牛乳基和羊乳基奶粉中16種氨基酸含量的測(cè)定及比較

劉婷婷 邢青斌 唐艷斌 陳璐 孫靜 黃建 霍軍生

摘?要：目的：對(duì)乳粉中氨基酸分析的水解方法進(jìn)行研究，比較牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中氨基酸的含量。方法：樣品用含巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取，經(jīng)定容、過濾、真空濃縮、復(fù)溶、過膜后，用氨基酸分析儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果：應(yīng)用含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解液對(duì)奶粉樣品進(jìn)行水解的同時(shí)有效防止了蛋氨酸的氧化，相對(duì)氧化水解方法節(jié)省前處理時(shí)間，方法的回收率為94%～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。通過對(duì)牛乳基和羊乳基奶粉樣品中的16種氨基酸分析，牛乳基奶粉中賴氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他相應(yīng)氨基酸含量不存在顯著性差異。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確快速、重現(xiàn)性好，適用于奶粉中氨基酸含量分析的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：氨基酸;奶粉;牛乳基;羊乳基;氨基酸分析儀

近些年，羊乳基粉和牛乳基粉營(yíng)養(yǎng)組成及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到較多關(guān)注，但作為主要乳營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)的氨基酸，在我國(guó)市場(chǎng)上羊乳基粉和牛乳基粉產(chǎn)品中的比較研究尚未見報(bào)道。氨基酸主要以結(jié)合態(tài)氨基酸和游離氨基酸形式存在。游離氨基酸可直接取樣提取后檢測(cè)，結(jié)合態(tài)氨基酸需將蛋白水解后進(jìn)行測(cè)定。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行大量研究，由于大部分氨基酸無熒光發(fā)射和紫外吸收特性，需通過衍生后進(jìn)行檢測(cè)[1]，研究人員開發(fā)出柱前衍生的陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法[2]、高效液相色譜法[3-6]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等，上述方法所需前處理步驟復(fù)雜，分析時(shí)間較長(zhǎng)，重現(xiàn)性不是很穩(wěn)定，且消耗人力、物力較大。近些年，氨基酸分析儀被廣泛應(yīng)用于氨基酸分析，低pH條件下帶正電荷的各種氨基酸在陽(yáng)離子交換樹脂上被吸附，隨著不同離子強(qiáng)度、pH值的流動(dòng)相依次洗脫下來，分離純化后用茚三酮衍生的色譜法，該方法靈敏、快速、重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)可靠。

本研究對(duì)乳基粉中氨基酸測(cè)定的前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，使用氨基酸分析儀進(jìn)行分析，建立了快速、準(zhǔn)確、可靠的16種氨基酸含量測(cè)定方法。通過分析不同牛乳基奶粉和羊乳基奶粉產(chǎn)品中氨基酸的成分和含量，得到其特征圖譜，為今后評(píng)價(jià)原材料和相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)良性、真實(shí)性提供參考。

1?材料與方法

1.1?樣品和試劑

奶粉樣品：分別采購(gòu)自四川、內(nèi)蒙、新疆、寧夏、青海、甘肅、重慶、廣西、貴州、云南的商場(chǎng)和超市。涉及嬰幼兒配方奶粉、孕婦奶粉、中老年奶粉，去除調(diào)制乳和乳基不明確的乳粉，篩選出70份牛乳基奶粉和18份羊乳基奶粉樣本。

氨基酸標(biāo)樣，日本W(wǎng)ako公司;質(zhì)控品（SRM 1849A嬰兒/成人營(yíng)養(yǎng)配方），美國(guó)NIST;鹽酸（優(yōu)級(jí)純），天津試劑公司;巰基乙酸，美國(guó)Sigma公司;氨基酸分析儀配套的流動(dòng)相（茚三酮溶液和緩沖液），日本W(wǎng)ako公司;實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ純水儀制的。

1.2?儀器和設(shè)備

L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司;電熱恒溫干燥箱，上海森信;濃縮儀，東京理化公司;氮吹儀，美國(guó)Organomation公司。

1.3?方法

1.3.1?蛋白質(zhì)含量的測(cè)定?參照國(guó)標(biāo)方法（GB 5009.5—2016）[10]，稱取約0.20g樣品，同時(shí)做樣品空白管，每管分別加入5.0mL濃硫酸和催化片（K2SO4 1.5g;Se 0.007 5g），過夜，次日，置消化器消化6h，待消化完全后用凱式自動(dòng)定氮分析儀測(cè)定氮含量，計(jì)算得到其蛋白質(zhì)含量。

