廣西崇左市甘蔗梢腐病病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定

郭強(qiáng) 馬文清 陳海生 閉德金 施澤升 彭崇 秦昌鮮 何洪良 唐利球

摘要：【目的】明確廣西崇左市甘蔗梢腐病病原菌種類及其生物學(xué)特性，為甘蔗梢腐病的綜合防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳圆杉詮V西崇左市甘蔗種植區(qū)的甘蔗梢腐病病葉為材料，采用組織分離法進(jìn)行病原菌單孢分離，結(jié)合科赫法則進(jìn)行致病性測(cè)定，通過形態(tài)學(xué)特征觀察及rDNA-ITS序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行種類鑒定;應(yīng)用十字交叉法進(jìn)行病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定?！窘Y(jié)果】分離獲得的病原菌rDNA-ITS序列長(zhǎng)度為496 bp，與輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）的同源性達(dá)99%，與輪枝鐮刀菌（登錄號(hào)EU047）的遺傳關(guān)系最近。病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，該菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，致死溫度為70 ℃;菌絲生長(zhǎng)最適pH為8，光暗交替條件下生長(zhǎng)較快;菌絲生長(zhǎng)最適氮源為胰蛋白胨，最適碳源為甘露醇。【結(jié)論】引起廣西崇左市甘蔗梢腐病的病原菌是輪枝鐮刀菌，該菌適宜在高溫高濕、弱堿性、光暗交替及富含有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件下生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞： 甘蔗梢腐病;輪枝鐮刀菌;生物學(xué)特性;廣西崇左市

中圖分類號(hào)： S432.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1728-07

Isolation identification and biological characteristics of the pathogen causing sugarcane pokkah boeng

in Chongzuo， Guangxi

GUO Qiang， MA Wen-qing， CHEN Hai-sheng， BI De-jin，SHI Ze-sheng，PENG Chong，

QIN Chang-xian， HE Hong-liang， TANG Li-qiu*

（Guangxi South Subtropical Agricultural Science Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Longzhou， Guangxi? 532415， China）

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate species and biological characteristics of the pathogen causing sugarcane pokkah boeng in Chongzuo，Guangxi in order to provide scientific basis for controlling sugarcane pokkah boeng. 【Method】Sugarcane leaves with sugarcane pokkah boeng in Chongzuo sugarcane planting areas were collected. Conventional tissue separation was applied to isolate monospore from the pathogen，and the pathogenicity of the pathogen were investigated. Based on morphological characteristics observation and analysis of rDNA-ITS sequence，the pathogen of sugarcane pokkah boeng was identified. Biological characteristics of the pathogen were determined with crossing methods. 【Result】The rDNA-ITS sequence of tested strains was 496 bp in length，which showed 99% homology with Fusarium verticillioides. It had the closest genetic relationship with Fusarium verticillioides（accession number EU047）. According to the biological characteristics test， the pathogen could grow with an optimal condition at 28 ℃，and the lethal temperature was 70 ℃. The best cultural condition for mycelial growth was pH 8，12 h dark+12 h light. The best nitrogen sources for the pathogen growth was tryptone，and the best carbon sources was mannito. 【Conclusion】The pathogen causing sugarcane pokkah boeng in Chongzuo is identified as F. verticillioides. The optimal growth conditions for F. verticillioides is high temperature， high humidity， weak alkaline， alternating light and dark and full of organic nutrition.

Key words： sugarcane pokkah boeng; Fusarium verticillioides; biological characteristics; Chongzuo， Guangxi

