基于SCoT分子標記的48份楊桃種質遺傳多樣性分析

歐景莉 朱楊帆 陳豪軍 周俊岸 陳燕 何江 寧琳 潘祖建 甘衛(wèi)堂

摘要：【目的】分析48份楊桃種質的遺傳多樣性，為楊桃種質資源的鑒定保護及開發(fā)利用提供理論依據?！痉椒ā繌?0條SCoT引物中篩選出擴增條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物，對從國內外收集的48份楊桃種質材料進行PCR擴增，統(tǒng)計分析電泳圖譜，利用Popgene 1.32計算其遺傳多樣性參數，采用NTSYSpc 2.1計算種質間的遺傳相似系數和遺傳距離，利用UPGMA法進行聚類分析，并根據遺傳相似系數進行主成分分析?！窘Y果】從60條SCoT引物中篩選出的11條引物共擴增出115條條帶，其中多態(tài)性條帶102條，占總條帶數的88.7%，每條SCoT引物擴增的總條帶數（TNB）和多態(tài)性條帶數（NPB）分別為10.45和9.27條，多態(tài)性比率（PPB）為70.00%～100.00%，平均為88.84%;多態(tài)性信息量（PIC）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性指數（H）和Shannon’s信息指數（I）的平均值分別為0.77、1.7758、0.4229和0.6061。48份楊桃種質間的遺傳相似系數為0.4957～0.9217，平均為0.6841。聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數0.6618處可將48份楊桃種質劃分為三大類群，第Ⅰ類群均為甜楊桃種質，第Ⅱ類群以酸楊桃種質為主，第Ⅲ類群以甜楊桃種質為主。主成分分析結果與聚類分析結果基本一致，均與楊桃的果實風味和種質來源高度相關?！窘Y論】楊桃種質資源具有較豐富的遺傳多樣性，且篩選獲得的SCoT引物對楊桃種質資源有較高的多態(tài)性檢測率，適用于楊桃種質資源鑒別及親緣關系分析。

關鍵詞： 楊桃;遺傳多樣性;SCoT標記;聚類分析;主成分分析

中圖分類號： S667.902.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1680-08

Genetic relationship analysis of 48 Averrhoa carambola L. germplasms based on SCoT marker

OU Jing-li， ZHU Yang-fan， CHEN Hao-jun*， ZHOU Jun-an， CHEN Yan， HE Jiang，NING Lin， PAN Zu-jian， GAN Wei-tang

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical support and reference for the identification，protection，development and utilization of Averrhoa carambola L. germplasm resources，the present study analyzed the genetic diversity of 48 A. carambola germplasms. 【Method】SCoT primers with rich polymorphism and clear amplified bands were screened out from 60 primers，the 48 A. carambola germplasm resources collected from home and abroad were amplified by PCR. The electrophoretogram was analyzed， and genetic diversity parameters were calculated by Popgene 1.32. Then the genetic similarity coefficient and genetic distance between different germplasms were calculated using NTSYSpc 2.1. The unweighted pair-group method with arithmetic mean（UPGMA） method was used for cluster analysis. Based on the genetic similarity，principal coordinate analysis was also carried out. 【Result】A total of 115 bands were amplified from 11 primers which screened out from 60 SCoT primers，including 102 polymorphic bands， accounting for 88.7% of the total. The total number of bands（TNB） and polymorphic bands（NPB） amplified from each primer were 10.45 and 9.27，respectively. The percentage of polymorphism bands（PPB） was 70.00%-100.00%，with an average of 88.84%.? The mean value of polymorphism information content（PIC）， effective number of alleles（Ne），Nei’s gene diversity（H） and Shannon’s information index（I） were 0.77， 1.7758，0.4229 and 0.6061，respectively. The genetic similarity coefficient between different A. ca-rambola germplasms was 0.4957-0.9217，and the average was 0.6841. According to the results of cluster analysis，48 A. carambola germplasms could be divided into three groups at the genetic similarity of 0.6618. All the A. carambola germplasms in groupⅠand Ⅲ belonged to sweet A. carambola，while groupⅡwas mainly acid A. carambola. The results of principal component analysis and cluster analysis were basically consistent， and both were highly related to the fruit flavor and germplasm sources. 【Conclusion】The genetic diversity of A. carambola germplasm resources is quite rich. SCoT marker has high polymorphism detection efficiency on A. carambola germplasm. It can be used for the identification and relationship analysis of A. carambola germplasms.

