基于高效液相色譜法指紋圖譜和一測(cè)多評(píng)法的荷芪散質(zhì)量評(píng)價(jià)

楚淑芳 陳秋谷 胡兆流

摘要 目的：建立不同批次荷芪散的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，并采用一測(cè)多評(píng)（QAMS）法測(cè)定其中甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素6種成分的含量。方法：采用HPLC，以金絲桃苷為內(nèi)參物，建立10批荷芪散的指紋圖譜及其余5個(gè)成分的相對(duì)校正因子（RCF），并測(cè)定其含量，比較QAMS法與外標(biāo)（ESM）法的差異性。結(jié)果：建立的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定了28個(gè)共有峰;金絲桃苷與甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素的RCF分別為1.52、0.71、0.43、0.71、0.56，RSD<3.0%，QAMS法與ESM法的測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：高效液相色譜法指紋圖譜結(jié)合QAMS法可為評(píng)價(jià)荷芪散的質(zhì)量提供參考。

關(guān)鍵詞 荷芪散;一測(cè)多評(píng)法;指紋圖譜;高效液相色譜法;相對(duì)校正因子

Abstract Objective：To establish the HPLC fingerprint of Heqi Powder in different batches，and to determine the contents of liquiritin，isoflavones glucoside，hyperoside，nuciferine，fibroblasts，aurantio-obtusin by QAMS.Methods：HPLC method was used to establish the fingerprint of 10 batches of Heqi Powder and the relative correction factors of the remaining five components with hyperoside as the reference.The contents were determined and the difference between the QAMS method and ESM method were compared.Results：HPLC fingerprint was established to calibrate a total of 28 common peaks.The RCF of hyperoside and liquiritin，isoflavones glucoside，nuciferine，fibroblasts，aurantio-obtusin were 1.52，0.71，0.43，0.71，0.56，RSD<3.0%.There was no significant difference between the measured values of QAMS method and ESM method.Conclusion：The fingerprint combined with QAMS can be used as a reference for evaluating the quality of Heqi Powder.

Key Words Heqi Powder; QAMS; Fingerprint; HPLC; Relative correction factor

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.013

荷芪散是深圳市中醫(yī)院內(nèi)分泌病科團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，經(jīng)臨床不斷摸索、反復(fù)篩選總結(jié)而形成的有效中藥復(fù)方制劑，由荷葉、黃芪、蒼術(shù)、澤蘭、決明子、冬瓜皮、山藥和甘草等8味藥組成，方以荷葉、黃芪為君藥，蒼術(shù)、澤蘭為臣藥，冬瓜皮、決明子、山藥共為佐藥，使以甘草，全方共奏益氣健脾祛濕、升清降濁、活血利水輕身之效。前期臨床觀(guān)察證實(shí)，荷芪散可有效改善多囊卵巢綜合征患者和糖尿病前期患者的臨床癥狀，降低體質(zhì)量，調(diào)節(jié)性激素及胰島素水平、卵巢大小和卵泡發(fā)育，糾正糖脂代謝紊亂[1-4];降低代謝綜合征的中醫(yī)證候積分，顯著控制體質(zhì)量指數(shù)，減輕胰島素抵抗，調(diào)整糖、脂代謝紊亂，降低瘦素，升高脂聯(lián)素水平，減少腫瘤壞死因子的分泌[5-6]。實(shí)驗(yàn)研究表明，荷芪散可通過(guò)上調(diào)局部卵巢組織PI3K/AKT信號(hào)通路中相關(guān)重要信號(hào)傳導(dǎo)分子的基因表達(dá)，下調(diào)拮抗因子的基因表達(dá)，改善多囊卵巢綜合征模型大鼠的卵巢組織形態(tài)、胰島素抵抗及糖脂代謝，且無(wú)肝功能不良反應(yīng)[7]。故為了確保臨床應(yīng)用的有效性、穩(wěn)定性和安全性，本研究將運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)結(jié)合一測(cè)多評(píng)（Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker，QAMS）法評(píng)價(jià)荷芪散的質(zhì)量，為臨床用藥提供保證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津公司）、A3S-10-10-CE型超純水機(jī)（美國(guó)艾科浦公司）。