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharum officinarum L.）為禾本科單子葉植物，是最主要的糖料作物之一。我國作為世界第三大蔗糖生產(chǎn)國，蔗糖總產(chǎn)量達(dá)1367.9萬t/年，占全國食糖總產(chǎn)量的92.2%以上（李楊瑞和楊麗濤，2009）?？梢?，甘蔗生產(chǎn)對(duì)國民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。然而，甘蔗生產(chǎn)長(zhǎng)期受到病害的威脅，嚴(yán)重影響甘蔗蔗莖產(chǎn)量及蔗糖分，對(duì)蔗糖產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，嚴(yán)重阻礙了蔗糖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。甘蔗梢腐病是甘蔗伸長(zhǎng)期最主要的一種真菌性病害，該病主要發(fā)生在高溫高濕的7—9月，易感病品種發(fā)病率高達(dá)70%～90%，抗病品種發(fā)病率也有5%～30%（張玉娟，2009）;受梢腐病危害的蔗田，其產(chǎn)量損失率為30.2%～48.5%，甘蔗糖分下降2.63%～5.21%（單紅麗等，2018）。梢腐病主要危害甘蔗梢部心葉，發(fā)病較輕時(shí)植株可恢復(fù)生長(zhǎng)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)致使生長(zhǎng)點(diǎn)組織軟化壞死，造成頂腐，最終導(dǎo)致植株整株死亡（盧文浩，2007）。近年來，我國蔗區(qū)頻繁暴發(fā)大面積甘蔗梢腐病危害，尤其是被譽(yù)為“中國糖都”的廣西崇左市甘蔗種植區(qū)，梢腐病已成為制約甘蔗生產(chǎn)的主要因素。因此，明確崇左蔗區(qū)甘蔗梢腐病病原菌種類，并初步研究其生物學(xué)特性，對(duì)甘蔗梢腐病防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甘蔗梢腐病最早發(fā)現(xiàn)于爪哇地區(qū)，并確定是由鐮刀菌（Fusarium）引起的一種真菌性病害，目前該病已傳遍世界所有甘蔗種植國家和地區(qū)（Siti，2007）。張玉娟（2009）采用ITS-PCR、ATP-PCR和Effd-PCR 3種方法對(duì)甘蔗梢腐病菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，菌株ATP片段與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）相比僅有79%的同源性，菌株Effd片段與藤倉鐮孢菌（F. fujikuroi）的同源性為92%，菌株ITS序列與串珠赤霉菌（Gibberella moniliformis）具有100%的同源性;Lin等（2014）分離獲得101株甘蔗梢腐病病原菌株，經(jīng)rDNA-ITS序列分析，結(jié)果表明，90%的菌株為輪枝鐮刀菌（F. verticillioides），7%為層生鐮刀菌（F. proliferatum）;何姍珊等（2016）采用ITS特異性擴(kuò)增和序列分析，確定甘蔗梢腐病病原菌屬于鐮刀菌屬;Bao等（2016）在廣西百色市調(diào)查甘蔗病害時(shí)發(fā)現(xiàn)梢腐病危害，采集病葉進(jìn)行病原菌分離鑒定，結(jié)果表明，分離獲得的病原菌株為尖孢鐮刀菌。這是我國首次發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌引起甘蔗梢腐病，與輪枝鐮刀菌和層生鐮刀菌相比，尖孢鐮刀菌能在較短時(shí)間內(nèi)引起頂腐，最終造成整株死亡?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于廣西崇左蔗區(qū)甘蔗梢腐病病原的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道，病原菌生物學(xué)特性尚缺乏相關(guān)信息?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)采集自廣西崇左市甘蔗種植區(qū)甘蔗梢腐病病葉進(jìn)行單孢分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征觀察及rDNA-ITS序列分析，并在此基礎(chǔ)上研究不同溫度、pH、碳源、氮源和光照條件下病原菌的生物學(xué)特性，明確崇左蔗區(qū)甘蔗梢腐病病原及其生物學(xué)特性，為崇左蔗區(qū)甘蔗梢腐病的綜合防治和深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 病樣 于2018年6月從廣西崇左市甘蔗種植區(qū)采集典型的甘蔗梢腐病病葉樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行拍照，備用。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1000 mL;馬鈴薯葡萄糖水（PDW）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200.00 g、葡萄糖20.00 g、蒸餾水1000 mL;查氏培養(yǎng)基：蔗糖30.00 g、NaNO3 2.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1000 mL。