Key words： Averrhoa carambola L.; genetic diversity; SCoT marker; clustering analysis; principal component analysis

0 引言

【研究意義】楊桃（Averrhoa carambola L.）為熱帶亞熱帶水果，在我國已有1500多年的栽培歷史，廣西、廣東、福建、海南、臺灣和云南等?。▍^(qū)）均有較大面積栽培，其可加工成罐頭、蜜餞、果酒、果醬和蜜煉果膏等，滿足了人們對果品多樣化、營養(yǎng)化及保健化的需求（劉韜等，2011;劉鍇棟等，2013）。楊桃種質資源較豐富，其栽培品種多由實生變異而來，故品種（系）間的形態(tài)特征極其相似，易出現(xiàn)同物異名或同名異物的現(xiàn)象，難以科學準確鑒別。此外，由于歷史原因，一些地方品種的來源和親緣關系難以確認，給楊桃種質資源的科學保護及有效利用帶來了極大困難。因此，開展楊桃種質資源的遺傳多樣性及親緣關系分析，對楊桃的種質鑒定及有效開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目標起始密碼子多態(tài)性分子標記（SCoT）是一種基于翻譯起始位點的目的基因標記（Collard and Mackill，2009），其操作簡單、多態(tài)性高、重復性好、引物通用性強，能有效產生與性狀連鎖的位點，可檢測出不同基因型供試材料間的微小差異，準確反映種質間親緣關系（蔡元保等，2014）。目前，SCoT分子標記已廣泛應用于龍眼（陳虎等，2010，2012）、芒果（Luo et al.，2010;羅聰，2012）、枇杷（韓國輝等，2011a;龍治堅，2013）、柑橘（韓國輝等，2011b;靳佳佳，2018）、葡萄（Guo et al.，2012;王發(fā)明等，2017）、番木瓜（楊祥燕等，2013）、澳洲堅果（蔡元保等，2013）、桃（陳紅等，2014）、梨（和世玉，2014;楊君祎，2015）、番石榴（何江，2017）和柿子（關長飛等，2019）等果樹的種質鑒定、基因差異表達、遺傳多樣性和親緣關系分析及指紋圖譜構建、功能基因挖掘等。隨著近年來分子標記的廣泛應用，已有多位學者利用RAPD分子標記對楊桃種質的遺傳多樣性進行研究。戴子云（2010）研究發(fā)現(xiàn)，17份廣東楊桃種質的地理起源與RAPD表型無相關性;劉韜等（2011）對17份福建楊桃品種進行遺傳多樣性分析，結果發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性;劉鍇棟等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，RAPD分子標記與形態(tài)標記所反映出的10份廣東地區(qū)楊桃品種間的遺傳多樣性具有較高一致性和可信度，因此，將二者結合起來可較好地揭示楊桃種質的遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】雖然前人已采用RAPD分子標記對我國部分地區(qū)楊桃種質的遺傳多樣性進行分析，但供試材料較少，種質來源不夠廣泛，無法為楊桃種質資源的有效利用提供系統(tǒng)全面的參考。且目前尚無利用SCoT分子標記對楊桃種質資源進行遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用SCoT分子標記對從國內外收集的48份楊桃種質資源進行遺傳多樣性分析，為楊桃種質資源的鑒定保護及開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的48份楊桃種質材料均采自廣西亞熱帶作物研究所楊桃種質資源圃，其來源地和原產地見表1。dNTPs、Taq DNA聚合酶和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司，其他化學試劑均購自南寧市茵興科技產品有限公司。主要儀器設備：PCR擴增儀（ABI Veriti，美國）、冷凍離心機（SIGMA 3-30K，德國）、核酸蛋白測定儀（Bio-Rad Smart Spec Plus，美國）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad UV-3，美國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 選取供試種質的健康無病害干凈嫩葉，用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用改良的CTAB法（陳虎等，2009）提取嫩葉DNA，并用核酸蛋白測定儀檢測其濃度和純度，最后統(tǒng)一稀釋至30 mg/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 SCoT引物篩選及PCR擴增 參考Collard和Mackill（2009）的設計原則設計60條SCoT引物（SCoT1～SCoT60），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用歐景莉等（2015）優(yōu)化的SCoT-PCR反應體系，以馬來西亞B17、廉江紅陽楊桃、貴港酸楊桃種質1和夏威夷甜楊桃等8份遺傳背景差異明顯的楊桃種質嫩葉DNA為模版，從60條SCoT引物中篩選出11條擴增條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物（表2），對48份供試楊桃種質進行PCR擴增。SCoT-PCR反應體系20.0 μL：2.5 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTPs，30 mg/L DNA模板，1.00 μmol/L引物，0.4 U Taq DNA聚合酶。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min;50 ℃ 1 min;72 ℃ 90 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并在Bio-Rad UV-3型凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

