益氣解毒方對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

胡晶 劉潔 徐冰雁 范婧瑩 羅晶婧 胡梅 何迎春

〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的效應(yīng)。方法 采用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析技術(shù)（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度（0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的益氣解毒方水提物對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響;采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度益氣解毒方水提物對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖能力的影響;通過(guò)高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5監(jiān)測(cè)不同濃度益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖形態(tài)的影響;采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)不同濃度益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達(dá)的影響。結(jié)果 RTCA 和 CCK-8 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，益氣解毒方水提物可以明顯抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞的增殖，而且隨著益氣解毒方水提物的作用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制效應(yīng)越顯著（P<0.05）;Cytation5結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，且濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞核質(zhì)濃縮、破碎更明顯;Western Blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，益氣解毒方水提物能明顯抑制CNE2細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論 益氣解毒方水提物能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，該效應(yīng)與其抑制增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 益氣解毒方;鼻咽癌;細(xì)胞增殖;Survivin;XIAP;PCNA

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5;R739.63 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.003

〔Abstract〕 Objective To study the inhibitory effects on the proliferation of ?human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells with Yiqi Jiedu Formula. Methods Real-time unlabeled cell function analysis technique （RTCA） was used to dynamically monitor the effects of different concentrations （0.125 mg/mL， 0.25 mg/mL， 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL） of Yiqi Jiedu Formula water extract on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells; CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations of water extract of Yiqi Jiedu Formula on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells; the effects of drugs on the proliferation and morphology of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells were monitored by high throughput cell imaging multifunctional detection system Cytation5; Western Blot technique was used to detect the effect of drugs on the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA in nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Results The results of RTCA and CCK-8 showed that the water extract of Yiqi Jiedu Formula could significantly inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells compared with the blank control group， and the longer the action time of the water extract of Yiqi Jiedu Formula， the more significant the inhibitory effect was （P<0.05）; Cytation5 results showed that compared with the blank control group， the morphology of CNE2 cells treated with different concentrations of Yiqi Jiedu Formula water extract changed， and the higher the concentration， the longer the action time was. The shrinkage of cell membrane， and the concentration and fragmentation of nucleoplasm were more obvious; The results of Western Blot showed that compared with the blank control group， the water extract of Yiqi Jiedu Formula could significantly inhibit the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA in CNE2 cells （P<0.05）. Conclusion Yiqi Jiedu Formula can significantly inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells， which is related to the inhibition of the expression of proliferation-related proteins Survivin， XIAP and PCNA.

〔Keywords〕 Yiqi Jiedu Formula; nasopharyngeal carcinoma; cell proliferation; Survivin; XIAP; PCNA

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是目前比較常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，在南方的發(fā)病幾率比較高[1]，其發(fā)病與遺傳因素、EB病毒感染、環(huán)境影響等關(guān)系密切[2-3]，目前公認(rèn)鼻咽癌的有效治療方法為放療、化療，但放化療有其固有的局限性，如敏感性降低、放療后的不良反應(yīng)大、復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移等[4]，尋求一種更加安全高效的診療方式是耳鼻咽喉科醫(yī)生在臨床治療中迫切需要解決的問(wèn)題。益氣解毒方（以下簡(jiǎn)稱(chēng)YQ）是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院田道法教授依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，能夠有效減輕放療化療所帶來(lái)的副反應(yīng)[5]。前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，該方能夠有效抑制人鼻咽癌不同分化類(lèi)型細(xì)胞株，如5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HNE1等細(xì)胞的增殖、遷移，并具有誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)[6-10]。

本研究選取CNE2細(xì)胞株，從增殖、形態(tài)變化方面觀察益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，通過(guò)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析技術(shù)（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）和CCK-8法檢測(cè)益氣解毒方水提物在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)CNE2細(xì)胞的抑制增殖效應(yīng)，采用Cytation5動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)益氣解毒方水提物對(duì)CNE2細(xì)胞形態(tài)變化的影響，最后用Western Blot檢測(cè)益氣解毒方水提物對(duì)CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA表達(dá)的影響，探討益氣解毒方抑制CNE2細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 ?細(xì)胞株

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

益氣解毒方藥物組成及水提物的制備：黃芪30 g，黨參15 g，黃連10 g，白花蛇舌草10 g，茯苓15 g，天花粉10 g，甘草6 g。煎煮收集藥液濃縮，并冷凍干燥，干燥完全后將水提物-20 ℃密封保存，用培養(yǎng)基配成4.0 mg/mL的母液，主要參考廖雪等[11]的制備方法。RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液（Hyclone公司）;胎牛血清（Gibco公司）;DMSO（Amresco公司）;CCK-8試劑盒（日本同仁公司）;一抗Survivin、XIAP、PCNA（CellSignalingTechnology，CST公司）。