1. 1. 3 接種材料 生長(zhǎng)至3～4片葉的健康ROC22種苗。

1. 2 病原菌分離

從廣西崇左市甘蔗種植區(qū)采集發(fā)病的甘蔗梢腐病病葉，按組織分離法進(jìn)行病原菌分離（Lin et al.，2014）。取病健交界處葉片，剪切成大小約0.5 cm×0.5 cm的方塊，經(jīng)70%酒精消毒10 s，然后轉(zhuǎn)移至0.1%升汞中滅菌40 s，以無菌水沖洗3遍后轉(zhuǎn)移至滅菌的濾紙上自然晾干，最后轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～3 d。待菌絲長(zhǎng)出后，用移液槍挑取菌落邊緣菌絲劃線純化培養(yǎng)，純化3代。將分離獲得的病原菌菌株用50%甘油保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1. 3 病原菌致病性測(cè)定

根據(jù)科赫法則鑒定病原菌的致病性。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌菌株進(jìn)行活化，挑取菌落邊緣的菌絲接種至PDW培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3～4 d，用離心法收集孢子并去除培養(yǎng)基，用無菌水配制成1×107個(gè)/mL的孢子懸液;用注射器吸取200 μL孢子懸液注射接種到ROC22幼苗的心葉處，每處理5個(gè)重復(fù)，以無菌水為對(duì)照;將接種后的甘蔗幼苗置于28 ℃、濕度在85%以上的條件下培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。將發(fā)病葉片再進(jìn)行分離、純化，對(duì)比獲得的病原菌與原病原菌菌落形態(tài)、菌絲顏色、分生孢子形態(tài)等是否一致。

1. 4 病原菌鑒定

1. 4. 1 形態(tài)學(xué)鑒定 挑取純化好的菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待菌落幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，觀察菌落形態(tài)、顏色、菌絲疏密程度等形態(tài)特征，并挑取菌絲制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態(tài)。

1. 4. 2 分子生物學(xué)鑒定 挑取菌落邊緣菌絲接種至PDW培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3～4 d，利用離心法收集菌體，采用SDS法提取病原菌基因組DNA（Lin et al.，2014）。采用真菌rDNA-ITS通用引物（上游引物ITS1：5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4：5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Premix Taq（TaKaRa）12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。選取鐮刀菌屬不同種病原菌的rDNA-ITS序列，通過MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1. 5. 1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將保存于 -80 ℃超低溫冰箱的病原菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊接種至PDA培養(yǎng)基中央，分別置于10、15、20、25、28、30、35和40 ℃共8個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)，每溫度處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，所得結(jié)果減去菌餅直徑7 mm（朱迎迎等，2016）。

1. 5. 2 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)滅菌后的PDA培養(yǎng)基，配制成pH分別為5、6、7、8和9的PDA培養(yǎng)基（番華彩等，2018）。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊接種至不同pH的PDA培養(yǎng)基中央，每處理5個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)。菌落直徑測(cè)量方法與1.5.1相同。

1. 5. 3 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將保存于? ? ?-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊接種至PDA培養(yǎng)基中央，分別置于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替處理3個(gè)條件下，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。菌落直徑測(cè)量方法與1.5.1相同。

1. 5. 4 氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參考胡美姣等（2013）的方法并略加修改。以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制以酵母粉、蛋白胨、NaNO3、硫酸銨和甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基，以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊接種至不同氮源培養(yǎng)基中央，每處理5個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)。菌落直徑測(cè)量方法與1.5.1相同。

1. 5. 5 碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參考胡美姣等（2013）的方法并略加修改。以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制以D-果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基，以不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病源菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊接種至不同碳源培養(yǎng)基中央，每處理5個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)。菌落直徑測(cè)量方法與1.5.1相同。

1. 5. 6 病原菌致死溫度 參照孫嘉曼等（2016）的方法并略有改動(dòng)。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，用直徑7 mm的打孔器取活化病原菌菌絲塊置于含10 mL無菌水的離心管中，然后分別置于45、50、55、60、65、70和75 ℃水浴中加熱10 min，取出菌絲塊轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，每處理5個(gè)重復(fù)，觀察菌絲有無生長(zhǎng)。確定致死溫度范圍后，再按1 ℃梯度進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定致死溫度。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離及其致病性測(cè)定結(jié)果