1.2 試劑 甲醇、甲酸、三乙胺為色譜純，購(gòu)于美國(guó)默克公司;水為超純水。

1.3 分析樣品 對(duì)照品甘草苷（批號(hào)：111610-201607）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：111920-201505）、荷葉堿（批號(hào)：111566-201706）、蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201007）、橙黃決明素（批號(hào)：111900-201605）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;金絲桃苷（批號(hào)：wkq18111901）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用10批荷芪散樣品，批號(hào)分別為：190307、190309、190311、190312、1903013、190314、190315、190316、190318、190319由深圳市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3柱（5 μL，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.3%甲酸-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫：0～120 min，2%～48% A;120～150 min，48%～70% A;體積流量：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 荷芪散樣品的制備 取處方量各味藥，加10倍量水，煎煮2次，1 h/次，合并煎煮液，濾過(guò)，濃縮至500 mL，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取荷芪散樣品4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素對(duì)照品適量，加入甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.439 4、0.908 9、0.806 0、0.467 1、0.148 0、0.253 6 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，置同一量瓶中，加入甲醇至刻度，即得甘草苷0.013 2 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.013 6 mg/mL、金絲桃苷0.096 7 mg/mL、荷葉堿0.032 7 mg/mL、蘆薈大黃素0.007 4 mg/mL、橙黃決明素0.002 5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.5 單味藥材溶液的制備 分別稱(chēng)取處方量荷葉、黃芪、澤蘭、決明子、冬瓜皮、蒼術(shù)、山藥、甘草8味藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備各單味藥材水提液樣品，并按“2.3”項(xiàng)下方法制備各單味藥材溶液。

2.6 HPLC指紋圖譜建立

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰峰面積和保留時(shí)間的RSD均小于5.0%，表明該方法精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰峰面積和保留時(shí)間的RSD均小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，在“2.1”色譜條件下分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰峰面積和保留時(shí)間的RSD均小于5.0%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 將10批荷芪散樣品分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，得到荷芪散的HPLC指紋圖譜，共28個(gè)共有峰，其中8號(hào)峰為甘草苷，9號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，15號(hào)峰為金絲桃苷，16號(hào)峰為荷葉堿，27號(hào)峰為蘆薈大黃素，28號(hào)峰為橙黃決明素，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。10批荷芪散樣品與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.988、0.998、0.988、0.994。

2.6.5 共有峰歸屬

通過(guò)保留時(shí)間和紫外吸收對(duì)照分析可知，指紋圖譜中標(biāo)定的28個(gè)共有峰中1、2、3、4、5、6、7、10、11、14、15、16、18號(hào)峰來(lái)自荷葉藥材，1、9號(hào)峰來(lái)自黃芪藥材，13、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28號(hào)峰來(lái)自決明子藥材，12、17號(hào)峰來(lái)自澤蘭藥材，8號(hào)峰來(lái)自甘草藥材。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.7 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定荷芪散的6個(gè)成分

2.7.1 線(xiàn)性范圍 取“2.4”項(xiàng)下各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制為梯度濃度的混合溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素的質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素色譜峰峰面積的RSD分別為1.46%、0.52%、0.54%、1.95%、2.15%、1.52%，表明該方法精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素含量的RSD分別為2.45%、2.18%、4.01%、4.08%、2.02%、2.09%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批荷芪散樣品（批號(hào)190316），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，在“2.1”色譜條件下分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素色譜峰峰面積的RSD分別為1.63%、0.67%、0.56%、1.88%、2.26%、1.66%，表明供試液中的各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的荷芪散樣品（批號(hào)190316）約2 mL，精密量取9份，分別置10 mL量瓶中，按高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右加入甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素對(duì)照品，平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素的平均回收率分別為101.77%、98.32%、98.56%、98.11%、99.01%、99.19%，RSD分別為2.40%、2.04%、3.77%、3.42%、1.44%、4.01%。

2.7.6 相對(duì)校正因子計(jì)算 取“2.4”項(xiàng)下各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制為梯度濃度（I：0.005 3、0.005 4、0.038 7、0.013 1、0.003 0、0.001 0 mg/mL，II：0.007 9、0.008 2、0.058 0、0.019 6、0.004 4、0.001 5 mg/mL，III：0.010 5、0.019 1、0.077 4、0.026 2、0.005 9、0.002 0 mg/mL，IV：0.013 2、0.013 6、0.096 7、0.032 7、0.007 4、0.002 5 mg/mL，V：0.015 8、0.016 4、0.116 1、0.039 2、0.008 9、0.003 0 mg/mL，VI：0.018 4、0.019 1、0.135 4、0.045 8、0.010 4、0.004 0 mg/mL）的混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以金絲桃苷為內(nèi)參物（S），采用多點(diǎn)校正法計(jì)算甘草苷（a）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（b）、荷葉堿（c）、蘆薈大黃素（d）、橙黃決明素（e）的相對(duì)校正因子（RCF），公式為fks=fk/fs=（Ck×As）/（Cs×Ak）（式中As為內(nèi)參物s的峰面積，Cs為內(nèi)參物s的濃度，Ak為待測(cè)成分k的峰面積，Ck為待測(cè)成分k的濃度）[8]。見(jiàn)表2。

