奶及奶制品中乳糖檢測方法的研究進(jìn)展

焦艷翠 趙領(lǐng)軍 范麗霞 趙善倉

摘?要：綜述了奶及奶制品中乳糖的檢測方法的研究進(jìn)展，包括傳統(tǒng)的重量法、紅外光譜法、分光光度法、差分pH和酶法等以及新型的高效液相色譜法，并對各個方法的原理及其應(yīng)用情況進(jìn)行了闡述。

關(guān)鍵詞：奶及奶制品;乳糖;乳糖不耐癥

乳糖是一種重要的能量物質(zhì)。測定乳糖含量可以為乳糖不耐癥個體選擇飲食提供參考。本文綜述了奶及奶制品中乳糖檢測方法的研究進(jìn)展，包括傳統(tǒng)的重量法、紅外光譜法、分光光度法、差分pH和酶法等以及新型的高效液相色譜法，并對各個方法的原理及其應(yīng)用情況進(jìn)行了闡述。

1?乳糖及其特殊的營養(yǎng)作用

奶是一種由雌性哺乳動物乳腺分泌的復(fù)雜的流體食物，是哺乳動物發(fā)育過程中碳水化合物的主要來源，占哺乳期消耗能量的40%，幾乎包含維持新生兒生命和成長所需的所有營養(yǎng)物質(zhì)[1]。奶所含的營養(yǎng)成分中，糖類起到關(guān)鍵的作用，其含量可達(dá)到10%[2]，并且?guī)缀鮾H以乳糖的形式存在（占牛奶中糖分的98%）。乳糖對于新生命最初幾個月的神經(jīng)組織發(fā)育是很重要的，主要作用是為新生兒提供半乳糖以合成神經(jīng)結(jié)構(gòu)（髓鞘）。D-乳糖以α-乳糖和β-乳糖（比率是2∶3）兩種形式存在，這取決于葡萄糖中吡喃糖的形式（α或β），葡萄糖多以β-吡喃糖形式存在。這些異構(gòu)體也有不同的物理性質(zhì)，如對于水的溶解度，β-乳糖比α-乳糖溶解度大[3-4]。乳糖在乳腺組織中由血液中的一部分葡萄糖轉(zhuǎn)化為半乳糖，這涉及到復(fù)雜的乳糖合成酶，它由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和α乳白蛋白組成[5]。乳糖的消化吸收需要在乳糖酶的作用下將乳糖水解形成單糖，被腸道吸收并進(jìn)入到血液中。如果乳糖酶不存在或是含量較低，乳糖不會被水解和吸收，而是進(jìn)入結(jié)腸或是大腸，被這里的微生物分解利用，就會產(chǎn)生多種氣體及短鏈脂肪酸，滲透壓升高，導(dǎo)致腹脹、排氣增多、腹痛和腹瀉等病癥，即乳糖不耐癥[6]，因此，對于乳糖不耐癥病人，乳糖的測定是非常重要的[7-8]。

2?乳糖的測定方法

目前已經(jīng)建立了大量用于測定乳糖含量的方法，包括傳統(tǒng)的重量分析法、紅外光譜法、分光光度法和酶法，以及高特異性、高靈敏度的高效液相色譜示差折光檢測器法和高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測器法。

2.1?重量法

重量法是基于硫酸銅在醛糖和酮糖存在條件下與氫氧化鉀發(fā)生反應(yīng)生成沉淀物氧化亞銅，對生成的氧化亞銅進(jìn)行稱重，通過經(jīng)驗(yàn)表查出與氧化亞銅量相當(dāng)?shù)娜樘呛縖8-9]。