將分離、純化后獲得的菌株配制成1×107個(gè)/mL的孢子懸液，根據(jù)科赫法則將菌株孢子懸液回接至健康的ROC22幼苗心葉處，接種5 d后，心葉開始變黃，出現(xiàn)紅褐色病斑，病斑不斷擴(kuò)散，導(dǎo)致心葉腐爛壞死（圖1-A）;對(duì)照處理不發(fā)病。接種分離菌株后的發(fā)病癥狀與大田自然發(fā)病癥狀相似（圖1-B）。采集接種后發(fā)病葉片再次進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得的分離株與原接種菌株的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)完全一致，證明分離獲得的菌株是甘蔗梢腐病的致病菌。

2. 2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在PDA培養(yǎng)基上，菌落正面氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲稠密，呈白色（圖1-C）;菌落背面初期為白色，2～3 d后呈黃色（圖1-D）。分生孢子可分為大型分生孢子和小型分生孢子，分生孢子梗頂端分離產(chǎn)生小型分生孢子，小型分生孢子呈卵形，無隔膜，小型分生孢子逐漸長(zhǎng)大形成大型分生孢子，大型分生孢子有隔膜，呈鐮刀狀（圖1-E）;菌絲分枝不規(guī)則，有分隔（圖1-F）。

2. 3 病原菌分子序列分析結(jié)果

利用ITS通用引物擴(kuò)增病原菌的rDNA-ITS序列，獲得長(zhǎng)度為496 bp的片段。將病原菌菌株的rDNA-ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示病原菌菌株（LZ11-2）的rDNA-ITS序列與輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）的同源性為99%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）顯示，病原菌菌株與F. verticillioides（登錄號(hào)EU047）的遺傳關(guān)系最近。綜合病原菌的形態(tài)特征及分子鑒定結(jié)果，確定引起廣西崇左市甘蔗梢腐病的病原菌為輪枝鐮刀菌。

2. 4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，病原菌菌株在10～35 ℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，在25～30 ℃內(nèi)生長(zhǎng)較好，最適溫度為28 ℃（平均菌落直徑為79.60 mm）;不同溫度條件對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)影響較大，在28和30 ℃下病原菌菌落直徑與其他溫度處理差異顯著（P<0.05，下同），但二者間菌落直徑差異不顯著（P>0.05，下同）;10 ℃下，病原菌菌株第3 d才開始生長(zhǎng)，生長(zhǎng)非常緩慢，平均生長(zhǎng)速度為3.32 mm/d;40 ℃下菌絲完全不生長(zhǎng)。

2. 4. 2 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖4-A）表明，病原菌菌株對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，菌絲在pH 5～9內(nèi)均能生長(zhǎng)，其中最適pH為8（平均菌落直徑為83.83 mm），且與其他處理間達(dá)顯著差異水平;對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最大的pH為5，平均菌落直徑為70.83 mm，與其他pH處理間達(dá)顯著差異水平，說明病原菌更適合在弱堿性的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2. 4. 3 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖4-B）表明，病原菌菌絲在12 h光暗交替條件下生長(zhǎng)速度最快（平均菌落直徑為82.33 mm），且與連續(xù)光照和連續(xù)黑暗處理間均達(dá)顯著差異水平，而連續(xù)光照和連續(xù)黑暗處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)無明顯影響，二者菌落直徑差異不顯著。

2. 4. 4 氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌在6種不同氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中在以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，平均菌落直徑為82.56 mm，顯著高于其他氮源處理;其次是以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基，平均菌落直徑為79.88 mm;菌絲生長(zhǎng)最慢的是以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基，平均菌落直徑為57.30 mm，且與其他處理相比均達(dá)顯著差異水平;在不加氮源的CK中，平均菌落直徑為78.40 mm，但其菌絲非常稀薄，無氣生菌絲（表1）。不同氮源的培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌落顏色也有影響，以甘氨酸、硫酸銨和硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基，其菌落呈白色;而在以蛋白胨和酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中，菌落呈黃色，與其在PDA培養(yǎng)基中顏色相同;在不加氮源的CK中，菌落呈紫紅色。

