常春衛(wèi)矛提取物體外及體內(nèi)抑菌作用的試驗(yàn)研究

羅宇東++++張強(qiáng)++++++蔣林++++++李娜

[摘要] 目的 研究常春衛(wèi)矛水提物、醇提物及5種不同溶劑提取物的抑菌活性。 方法 體外抑菌試驗(yàn)采用試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法，考察常春衛(wèi)矛水提物、醇提物及5種不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇）提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌的體外抑菌活性；體內(nèi)抑菌試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為指示菌種，小鼠灌胃分別給予常春衛(wèi)矛水提物、醇提物14 d，腹腔注射金黃色葡萄球菌，通過觀察小鼠死亡率衡量常春衛(wèi)矛提取物的體內(nèi)抑菌活性。 結(jié)果 體外抑菌試驗(yàn)顯示，常春衛(wèi)矛水提物及醇提物均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌有一定程度的抑制作用，5種不同溶劑提取物中，甲醇、正丁醇、乙醇乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌有一定程度的抑制作用，石油醚、氯仿提取物無明顯抑制作用。體內(nèi)抑菌試驗(yàn)顯示，常春衛(wèi)矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）劑量組、醇提物高劑量組（32.0 g/kg）有明顯降低金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）。 結(jié)論 常春衛(wèi)矛提取物具有一定程度的抑菌作用。

[關(guān)鍵詞] 常春衛(wèi)矛；提取物；體內(nèi)；體外；抑菌作用

[中圖分類號(hào)] R282[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）06（c）-0009-04

Experimental study in vitro and in vivo antibacterial effect of the extract of Euonymus hederaceus

LUO Yu-dong ZHANG Qiang▲ JIANG Lin LI Na

Pharmaceutical Factory of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China

[Abstract] Objective To investigate antibacterial activity of Euonymus hederaceus water extract,alcohol extract and 5 different solvent extracts. Methods In vitro inhibitory effect of Euonymus hederaceus water extract,alcohol extract and different solvent extracts(petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol,methanol)on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella and Pseudomonas aeruginosa were assayed by the method of tube double dilution method combined with agar plate method.In vivo inhibitory effect of the Euonymus hederaceus water and alcohol extraction with Staphylococcus aureus as index,the mice were given Euonymus hederaceus water and alcohol extraction by gavages for 14 days,then the mice were intraperitoneally injected with Staphylococcus aureus suspension.In vivo antibacterial activity of Euenymus hederaceus watder and alcohol extraction was detected respectively by observing the mortality rate in mice. Results Bacteriostatic test in vitro showed that Euonymus hederaceus water extract and alcohol extract on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella,Pseudomonas aeruginosa had certain degree of restrained.Different solvent extracts of methanol,ethanol,n-butanol,ethyl acetate extract against Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella,Pseudomonas aeruginosa had certain degree of restrained,no obvious inhibition effect of petroleum ether,chloroform extract.Bacteriostatic test in vivo showed that the water extract of Euonymus hederaceus low dose group(16.0 g/kg),high dose group(32.0 g/kg),high dose group of alcohol extract(32.0 g/kg)of the death rate of mice infected with Staphylococcus aureus was markedly decreased. Conclusion Euonymus hederaceus extract has a certain degree of bacteriostatic action.

[Key words] Euonymus hederaceus;Extraction;In vitro;In vivo;Bacteriostatic action

常春衛(wèi)矛為衛(wèi)矛科植物常春衛(wèi)矛（Euonymus hederaceus Champ.Ex Benth）的根、樹皮或葉，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血止血的功效，臨床用于治療腎虛腰痛、慢性腹瀉、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)。國內(nèi)已開展了常春衛(wèi)矛抗凝血、活血化瘀、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗疲勞、免疫增強(qiáng)等作用的藥理研究，但有關(guān)其抑菌作用的研究尚未見報(bào)道[1-3]。本研究觀察常春衛(wèi)矛提取物的抑菌活性，為進(jìn)一步拓寬常春衛(wèi)矛的應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