1.3 ?實(shí)驗(yàn)儀器

賀利氏HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）;ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（BioTek公司）;5415R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）;實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀（艾森生物科技公司）;Cytation5高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;倒置顯微鏡（Olympus 公司）;Odyssey CLX熒光掃描成像系統(tǒng)（Gene有限公司）。

1.4 ?方法

1.4.1 ?細(xì)胞培養(yǎng) ?將鼻咽癌CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 ?RTCA監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE2細(xì)胞，消化重懸成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整濃度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞，接種到RTCA專(zhuān)用細(xì)胞增殖檢測(cè)培養(yǎng)板，每個(gè)孔加入100 μL CNE2細(xì)胞懸液，等細(xì)胞指數(shù)（cell index， CI）達(dá)到1.0時(shí)，加入不同濃度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益氣解毒方水提物（前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，此濃度范圍藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（Control組），每個(gè)組3個(gè)復(fù)孔，不同濃度組每孔加入藥液200 μL，Control組每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，采用RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并用CI值表示CNE2細(xì)胞的增殖狀況。

CI=（Rn-Rb）/15

Rn表示某個(gè)孔接種了細(xì)胞后的電極阻抗值，Rb表示某個(gè)孔中只有培養(yǎng)基時(shí)的背景阻抗值[12]。根據(jù)曲線分析水提物的藥效隨濃度及時(shí)間變化的特征，并用儀器自帶的軟件計(jì)算出合適時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50） 。

1.4.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，按照每100 μL培養(yǎng)液中5×103個(gè)細(xì)胞種入96孔板，過(guò)夜，待CNE2細(xì)胞貼壁后，藥物組每個(gè)孔分別加入不同濃度的200 μL含藥培養(yǎng)液，Control組每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4.2”，每個(gè)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間。另外，設(shè)定只加細(xì)胞培養(yǎng)液、不加CNE2細(xì)胞的空白孔（用于A值校正）。藥物作用24、48、72 h后，每個(gè)孔（包含空白孔）分別加100 μL現(xiàn)配的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度值（A值），記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出細(xì)胞的增殖率及各時(shí)間點(diǎn)的IC50值。

細(xì)胞增殖率=（A值實(shí)驗(yàn)組-A 值空白孔）/（A值Control組-A值空白孔）×100%

1.4.4 ?高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，消化重懸成單個(gè)細(xì)胞，96孔板鋪板，按照5×103個(gè)細(xì)胞每個(gè)孔，加100 μL體積細(xì)胞懸液到每個(gè)孔，過(guò)夜，待CNE2細(xì)胞貼壁后，根據(jù)“1.4.2”結(jié)果，確定水提物處理CNE2細(xì)胞的濃度，藥物組每個(gè)孔分別加入不同濃度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含藥培養(yǎng)液200 μL，Control組每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，采用Cytation5監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，并設(shè)定6 h拍攝一次細(xì)胞形態(tài)圖像，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.5 ?Western Blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) ?根據(jù)“1.4.2”和“1.4.4”的結(jié)果確定水提物處理CNE2細(xì)胞的濃度和時(shí)間，待CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度水提物0.25、0.50、1.00 mg/mL的含藥培養(yǎng)液3 mL，Control組加入細(xì)胞培養(yǎng)液3 mL，處理36 h后提取蛋白，用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)，采用熒光掃描成像系統(tǒng)分析相關(guān)蛋白的熒光信號(hào)值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

蛋白相對(duì)表達(dá)量=蛋白熒光信號(hào)值/β-actin熒光信號(hào)值

1.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用“x±s”表示，單因素設(shè)計(jì)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，滿(mǎn)足方差齊性，多重比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnet T3檢驗(yàn)。計(jì)量資料不服從正態(tài)分布的，則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的結(jié)果分析圖由GraphPad Prism 7.0軟件制作完成。

2 結(jié)果

2.1 ?RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)益氣解毒方對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，Control組增殖較快，益氣解毒方水提物組能夠抑制CNE2細(xì)胞增殖，并計(jì)算出48 h IC50為0.5 mg/mL。見(jiàn)圖1。2.2 ?CCK-8法檢益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，不同濃度0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL益氣解毒方水提物分別處理CNE2細(xì)胞24、48、72 h后，均可以抑制CNE2細(xì)胞增殖，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）;且0.250、0.500、1.000 mg/mL各藥物組在24、48、72 h 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均<0.05），但0.125 mg/mL組在24、48、72 h 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著藥物濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制效果更加明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 ?Cytation5動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響

