射狀生長，其生長速度快，3 d即可長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，隨后形成分生孢子且開始產(chǎn)生色素，7 d左右形成正面淺綠色至綠色的菌落，菌落背面顏色較淺，若遇脅迫可產(chǎn)生黃色或黃綠色色素（圖6-a）。菌絲無色，有隔，可生長形成無色分生孢子梗（圖6-b）;其上產(chǎn)生產(chǎn)孢小梗，產(chǎn)孢小梗常對(duì)生或輪生形成輪枝狀結(jié)構(gòu)（圖6-c）;上著生大量分生孢子，橢圓形或卵圓形大小，2.2～3.5 μm×2.5～3.2 μm，產(chǎn)生初期無色，后期淺欖黃色或淺欖綠色（圖6-d）。綜上所述，MHT0308菌株的培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征與哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）一致。

2. 5. 2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 PCR擴(kuò)增MHT0308菌株的ITS全長序列，大小為580 bp。將測序結(jié)果與GenBank中的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明，與其同源性最高的為木霉屬的哈茨木霉真菌及其有性態(tài)（Hypocrea lixii），相似性均在99%以上。再根據(jù)ITS序列利用MEGA 5.0對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行序列分析并構(gòu)建木霉屬的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖7）顯示，MHT0308菌株與哈茨木霉在同一分支。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定結(jié)果可確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum）。

3 討論

篩選有益微生物對(duì)水果等果實(shí)類采后病害進(jìn)行生物防治是國內(nèi)外近年來的新研究領(lǐng)域。研究表明，酵母菌（Pichia）對(duì)梨灰霉病（Botytis cinerea）、桃子根霉腐爛（Rhizopus oryzae）、柑橘和蘋果青霉病（Penicillium sp.）等有很好的防治效果（Lu et al.，2013;Lutc et al.，2013;Xu et al.，2013）;芽孢桿菌（Bacillus）對(duì)柑橘的7種不同病原真菌具有抗菌活性，且從中提取出伊草枯菌素A對(duì)柑橘采后病害有抑制效果（Arrebola et al.，2009），另外，芽孢桿菌對(duì)果實(shí)采后炭疽病和擬莖點(diǎn)霉軟腐病、青曲霉病等有防效（Hao et al.，2011;Mohamed et al.，2011）。在前人的研究報(bào)道中，針對(duì)水果果實(shí)采后病害的生防菌資源主要集中在酵母菌和芽孢桿菌等方面，可用于果實(shí)采后病害防控的真菌類菌株資源報(bào)道相對(duì)較少。本研究以西南地區(qū)致獼猴桃軟腐病的主要為害病原菌擬莖點(diǎn)霉菌作為靶標(biāo)病原菌所篩選獲得的MHT0308菌株屬于哈茨木霉真菌，對(duì)豐富獼猴桃軟腐病生防菌資源庫及利用木霉菌防治獼猴桃軟腐病具有重要意義。但介于該病害在全國范圍內(nèi)的致病菌差異較明顯，因此下一步將開展MHT0308菌株對(duì)其他地區(qū)獼猴桃軟腐致病菌的廣譜拮抗試驗(yàn)，或在擴(kuò)大所篩靶標(biāo)病原菌范圍的基礎(chǔ)上找尋適用范圍更廣的高效生防菌株。

木霉不僅對(duì)植物病原真菌具有廣譜拮抗活性，部分還兼具促進(jìn)植物生長的作用（Altomare et al.，1999），同時(shí)可產(chǎn)生許多次生代謝產(chǎn)物如酶類、抗生素或抗菌肽、水溶性化合物等，對(duì)病原菌起生防作用（Howell，2002），是一類具有應(yīng)用價(jià)值的有益微生物。本研究的平板對(duì)峙中MHT0308菌株對(duì)獼猴桃軟腐病病原菌有明顯的競爭和拮抗作用，且其含菌和無菌發(fā)酵液對(duì)獼猴桃軟腐病菌均有抑制作用，說明該菌株可產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)。張承等（2016）發(fā)現(xiàn)采前噴施殼聚糖與生防菌代謝產(chǎn)物抗菌肽等制成的復(fù)合膜對(duì)獼猴桃軟腐病的防效達(dá)69.23%，提高了果實(shí)的抗病性，從而提高了獼猴桃耐貯性。結(jié)合MHT0308菌株可產(chǎn)生有效次生代謝產(chǎn)物這一特征，后續(xù)將進(jìn)一步重點(diǎn)研究該菌株的抗菌活性物質(zhì)，并對(duì)抑菌活性物質(zhì)的有效應(yīng)用及果實(shí)綠色保鮮技術(shù)進(jìn)行探索，從而為利用該菌開發(fā)新的生物農(nóng)藥提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

篩選出一株對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌引起的獼猴桃軟腐病有較強(qiáng)抑制作用的菌株MHT0308，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定MHT0308菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum），該菌株對(duì)獼猴桃軟腐病有較好的防治效果，可作為一種重要的生防資源菌用于獼猴桃軟腐病防治研究，具有一定的開發(fā)潛力。

致謝： 本文在獼猴桃軟腐病病原菌材料方面得到貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所吳石平老師和黃露老師的大力支持，特此致謝！

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（責(zé)任編輯 麻小燕）