常春衛(wèi)矛采自廣西壯族自治區(qū)資源縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室韋松基教授鑒定為衛(wèi)矛科植物常春衛(wèi)矛的地上部分。陽性藥：阿莫西林膠囊[中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，國藥準(zhǔn)字H13021770，批號(hào)：257130477，規(guī)格：0.5 g]。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)：111205）。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)：121227）。培養(yǎng)基使用時(shí)按說明書配制。

1.2 儀器

HV-50自動(dòng)高壓滅菌器（日本Hirayama Manufacturing Corporation）、SW-CJ型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）、SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、AM100電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、恒溫水浴鍋（上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 菌株與動(dòng)物

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、沙門菌（Salmonella）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，雌雄各半，清潔級，由廣西醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK桂2009-0002。

1.4 方法

1.4.1 常春衛(wèi)矛提取物的制備①常春衛(wèi)矛水提物（A）：藥材粉碎，用水煎煮2次，1 h/次，煎液過濾，濾液濃縮至浸膏（A），每克浸膏相當(dāng)于2.0 g藥材量，備用。②常春衛(wèi)矛醇提物（B）：藥材粉碎，75%回流提取2次，1 h/次，提取液過濾，回收乙醇，濃縮至浸膏（B），每克浸膏相當(dāng)于2.0 g藥材量，備用。③常春衛(wèi)矛五倍位提取物（C～G）：藥材打成細(xì)粉，用60%乙醇浸泡3次，浸泡7 h/次，浸泡液過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無醇味，濃縮液再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取3次，合并萃取液，抽濾，濾液回收溶劑后減壓干燥，分別得到常春衛(wèi)矛石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物；萃取后的剩余稠膏用甲醇溶解，蒸干，為甲醇提取物；每克甲醇（C）、正丁醇（D）、乙酸乙酯（E）、氯仿（F）、石油醚（G）提取物分別相當(dāng)于14、50、300、200、700 g藥材量。以上提取物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供，臨用時(shí)配制成試驗(yàn)所需濃度。

1.4.2 常春衛(wèi)矛提取物體外抑菌試驗(yàn)［4-11］①菌液的制備：挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及沙門菌4個(gè)試驗(yàn)菌株的普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落數(shù)個(gè)，分別接種于2 ml肉湯管中，37℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為1×106 CFU/ml，備用。②抑菌試驗(yàn)：試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法測定常春衛(wèi)矛系列提取物的最小抑菌濃度；取裝有1 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管若干支，按二倍稀釋法，將常春衛(wèi)矛提取物A、B、C、D、E、F、G從第1管進(jìn)行稀釋至第7管，稀釋倍數(shù)分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，藥物濃度分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25 mg提取物/ml，每管加相應(yīng)受試標(biāo)準(zhǔn)菌液各50 μl，充分混均，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，考慮到提取物顏色較深，細(xì)菌生長后肉眼難以觀察或觀察的結(jié)果易出現(xiàn)偏差，因此再從每一管中取培養(yǎng)物10 μl轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，用L棒涂布，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，以不生長菌落的最高藥物稀釋度為該藥物對該種細(xì)菌的最小抑菌濃度；平行做3次，以2次或3次相同結(jié)果為準(zhǔn)。

1.4.3 常春衛(wèi)矛提取物體內(nèi)抑菌試驗(yàn)[12-13]①體內(nèi)抑菌的預(yù)試驗(yàn)：取金黃色葡萄球菌備用菌液置無菌瓶中，用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度（1×103～1×108 CFU/ml）的細(xì)菌懸液，將上述細(xì)菌懸液分別注射于小鼠腹腔，每濃度組6只，注射量0.5 ml，觀察小鼠4 d內(nèi)的死亡情況，選定使小鼠死亡率達(dá)80%的菌液濃度為試驗(yàn)注射濃度。②常春衛(wèi)矛提取物體內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌的試驗(yàn)：取體質(zhì)量18～22 g的小鼠70只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，分別為模型對照組，常春衛(wèi)矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）劑量組，常春衛(wèi)矛醇提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）劑量組，阿莫西林膠囊組（0.260 g/kg），每組16只。模型對照組灌胃等體積的蒸餾水，其余各組則灌胃相應(yīng)的藥物劑量。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥14 d后，腹腔注射預(yù)試驗(yàn)所確定的金黃色葡萄球菌接種濃度，觀察并統(tǒng)計(jì)4 d內(nèi)各組小鼠的死亡率，各組小鼠死亡率與模型對照組比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