1.3.2?氨基酸的測(cè)定?參照國(guó)標(biāo)方法（GB 5009.124—2016）[11]原理測(cè)定16種氨基酸，并對(duì)樣品預(yù)處理做出調(diào)整。稱取奶粉樣品約0.10g于酸水解管中，在水解管內(nèi)加10mL 6mol/L鹽酸（含0.05%巰基乙酸），充入高純氮?dú)夂蠓饪冢瑢⒁逊饪诘乃夤芊湃?10℃的恒溫鼓風(fēng)箱中，水解22h后取出冷卻。將水解管內(nèi)全部液體轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶?jī)?nèi)，多次沖洗水解管，用去離子水定容。將定容水解液過濾后，吸取1mL于10mL濃縮管中，應(yīng)用真空濃縮儀，在55℃水浴中濃縮，殘留物用1mL水溶解后濃縮至干，用2.0mL 0.02moL/L鹽酸復(fù)溶，過濾后供儀器測(cè)定。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用0.02mol/L稀鹽酸稀釋配制得到0.10μmol/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：色譜柱：水解氨基酸色譜柱（4.6mm×60mm，3μm）;檢測(cè)波長(zhǎng)：570、440nm;反應(yīng)柱溫度：135℃;分析柱溫度：57℃;進(jìn)樣體積：20μL;洗脫溶液流速：0.4mL/min;柱后衍生試劑流速：0.35mL/min。

1.3.3?數(shù)據(jù)分析?用外標(biāo)法分別測(cè)定篩選出的70份牛乳基樣本和18份羊乳基樣本中16種氨基酸的含量，應(yīng)用SRM 1849A嬰兒/成人營(yíng)養(yǎng)配方粉作為質(zhì)控驗(yàn)證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過SAS 9.4軟件，用中位數(shù)[四分位間距（quartile，QR）]表示，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較組間差異。

2?結(jié)果與分析

2.1?氨基酸測(cè)定方法的改進(jìn)

2.1.1?色譜分離效果?使用氨基酸分析儀，采用陽(yáng)離子色譜柱分離后茚三酮在線衍生的方法，該方法靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。從圖1～2可以看出，基線平穩(wěn)，色譜峰窄而尖，分析時(shí)間短，分離效果好。在實(shí)際奶粉樣品中，目標(biāo)峰也與其他雜質(zhì)峰分離良好。

2.1.2?檢出限及定量限?在上述分析條件下，結(jié)合稱樣量，前處理過程和復(fù)溶后的定容體積，以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算方法定量限（LOQ）（表1）。

2.1.3?分析條件優(yōu)化及準(zhǔn)確性評(píng)估?蛋氨酸作為含硫氨基酸，在酸水解過程中，容易被氧化而導(dǎo)致測(cè)定值比實(shí)際含量值偏低，因此，蛋氨酸回收率的提高是保證酸水解氨基酸檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。為此，本研究采用3種不同的前處理水解液對(duì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，并比較了上機(jī)前氮?dú)鉂饪s和真空濃縮的效果（表2）。在樣品前處理過程中，加入含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解法對(duì)樣品中蛋氨酸的水解保護(hù)效果較好。因巰基乙酸具有巰基和羥酸的反應(yīng)特征，直接對(duì)蛋白類樣品進(jìn)行水解的同時(shí)，還可有效防止蛋氨酸被氧化，減少了氨基酸前處理過程中的氧化損失。加入巰基乙酸的鹽酸水解液法相對(duì)氧化保護(hù)后酸水解法分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，節(jié)省前處理時(shí)間，回收率達(dá)到94%～97%，高于原國(guó)標(biāo)方法采用的方法（回收率 89%～93%），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.0%，真空濃縮儀趕酸富集過程樣品中的氨基酸更穩(wěn)定，不易被空氣氧化，重現(xiàn)性好，表明此方法有較好的重復(fù)性，準(zhǔn)確可靠。

2.2?奶基中氨基酸比較

應(yīng)用氨基酸分析儀對(duì)來自牛乳基和羊乳基樣品中的16種氨基酸進(jìn)行分析，NIST的嬰兒/成人營(yíng)養(yǎng)配方粉1849A作為質(zhì)控品，對(duì)蛋白質(zhì)和相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行質(zhì)量控制，試驗(yàn)所得的質(zhì)控品氨基酸含量在靶值范圍內(nèi)。各氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，也間接證明了本方法測(cè)定乳粉中氨基酸含量的準(zhǔn)確性。根據(jù)對(duì)70份牛乳基奶粉和18份羊乳基樣本的分析，蛋白質(zhì)含量平均為15%（11%～22%）。牛奶基和羊奶基奶粉中均含有豐富的氨基酸，種類齊全，包括絲氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等（表3）。

3?結(jié)論

本研究通過對(duì)乳基奶粉中氨基酸分析的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化研究，在鹽酸水解液中加入巰基乙酸對(duì)含硫的蛋氨酸進(jìn)行保護(hù)，相比傳統(tǒng)酸水解方法減少氧化損失，其分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，為進(jìn)一步開展奶粉氨基酸成分及含量的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。通過氨基酸分析儀對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷售的牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中16種氨基酸進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)牛乳基奶粉中酪氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他種類的氨基酸含量在牛乳基和羊乳基奶粉中不存在顯著性差異，為今后相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）