2. 4. 5 碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌在6種不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，平均菌落直徑為79.10 mm，顯著高于其他處理;其次為可溶性淀粉和葡萄糖，兩者間無顯著差異;蔗糖、D-果糖和CK處理稍弱，三者間無顯著差異，但CK處理菌落稀薄，無氣生菌絲生成，其他處理菌落致密，呈白色（表1）。

2. 4. 6 病原菌致死溫度 病原菌菌絲在45、50、55、60、65、70和75 ℃ 7個(gè)溫度梯度下分別預(yù)處理10 min，培養(yǎng)10 d后觀察發(fā)現(xiàn)45、50、55、60和65 ℃ 5個(gè)處理的病原菌菌絲均能正常生長(zhǎng)，而70和75 ℃處理的病原菌菌絲不能生長(zhǎng)，因此初步確定病原菌致死溫度在65～70 ℃;進(jìn)一步將病原菌置于66、67、68和69 ℃ 4個(gè)溫度下預(yù)處理10 min，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2 d后，4個(gè)溫度處理下病原菌菌絲均能正常生長(zhǎng)，最終確定病原菌致死溫度為70 ℃。

3 討論

本研究對(duì)采集自廣西崇左市甘蔗種植區(qū)的甘蔗梢腐病病葉進(jìn)行病原菌分離及純化培養(yǎng)，運(yùn)用科赫法則進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定，確定引起廣西崇左市甘蔗梢腐病的病原菌為輪枝鐮刀菌。據(jù)研究報(bào)道，引起甘蔗梢腐病的鐮刀菌種類繁多，其中包括F. moniliforme（Siti，2007）、輪枝鐮刀菌（Mohammadi et al.，2012）和層生鐮刀菌（Khani et al.，2013）等，但不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌不同，我國發(fā)現(xiàn)的甘蔗梢腐病病原菌主要包括輪枝鐮刀菌和層生鐮刀菌兩種，其中輪枝鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)種（Lin et al.，2014），本研究結(jié)果與之相符，分離獲得的菌株均為輪枝鐮刀菌，進(jìn)一步說明我國甘蔗梢腐病病原菌的優(yōu)勢(shì)菌為輪枝鐮刀菌。

輪枝鐮刀菌在向日葵（高婧，2016）、辣椒（劉丹，2016）、番茄（張斌等，2016）、水稻（陳宏州等，2018）和玉米（王芝涵等，2019）等作物上均有報(bào)道，但對(duì)其生物學(xué)特性的研究甚少。本研究對(duì)輪枝鐮刀菌生物學(xué)特性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其菌絲適應(yīng)生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，在10～35 ℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，在25～30 ℃內(nèi)生長(zhǎng)較好，最適溫度為28 ℃，與火龍果鐮刀菌果腐病病原菌（F. dimerum）（朱迎迎等，2016）和馬鈴薯干腐病病原菌（F. acuminatum）（劉麗萍和方鵬鵬，2017）對(duì)溫度的適應(yīng)范圍相似，符合甘蔗梢腐病于6—9月高溫高濕的氣候條件下大規(guī)模暴發(fā)的規(guī)律。病原菌菌絲對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，在pH 5～9范圍內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，其中最適pH為8，說明菌株在弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)最佳，與高婧（2016）對(duì)向日葵枯萎病病原菌生物學(xué)特性研究結(jié)果一致。

輪枝鐮刀菌與尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性有相同之處，適宜菌絲生長(zhǎng)的溫度均為5～35 ℃，光暗交替條件下更適合菌絲生長(zhǎng);但也有不同之處，表現(xiàn)為輪枝鐮刀菌的菌絲更適合在偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，而尖孢鐮刀菌在pH為6.26時(shí)生長(zhǎng)最快，即更適合在偏酸性條件下生長(zhǎng)（曲田麗和辛惠普，2003）。輪枝鐮刀菌引起的甘蔗梢腐病危害較輕，主要危害梢部葉片，導(dǎo)致其黃化扭曲，病菌對(duì)生長(zhǎng)點(diǎn)的影響較小，因此受害植株能迅速恢復(fù)生長(zhǎng);而尖孢鐮刀菌引起的甘蔗梢腐病危害較嚴(yán)重，主要危害生長(zhǎng)點(diǎn)，能在短時(shí)間內(nèi)造成植株生長(zhǎng)點(diǎn)壞死，導(dǎo)致整株植株死亡。