2.7.7 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察 精密吸取“2.4”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，分別考察島津-LC-2030、島津-LC-20AT2種型號(hào)的高效液相色譜儀和Waters XSelect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo ODS HYPERSIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）、phenomenex LunaOmega PS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱對(duì)RCF的影響。見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，各成分RCF的RSD均小于5%，表明不同色譜儀及色譜柱對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

2.7.8 待測(cè)組分色譜峰定位 以金絲桃苷為內(nèi)參物（S），利用相對(duì)保留時(shí)間（tk/s）和化合物的紫外吸收特征定位待測(cè)組分色譜峰，計(jì)算不同色譜儀及色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間。見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，RSD均小于5%，甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.86、0.87、1.02、1.52和1.54，表明相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性較好。

2.7.9 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 取6批荷芪散樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣測(cè)定，分別采用QASM法和外標(biāo)（ESM）法計(jì)算各成分含量，并利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)2組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，考察2種方法的差異。見(jiàn)表5。由表可知，2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明QASM法可用于荷芪散中6個(gè)化學(xué)成分的含量測(cè)定。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

將供試品溶液進(jìn)行190～400 nm紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)在270 nm處下各色譜峰的數(shù)目、豐度、分離度、靈敏度較好，最為適合荷芪散的指紋圖譜研究，且實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素的最大吸收波長(zhǎng)分別為276、248、255和355、270、229和259、285 nm，在270 nm處均可顯示較高的靈敏度，故本研究選擇270 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 內(nèi)參物選擇

金絲桃苷對(duì)照品較廉價(jià)易得，容易購(gòu)買(mǎi)，在荷芪散中含量較高，穩(wěn)定性好，峰位適中，不受方中其他成分干擾，以此為內(nèi)參物，各成分的相對(duì)校正因子穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，且相比方中其他成分分離效果較好。

3.3 流動(dòng)相選擇

本研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的pH值對(duì)指紋圖譜中14、15（金絲桃苷）、16（荷葉堿）號(hào)峰有較大的影響，實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸-0.2%三乙胺溶液、甲醇-0.1%甲酸-0.2%三乙胺溶液、甲醇-0.2%甲酸-0.1%三乙胺溶液、甲醇-0.2%甲酸-0.2%三乙胺溶液、甲醇-0.3%甲酸-0.2%三乙胺溶液、甲醇-0.4%甲酸-0.2%三乙胺溶液等不同的流動(dòng)相體系，只有在甲醇-0.3%甲酸-0.2%三乙胺溶液的流動(dòng)相體系下，分離效果較佳，峰形良好，其余的流動(dòng)相體系均無(wú)法分離這3個(gè)色譜峰，故本研究最終選擇甲醇-0.3%甲酸-0.2%三乙胺溶液作為荷芪散指紋圖譜和QAMS的流動(dòng)相。

3.4 指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)荷芪散質(zhì)量的意義

指紋圖譜技術(shù)作為一種綜合的、可量化的鑒別分析手段，具有模糊性、整體性和專(zhuān)屬性，能全面反映荷芪散的內(nèi)在化學(xué)特征[9]。QAMS法通過(guò)測(cè)定易得、廉價(jià)、穩(wěn)定、有效的一個(gè)成分，根據(jù)成分間的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分的含量[10]。甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素分別為甘草、黃芪、荷葉、決明子的有效性代表成分，具有降脂、降血壓、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、利尿、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、保肝等作用[11-15]。故本研究以指紋圖譜結(jié)合QAMS法可有效地評(píng)價(jià)荷芪散質(zhì)量，為臨床用藥的安全性和有效性提供保證。

綜上所述，本研究以甘草苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、蘆薈大黃素、橙黃決明素6種成分為指標(biāo)，建立的QAMS結(jié)合指紋圖譜法操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可為荷芪散的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

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（2019-04-24收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）