2.2?紅外光譜法

紅外光譜法是基于乳糖分子中羥基在波長為1 042 cm-1[10]處吸收紅外能量。早期的儀器完全基于濾波器，使用一對（樣本和參照）光學(xué)過濾器，來選擇一個波長測量乳糖?，F(xiàn)在利用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）中干涉儀在中紅外區(qū)域內(nèi)獲得物質(zhì)完整的光譜信息，從而獲得大量的計(jì)算和數(shù)據(jù)處理性能測定乳糖的含量[11-14]。Kittivachra等[14]利用傅里葉變換紅外線對牛奶中粗蛋白、脂肪、乳糖、非脂干物質(zhì)、干物質(zhì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，乳糖含量為4.59%±0.12%。趙武奇團(tuán)隊(duì)[15]用InfraXact多功能近紅外分析儀和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了不同預(yù)處理和校正方法對建模效果的影響，建立了液態(tài)奶制品中脂肪、乳糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量含量的定標(biāo)模型，最優(yōu)模型對乳糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.12%，相對誤差為2.82。近紅外光譜分析法能夠?qū)崿F(xiàn)對牛奶中乳糖含量的快速、無損定量檢測。何吉子等[16]利用傅立葉變換近紅外光譜（FT-NIR）技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法（PLS）對嬰幼兒配方奶粉中的乳糖進(jìn)行快速檢測分析，測定的樣品中的乳糖值與高效液相色譜（HPLC）法測定的乳糖值之間的平均相對誤差均≤0.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均≤0.88%，均符合誤差范圍。

2.3?分光光度法

分光光度法測定乳糖主要是因?yàn)槿樘桥c苯酚、氫氧化鈉、苦味酸和亞硫酸氫鈉等物質(zhì)反應(yīng)生成橘紅色的絡(luò)合物，在一定濃度范圍內(nèi)，橘紅色絡(luò)合物顏色的深淺與乳糖含量成正比，然后用分光光度計(jì)進(jìn)行測定從而得出乳糖的量。該方法比較簡單、快速，但不適用于大量樣品同時測定[17]。并且不能區(qū)分其他還原糖和乳糖，所以適用于原奶和成分比較簡單的奶制品中的乳糖含量的測定[18]。陶兆林等[19]將牛奶樣品去除蛋白質(zhì)之后，加熱情況下與Na2CO3發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定吸光度值。結(jié)果表明，乳糖檢測回收率為99.7%～103.0%，并且蔗糖對乳糖測定基本沒有影響。蔣珍菊等[20]利用亞鐵氰化鉀和硫酸鋅作為沉淀劑，苯酚、氫氧化鈉、苦味酸、亞硫酸氫鈉作為發(fā)色劑，沸水加熱情況下發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定吸光度值。此方法的精密度為0.55%、重復(fù)性為1.809%、加標(biāo)回收率為100.434%，結(jié)果表明，蔗糖和淀粉對吸光度的影響不大，葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖對吸光度有較大影響。

2.4?酶法

酶法測定乳糖已有大量的報道[21-23]，其原理是利用乳糖在酶的作用下水解生成葡萄糖和半乳糖，隨后測定一種游離單糖的量，樣品中乳糖的含量由水解前后樣品中單糖含量的差異判定。

2.4.1?煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酶法?目前測量半乳糖最常用的酶方法是基于其被β-半乳糖脫氫酶氧化生成半乳糖醛酸，同時煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）還原生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。通過計(jì)算添加半乳糖脫氫酶前后NADH在340nm處的吸光度值的差異得出乳糖的含量[24]。這種方法具有特異性和準(zhǔn)確性，但是需要在紫外范圍內(nèi)進(jìn)行測量。Shapiro等[[21]開發(fā)了用硫代-NAD代替NAD，在可見光405或415nm處進(jìn)行測定的方法，實(shí)現(xiàn)了使用酶標(biāo)儀同時測定幾個樣品中D-半乳糖的含量。