常春衛(wèi)矛水、醇提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌有抑制作用，水提物的最小抑菌濃度分別為2.5 mg提取物/ml、5 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml；醇提物的最小抑菌濃度分別為5 mg提取物/ml、2.5 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml（表1）。常春衛(wèi)矛5種溶劑提取物中，甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌有抑制作用，甲醇提取物的最小抑菌濃度分別為5 mg提取物/ml、2.5 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml；正丁醇提取物的最小抑菌濃度分別為5 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、20 mg提取物/ml；乙酸乙酯提取物的最小抑菌濃度分別為10 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、20 mg提取物/ml；氯仿、石油醚提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌無明顯抑制作用（表2）。

表2 常春衛(wèi)矛5種溶劑提取物對各菌株最小抑菌濃度測定的結(jié)果

（mg提取物/ml）

2.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果

體內(nèi)抑菌的預(yù)試驗(yàn)確定腹腔注射金黃色葡萄球菌接種濃度為1×107 CFU/ml（表3）。常春衛(wèi)矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）劑量組及醇提物高（32.0 g/kg）劑量組有明顯降低金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）（表4）。

表3 小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果

表4 常春衛(wèi)矛提取物對金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護(hù)作用

與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

衛(wèi)矛屬植物是一類重要的天然藥用資源，在世界各地均有分布，在我國民間作為藥物使用有悠久的歷史，主要用于抗腫瘤、抗炎、抗菌等[14]。本文對常春衛(wèi)矛提取物的體內(nèi)及體外抑菌作用進(jìn)行試驗(yàn)研究，體外抑菌試驗(yàn)采用試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法，考察常春衛(wèi)矛水提物、醇提物及5種不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇）提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌的體外抑菌活性，結(jié)果表明，常春衛(wèi)矛水提物及醇提物均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌有一定程度的抑制作用，5種不同溶劑提取物中，甲醇、正丁醇、乙醇乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌有一定程度的抑制作用，石油醚、氯仿提取物無明顯抑制作用；體內(nèi)抑菌試驗(yàn)，常春衛(wèi)矛水提物低、高劑量組及醇提物高劑理組有明顯降低金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）。

常春衛(wèi)矛含有衛(wèi)矛醇、齊敦果烷型五環(huán)三萜等成分，國內(nèi)有關(guān)藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少[15-17]。本研究的體外抑菌試驗(yàn)提示，常春衛(wèi)矛的水、醇、高極性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果較好，非極性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明顯。常春衛(wèi)矛是具有研究、開發(fā)價(jià)值的廣西壯、瑤特色藥材，但抑菌作用還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-03-22本文編輯：李亞聰）

常春衛(wèi)矛含有衛(wèi)矛醇、齊敦果烷型五環(huán)三萜等成分，國內(nèi)有關(guān)藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少[15-17]。本研究的體外抑菌試驗(yàn)提示，常春衛(wèi)矛的水、醇、高極性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果較好，非極性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明顯。常春衛(wèi)矛是具有研究、開發(fā)價(jià)值的廣西壯、瑤特色藥材，但抑菌作用還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-03-22本文編輯：李亞聰）

常春衛(wèi)矛含有衛(wèi)矛醇、齊敦果烷型五環(huán)三萜等成分，國內(nèi)有關(guān)藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少[15-17]。本研究的體外抑菌試驗(yàn)提示，常春衛(wèi)矛的水、醇、高極性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果較好，非極性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明顯。常春衛(wèi)矛是具有研究、開發(fā)價(jià)值的廣西壯、瑤特色藥材，但抑菌作用還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-03-22本文編輯：李亞聰）