1. 3 統(tǒng)計分析

觀察電泳圖譜，按同一位置有無條帶進行賦值，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，最終形成（0，1）矩陣。利用Popgene 1.32計算遺傳多樣性參數，包括各引物的擴增總條帶數（Total number of bands，TNB）、多態(tài)性條帶數（Number of polymorphism bands，NPB）、多態(tài)性條帶百分比（Percentage of polymorphism bands，PPB）、有效等位基因數（Effective number of alleles，Ne）、多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s gene diversity，H）和Shannon’s信息指數（Shannon’s information index，I）。采用NTSYSpc 2.1計算不同種質間的遺傳相似系數和遺傳距離，利用UPGMA法進行聚類分析，并根據遺傳相似系數進行主成分分析（PCA）。

2 結果與分析

2. 1 遺傳多樣性分析結果

從60條SCoT引物中篩選出11條擴增條帶清晰、多態(tài)性好的引物，利用其對48份楊桃種質資源進行擴增，共得到115條條帶，其中多態(tài)性條帶數為102條，占總條帶數的88.7%，多態(tài)性較好（表3）。其中，引物SCoT49的擴增結果如圖1所示。每條引物的TNB為8～13條，NPB為7～12條;PPB為70.00%～100.00%，平均為88.84%，其中，引物SCoT44和SCoT51的PPB均為100.00%;PIC為0.72～0.82，平均為0.77;Ne為1.5752～1.8898，平均為1.7758;H為0.3161～0.4651，平均為0.4229;I為0.4576～0.6574，平均為0.6061，表明楊桃種質資源具有較豐富的遺傳多樣性，且篩選獲得的11條SCoT引物對楊桃種質資源有較高的多態(tài)性檢測率，適用于楊桃種質資源的鑒別及親緣關系分析。

2. 2 聚類分析結果

利用NTSYSpc 2.1計算48份楊桃種質材料間的遺傳相似系數，再利用UPGM法進行聚類分析，結果如圖2所示。48份楊桃種質的遺傳相似系數為0.4957～0.9217，平均為0.6841，其中，廣州野生甜楊桃種質2（17）（括號內為種質編號，下同）和廣州甜楊桃種質（18）間的遺傳相似系數最高，為0.9217，結合二者的采集地、樣本樹齡及農藝性狀、植物學性狀等數據信息，廣州野生甜楊桃種質2很有可能是廣州甜楊桃種質的實生后代;玉林甜楊桃種質1（1）與紅龍楊桃（9）間的遺傳相似系數最小，為0.4957，說明二者的遺傳差異最大，推測二者的原產地相隔較遠，在進化過程中產生明顯的基因差異。

在遺傳相似系數為0.6618處，可將48份楊桃種質材料劃分為三大類群。第Ⅰ類群包含27份甜楊桃種質，該類群在遺傳相似系數0.7020處又可分為A和B兩個亞群，其中，A亞群共14份種質，除馬來西亞B17（38）外，原產地為馬來西亞的種質（34、36、37、39和40）均聚在此亞群，A亞群還包含了2份玉林甜楊桃種質（1、2）、2份臺灣種質（10、41）及來源于惠州（11）、廉江（32）、廣州（48）、欽州（44）和新加坡（35）的種質各1份;B亞群包含13份種質，除了來源于崇左的甜楊桃種質（21）、漳州的水晶楊桃（27）、欽州的世紀紅（23）外，其余10份均來源于廣東的廣州和惠州。雖然紅楊桃（48）和廣州紅楊桃（24）均采源于廣州，且名稱極為相似，但分別屬于不同亞群，說明二者非同一種質。第Ⅱ類群包含14份楊桃種質，其中包括8份酸楊桃種質，還包括3份來源于貴港的甜楊桃種質（4、7、8）及來源于臺灣（42）、廣州（43）和南寧（25）的甜楊桃種質各1份?？梢?，該類群種質的果實風味多為酸、酸甜或甜酸。第Ⅲ類群包含7份楊桃種質，其中，3份原產地為臺灣（9、28和30），其他4份原產地分別為玉林（3）、高州（33）、馬來西亞（38）和新加坡（45）。該類群中，除玉林淡水楊桃（3）的果實甜味和酸味均很淡，介于甜楊桃和酸楊桃之間外，其他種質均為甜楊桃。玉林淡水楊桃（3）與類群內其他種質的遺傳相似系數均較小，從遺傳角度上反映出該類群種質在風味特征上的差異。