4 結(jié)論

引起廣西崇左市甘蔗梢腐病的病原菌為輪枝鐮刀菌，該菌適宜在高溫高濕、弱堿性、光暗交替及富含有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件下生長(zhǎng)。在對(duì)甘蔗梢腐病的防治中，要根據(jù)氣候條件的變化提早防治，防止該菌在有利的環(huán)境條件下暴發(fā)流行。

參考文獻(xiàn)：

陳宏州，楊紅福，姚克兵，束兆林，周華飛，莊義慶. 2018. 水稻惡苗病病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，45（6）：1356-1366. [Chen H Z，Yang H F，Yao K B，Shu Z L，Zhou H F，Zhuang Y Q. 2018. Identification of rice bakanae pathogens and indoor toxicity test of fungicides[J]. Journal of Plant Protection，45（6）：1356-1366.]

番華彩，郭志祥，白亭亭，徐勝濤，楊佩文，尹可鎖，鄭泗軍，潘艷華，李迅東，曾莉. 2018. 香蕉棒孢霉葉斑病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（3）：481-487. [Fan H C，Guo Z X，Bai T T，Xu S T，Yang P W，Yin K S，Zheng S J，Pan Y H，Li X D，Zeng L. 2018. Biological characteristics of pathogenic bacteria causing banana leaf spot disease[J]. Journal of Southern Agriculture，49（3）：481-487.]

高婧. 2016. 向日葵枯萎病菌的分離鑒定、致病力分化以及侵染過程的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué). [Gao J. 2016. The study on the pathogen isolation and identification，pathogenicity differentiation and infection process of sunflower wilt[D]. Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University.]

何姍珊，方位寬，經(jīng)艷，譚芳，韋永定，韋士評(píng)，梁朝旭，李鳴. 2016. 甘蔗梢腐病原菌分離純化與ITS序列鑒定[J]. 廣西糖業(yè)，（4）：10-14. [He S S，F(xiàn)ang W K，Jing Y，Tan F，Wei Y D，Wei S P，Liang C X，Li M. 2016. Isolation of sugarcane pokkah boeng pathogen and ITS sequence identification[J]. Guangxi Sugar Industry，（4）：10-14.]

胡美姣，楊波，李敏，楊冬平，蒲金基，張正科，高兆銀. 2013. 海南芒果果腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，34（8）：1564-1569. [Hu M J，Yang B，Li M，Yang D P，Pu J J，Zhang Z K，Gao Z Y. 2013. Identification and biological characteristics of mango fruit rot pathogen[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，34（8）：1564-1569.]

李楊瑞，楊麗濤. 2009. 20世紀(jì)90年代以來我國甘蔗產(chǎn)業(yè)和科技的新發(fā)展[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 22（5）： 1469-1476. [Li Y R，Yang L T. 2009. New developments in sugarcane industry and technologies in China since 1990s[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 22（5）： 1469-1476.]

劉丹. 2016. 甘肅省設(shè)施辣椒鐮刀菌根腐病病原鑒定及抗病種質(zhì)資源篩選[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué). [Liu D. 2016. Studies on pathogens and resistance to fusarium root rot on greenhouse pepper in Gansu，China[D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University.]

劉麗萍，方鵬鵬. 2017. 馬鈴薯干腐病鐮刀菌的分離及生物學(xué)特性研究[J]. 隴東學(xué)院學(xué)報(bào)，28（5）：62-66. [Liu L P，F(xiàn)ang P P. 2017. The isolation and biological characteristic of Fusarium associated with potato dry rot[J]. Journal of Longdong University，28（5）：62-66.]

盧文浩. 2007. 甘蔗梢腐病的發(fā)生及綜合防治措施[J]. 作物雜志，（2）：92. [Lu W H. 2007. The damage of sugarcanes pokkah boeng and the main control strategies[J]. Crops，（2）：92.]