根據(jù)RTCA和CCK-8的結(jié)果，選擇0.25、0.50、1.00 mg/mL 3個(gè)濃度的益氣解毒方水提物分別作用于CNE2細(xì)胞，采用Cytation5動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度組的細(xì)胞形態(tài)圖像，由于72 h的CNE2細(xì)胞圖像中，正常培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)太多，而不同濃度水提物組細(xì)胞數(shù)較少，且有部分細(xì)胞漂浮，故挑選加藥處理0、24、36、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)結(jié)果，結(jié)果顯示，Control組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，細(xì)胞胞質(zhì)形態(tài)均勻飽滿(mǎn)，細(xì)胞的輪廓清晰，呈梭形，細(xì)胞結(jié)合率比較高，生長(zhǎng)緊密，48 h左右拍照區(qū)域細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)。而不同濃度的水提物處理48 h后，不同濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞間的連接逐步消失，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜皺縮破裂，細(xì)胞核質(zhì)出現(xiàn)濃縮、破碎、溶解。見(jiàn)圖3。

2.4 ?Western Blot檢測(cè)益氣解毒方水提物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

結(jié)合RTCA和Cytation5的結(jié)果，在益氣解毒方水提物處理CNE2細(xì)胞36 h左右，CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，故我們選取36 h作為干預(yù)時(shí)間點(diǎn)采用Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)情況（以β-actin為內(nèi)參照）。經(jīng)不同濃度益氣解毒方水提物處理36 h后，與Control組相比，不同濃度水提物組增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的相對(duì)表達(dá)量均有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

鼻咽癌是上皮源性惡性腫瘤，在我國(guó)頭頸部腫瘤發(fā)病率中占據(jù)首位[13]，患者在治療后多易復(fù)發(fā)，如何有效減輕患者的復(fù)發(fā)率，降低臨床患者的放化療反應(yīng)，是目前臨床醫(yī)生需要關(guān)注解決的問(wèn)題。近年來(lái)的臨床觀察研究表明[14]，配合使用中藥復(fù)方能夠明顯減輕放療過(guò)程中產(chǎn)生的不良反應(yīng)。益氣解毒方是田道法教授多年的經(jīng)驗(yàn)用方，其改善鼻咽癌患者放化療后的不良反應(yīng)效果顯著[15]。由黃芪、黨參、天花粉、黃連、白花蛇舌草、茯苓、甘草組成，其作用主要是益氣解毒，生津潤(rùn)燥，扶正祛邪，提升患者的免疫力，調(diào)節(jié)患者的氣虛體質(zhì)。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況取決于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡，而細(xì)胞的惡性增殖通常是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。抑制腫瘤細(xì)胞的增殖可以在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。課題組的前期結(jié)果顯示，益氣解毒方水提物可以抑制CNE2細(xì)胞增殖。在本次實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL不同濃度的水提物，采用RTCA、CCK-8、Cytation5分別監(jiān)測(cè)不同濃度益氣解毒方水提物對(duì)CNE2的細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果初步表明，隨著益氣解毒方水提物濃度的增加，CNE2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到抑制。

XIAP、Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，都是重要的抗凋亡分子，有實(shí)驗(yàn)研究顯示，Survivin在腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，會(huì)縮短患者的生存期、加速腫瘤復(fù)發(fā)等[16]，能夠直接抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-7的活性，也能夠與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成Survivin-CDK4復(fù)合體，使p21從CDK復(fù)合體中釋放出來(lái)并異位到線粒體，間接抑制Caspase-3活性，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、相對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[17]。XIAP能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[18]，可以通過(guò)抑制Caspases 酶原的激活、降低成熟Caspases的催化活性，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。PCNA則是細(xì)胞增殖核抗原，可反映細(xì)胞的增殖活躍程度，在DNA合成期，尤其在G1期到S期中發(fā)揮重要作用。PCNA的表達(dá)量影響到腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)過(guò)程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]，本次實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細(xì)胞36 h后，PCNA、Survivin、XIAP相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有下降，初步判斷益氣解毒方水提物可以通過(guò)下調(diào)PCNA、Survivin、XIAP蛋白的表達(dá)，抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分別從增殖數(shù)量、增殖形態(tài)、相關(guān)蛋白的表達(dá)情況幾方面進(jìn)行研究，初步說(shuō)明益氣解毒方水提物能夠抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖，其抑制作用可能與抑制相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)有關(guān)。課題組將繼續(xù)深入探討益氣解毒方抑制CNE2細(xì)胞增殖的機(jī)制，為益氣解毒方治療鼻咽癌提供更充足的科學(xué)依據(jù)。

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