2.4.2?微分pH法?用于測定奶樣品中乳糖和乳果糖的微分pH技術(shù)是基于酶促反應(yīng)引起的pH變化。通過測定β-半乳糖苷酶處理前后葡萄糖和ATP在己糖激酶（HK）存在下發(fā)生反應(yīng)引起的pH變化來得出的。這種方法需要在ATP存在條件下，在樣品中加入β-半乳糖苷酶和葡萄糖激酶的混合物，3h后測量pH變化，再加入HK，監(jiān)測4h內(nèi)pH變化，以觀察d-果糖-6-磷酸形成從而計(jì)算出乳糖的量[25]。

2.5?高效液相色譜法

2.5.1?高效液相色譜-示差折光檢測法（HPLC-RIC）HPLC是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，因具有樣品前處理方法簡單、快速的優(yōu)勢，被廣泛用于分析食品中多種碳水化合物。高效液相色譜紫外檢測器可以吸收低波長的紫外線，可直接檢測碳水化合物。然而在低波長（低于200nm）紫外區(qū)域，其靈敏度低和選擇性較差，并且需要使用高質(zhì)量和昂貴的試劑。最常見的乳糖檢測分析系統(tǒng)是HPLC-RIC，高山等[26]就通過優(yōu)化試驗(yàn)條件利用此方法對乳粉中乳糖進(jìn)行檢測，得到的樣品測定結(jié)果比按照國標(biāo)（GB 5413.5—2010）條件測定的結(jié)果高出7%。

2.5.2?高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測?幾種有效的分離碳水化合物的色譜方法中，應(yīng)用最為廣泛的是反相色譜和陽離子交換色譜[27-31]。反相色譜分離是基于疏水相互作用，主要是相對極性溶劑、非極性分析物和非極性固定相之間的排斥力。烷基化和氨基烷基化硅膠是最常用的固定相，甲醇水溶液或乙腈水溶液作為流動相，通過疏水作用、極性相互作用和分配進(jìn)行分離[32-33]。傳統(tǒng)的吸附色譜幾乎完全被離子交換色譜（IEC）取代。碳水化合物通過兩種不同類型離子交換劑電荷的差異來實(shí)現(xiàn)分離。如陰離子和陽離子的離子交換劑，其化合物分別帶負(fù)電荷和正電荷[34-35]?；陉栯x子交換高效液相色譜的方法已經(jīng)被用于測定乳制品中的乳糖測定。使用不同的固定相和流動相，比如使用糖分析柱，流動相中加入含鈣胺作為抗衡離子進(jìn)行分析[29]。

高效陰離子交換色譜（HPAEC）結(jié)合脈沖安培檢測法（PAD）是另外一種更敏感的方法。相比對非衍生碳水化合物的分析，該方法是一種高靈敏度和分辨率的分析技術(shù)。碳水化合物的分離和洗脫順序是基于它們的酸解離常數(shù)pKa值的差異，實(shí)際上高效陰離子交換色譜利用碳水化合物的弱酸性，在高pH條件下，強(qiáng)陰離子交換固定相進(jìn)行的選擇性分離。交換柱用烷基季銨鹽官能團(tuán)化的聚（苯乙烯-二乙烯基苯）為固定相[36]。HPAEC-PAD存在的主要問題是保留時間密切相近的碳水化合物可能被共洗脫。Cataldi等[37]優(yōu)化了一種快速靈敏的HPAEC-PAD方法，將10～12mmol/L NaOH和1～2mmol/L醋酸鋇加入到熱牛奶中進(jìn)行改性，這種方法可以使奶和奶制品中乳果糖和乳糖以及其他碳水化合物得到有效的分離和定量[37-38]，最低檢出限（LOD）低于1mg/L[39]，具有很高的性價比。

3?結(jié)論

乳糖是新生兒時期非常重要的營養(yǎng)素，成年人反而容易出現(xiàn)乳糖不耐受現(xiàn)象。本文綜述了傳統(tǒng)、現(xiàn)代各種牛奶中乳糖測定的方法，考慮到乳糖不耐受的普遍程度，乳糖分析應(yīng)選擇最合適的方法，綜合靈敏度、精度、準(zhǔn)確度和分析速度等重要參數(shù)。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）