曲田麗，辛惠普. 2003. 綠豆根腐病菌生物學(xué)特性研究[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，15（4）：109-114. [Qu T L，Xin H P. 2003. The biological characteristics of the root rot pathogens in mung[J]. Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University，15（4）：109-114.]

單紅麗，李文鳳，張榮躍，王曉燕，李婕，倉曉燕，尹炯，羅志明，黃應(yīng)昆. 2018. 甘蔗梢腐病暴發(fā)流行原因及產(chǎn)量糖分損失測(cè)定[J]. 中國糖料，40（3）：40-42. [Shan H L，Li W F，Zhang R Y，Wang X Y，Li J，Cang X Y，Yin J，Luo Z M，Huang Y K. 2018. Analysis on epidemic reason of sugarcane pokahh boeng and its losses on yield and sucrose content[J]. Sugar Crops of China，40（3）：40-42.]

孫嘉曼，張進(jìn)忠，韋弟，藍(lán)霞，郭文峰，盧江. 2016. 一種新的香蕉黑斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，46（1）：119-123. [Sun J M，Zhang J Z，Wei D，Lan X，Guo W F，Lu J. 2016. Identification and biological characterization of the pathogen causing a new black spot disease on Musa spp.[J]. Acta Phytophologica Sinica，46（1）：119-123.]

王芝涵，王春偉，高海馨，荊琦，余廷濠，王燕. 2019. 引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，35（3）：581-585. [Wang Z H，Wang C W，Gao H X，Jing Q，Yu T H，Wang Y. 2019. Development of loop-mediated isothermal amplification（LAMP） assay for the detection of the Fusarium graminearum causing ear rot of maize[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，35（3）：581-585.]

張斌，楊曉云，陳志誼. 2016. 番茄枯萎病致病鐮刀菌種類鑒定及優(yōu)勢(shì)種群的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，46（4）： 561-565. [Zhang B，Yang X Y，Chen Z Y. 2016. Identification of the pathogenic and dominant Fusarium species causing tomato Fusarium wilt[J]. Acta Phytophologica Sinica，46（4）： 561-565.]

張玉娟. 2009. 甘蔗梢腐病病原分子檢測(cè)及甘蔗組合、品種的抗病性評(píng)價(jià)[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué). [Zhang Y J. 2009. Molecular detection and resistance evaluation for pokkah boeng disease of sugarcane[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University.]

朱迎迎，高兆銀，李敏，陳亮，胡美姣. 2016. 火龍果鐮刀菌果腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，37（1）：164-171. [Zhu Y Y，Gao Z Y，Li M，Chen L，Hu M J. 2016. Identification and biological characteristics of dragon fruit（Hylocereus undatus Britt） fusarium rot pathogen[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，37（1）：164-171.]

Bao Y X，Sun H J，Li Y F，Duan Z Z. 2016. First report of Fusarium oxysporum isolate gx3 causing sugarcane pokkah boeng in Guangxi of China[J]. Plant Disease，100（8）：1785.

Khani K T，Alizadeh A，Nejad R F 2013. Pathogenicity of Fusarium proliferatum，a new causal agent of pokkah boeng in sugarcane[J]. Proceedings of the International Society Sugracane Technology，28：1-5.

Lin Z，Wei J J，Xu S Q，Guo Q，Wang X，Qiu Y X，Deng Z H，Huang J H，Charles A P，Chen B S，Chen R K，Zhang M Q. 2014. Species-specific detection and identification of Fusarium species complex，the causal agent of sugarcane pokkah boeng in China[J]. PLoS One，9（8）：e104195.

Mohammadi A，Nejad R F，Mofrad N N. 2012. Fusarium verticillioides from sugarcane，vegetative compatibility groups and pathogenicity[J]. Plant Protection Science，48（3）：80-84.

Siti N. 2007. Pathogenicity and aethiology of Fusarium species associated with pokkah boeng disease on sugarcane[D]. Penang：University Sains Malaysia.

（責(zé)任編輯 麻小燕）