2. 3 主成分分析結果

根據遺傳相似系數進行主成分分析，并繪制二維散點平面分布圖，如圖3所示。前3個主成分貢獻率依次為13.02%、9.11%和7.45%，累計貢獻率為29.58%，能代表原始數據的主要信息。在二維散點平面分布圖中，種質間的距離越近，表示親緣關系越近;反之則越遠。根據種質間的距離可將48份楊桃種質分成A、B、C和D 4個組，其中，A組和B組分別相當于聚類分析結果中第Ⅰ類群的A亞群和B亞群，C組和D組分別相當于第Ⅱ類群和第Ⅲ類群，表明主成分分析結果與聚類分析結果高度相似。A組和B組存在交錯現(xiàn)象，與聚類分析結果中A和B兩個亞群同屬Ⅰ類群相互印證。但在主成分分析結果中，馬來西亞甜楊桃種質1（34）歸為C組，可能其起源與C組的種質更接近，因相關科研資料欠缺，歷史年代久遠，現(xiàn)已無法考證。從整體來看，供試楊桃種質在圖3中分布廣泛，表明其遺傳背景較廣，遺傳多樣性較豐富。綜合對比圖2和圖3可知，系統(tǒng)聚類分析結果和主成分分析結果基本一致，雖然主成分分析的分類結果不如聚類分析結果可將各組邊界明確劃分，但能更直觀地反映出種質間的親緣關系，將兩者結合可更全面地了解各種質間的親緣關系。

3 討論

SCoT分子標記是一種根據起始密碼子ATG側翼序列的保守性和一致性設計單向引物，擴增產生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標記（Collard and Mackill，2009），且其擴增的多態(tài)性條帶絕大部分是基因組內部的功能基因或與之緊密相鄰，能有效與目標性狀連鎖，可通過篩選某個分子標記來實現(xiàn)性狀篩選（熊發(fā)前等，2009）。本研究選用11條SCoT引物對48份楊桃種質進行PCR擴增，共得到115條條帶，其中多態(tài)性條帶數為102條，占總條帶數的88.7%。戴子云（2010）利用13條PAPD引物從17份廣東楊桃種質擴增獲得的多態(tài)條帶百分比為59%;劉韜等（2011）利用13條RAPD引物從17份福建楊桃種質擴增獲得的多態(tài)性條帶百分比為97.19%;劉鍇棟等（2013）利用10條RAPD引物從10份廣東楊桃種質擴增獲得的多態(tài)性條帶百分比為93.02%。劉韜等（2011）、劉鍇棟等（2013）擴增獲得的多態(tài)性條帶百分比較本研究稍高，究其原因可能是本研究供試材料較多，但僅用11條SCoT引物進行多態(tài)性分析。PIC作為評價物種遺傳多樣性參數的重要指標，當PIC大于0.5時，具有高度多態(tài)性（Vanhala et al.，1998）。本研究篩選出的SCoT引物平均PIC為0.77，遠高于0.5，說明這些引物為高度多態(tài)性信息引物，具有較高的檢測效率，可用于楊桃種質鑒定、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構建，且這些多態(tài)性位點很可能是功能基因或與目標性狀相關聯(lián)，為基因定位和基因克隆提供理論依據。

分析了解楊桃種質資源間的親緣關系及變異信息，為楊桃種質資源鑒定及育種時親本選擇提供理論依據。根據本研究聚類分析和主成分分析結果，48份楊桃種質可分為三大類群，所有酸楊桃種質均屬于第Ⅱ類群，而甜楊桃種質則主要集中在第Ⅰ和Ⅲ類群，僅少數甜楊桃種質在第Ⅱ類群。第Ⅰ類群又可在遺傳相似系數0.7020處分為A和B兩個亞群，A亞群以原產地為馬來西亞及來源于玉林和新加坡等地的種質為主，B亞群則主要為廣東的種質。而來自廣西貴港和南寧的種質集中在Ⅱ類群，來源于我國臺灣的種質則主要集中在第Ⅲ類群?？梢姡狙芯康木垲惙治鼋Y果與楊桃果實風味和種質來源高度相關，與劉鍇棟等（2013）的研究結論基本一致。因此，本研究篩選獲得的11條SCoT引物擴增產物中極可能存在與果實風味（酸甜）相關的基因位點。本研究中，臺灣軟枝和泰國大果甜楊桃歸于同一類，而馬來西亞B17歸于另一類群，與劉韜等（2011）的研究結果相一致。雖然本研究的聚類分析結果與楊桃種質的果實風味和品種來源相關性較高，但并未嚴格按照果實風味或來源地進行劃分，可能是因為部分種質來源地并非原產地，說明楊桃種質遺傳多樣性較豐富，遺傳背景較復雜，要明確其親緣關系需要進行更深入的調查和研究。因此，要鑒定不同的楊桃種質，區(qū)分同名異種或同種異名的楊桃品種，除了采用分子標記技術外，還應綜合形態(tài)特征、品質性狀等進行分析更有效。

4 結論

楊桃種質資源具有較豐富的遺傳多樣性，且篩選獲得的SCoT引物對楊桃種質資源有較高的多態(tài)性檢測率，適用于楊桃種質資源鑒別及親緣關系分析。

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（責任編輯 陳 燕）