基于網絡藥理學探討當歸芍藥散治療慢性盆腔炎作用機制

趙志成　史佩玉　鄧潔宜　邢萬里　王穎

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學探討當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制。方法 利用TCMSP數據庫篩選出當歸芍藥散活性成分及其相關靶標基因;使用Genecards數據庫篩選慢性盆腔炎靶標基因;借助STRING在線數據庫獲取靶標基因相互作用關系;采用David數據庫進行GO生物學過程分析和KEGG通路功能富集分析;利用cytoscape軟件構建當歸芍藥散治療慢性盆腔炎“活性成分-作用靶標-通路”網絡。結果 當歸芍藥散的核心活性成分有山（木示）酚、β-谷甾醇等，核心作用靶標有PTGS2、TNF、JUN等;GO生物學過程分析結果表明當歸芍藥散活性成分的基因功能主要表現在藥物反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調節(jié)、凋亡過程的負調節(jié)、信號轉導等生物學過程; KEGG結果表明當歸芍藥散主要作用與TNF、Toll樣受體等信號通路有關。結論 當歸芍藥散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等可能通過TNF、Toll樣受體等信號通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等關鍵靶標基因進而發(fā)揮其臨床功效，達到治療慢性盆腔炎等疾病的目的。

〔關鍵詞〕 慢性盆腔炎;當歸芍藥散;網絡藥理學;通路;機制

〔中圖分類號〕R285;R711? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.013

Exploration on Mechanism of Danggui Shaoyao Powder in Chronic Pelvic

Inflammatory Based on Network Pharmacology

ZHAO Zhicheng1， SHI Peiyu2， DENG Jieyi3， XING Wanli2， WANG Ying1*

（1. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 2. The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China; 3. The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory based on network pharmacology. Methods TCMSP database was used for screening effective components of Danggui Shaoyao Powder and related target genes; target genes for chronic pelvic inflammatory were screened by using Genecards database; interaction relationship of target genes was acquired by STRING online database; David database was used for GO biological progress analysis and pathway enrichment analysis of KEGG; active component-target-pathway network of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory was structured by Cytoscape software. Results The core active components of Danggui Shaoyao Powder were kaempferol， β-sitosterol， etc. and the core targets were PTGS2， TNF， JUN， etc. GO biological progress analysis showed that the gene functions of active components of Danggui Shaoyao Powder mainly manifested in biological progresses like drug reaction， positive regulation in transcription of RNA polymerase II promoter， negative regulation in apoptotic process， signal transduction and so on; KEGG results showed that the main function of Danggui Shaoyao Powder was related to signaling pathways like TNF signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway and so on. Conclusion Kaempferol， β-sitosterol and other active components of Danggui Shaoyao Powder may act on PTGS2， TNF-α， JUN， IL-6 and other key target genes through signaling pathways like TNF signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway， thus exerting its clinical efficacy， so as to achieve the goal of treating chronic pelvic inflammation and other diseases.

〔Keywords〕 chronic pelvic inflammatory; Danggui Shaoyao Powder; network pharmacology; pathway; mechanism

經方當歸芍藥散出自于醫(yī)圣張仲景所著的《金匱要略》，由當歸、茯苓、白術、白芍、澤瀉和川芎等藥物組成，主治“婦人懷妊，腹中疞痛”。臨床上可廣泛治療多種婦科疾病，是婦科常用方之一。

慢性盆腔炎是由女性上生殖道感染而引起的一種常見婦科疾病，患者常感到明顯的下腹部脹墜感、腰骶部酸脹疼痛，該疾病給患者身心健康帶來較大的不良影響[1]。近年來，有較多文獻證實當歸芍藥散對慢性盆腔炎具有確切的療效。戴璐等[2]通過臨床隨機對照實驗發(fā)現，當歸芍藥散治療慢性盆腔炎患者的總有效率高達90%，明顯優(yōu)于對照組使用甲硝唑聯(lián)合左氧氟沙星。同樣，傅劍鋒[3]把124例慢性盆腔炎患者隨機分為試驗組62例和參照組62例，試驗組和參照組分別使用當歸芍藥散和婦科千金片治療，結果顯示當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的療效明顯優(yōu)于婦科千金片。王志國[4]、張志鵬[5]和高升[6]等人通過大鼠動物實驗推測當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制與調節(jié)機體免疫功能，降低炎癥反應有關，但是研究均是通過動物實驗及相關指標的測量，其具體作用機制和信號通路等尚未完全闡明。

網絡藥理學與傳統(tǒng)的“一個藥物，一種活性成分，一個靶標基因，一種疾病”的思維模式及框架不同[7]，其通過構建多層次的網絡，從整體的角度去探究疾病與藥物間的聯(lián)系，具有良好的整體性，與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念與辨證論治原則相吻合[8]，已成為研究藥物與疾病間關系的重要方法之一。本研究通過對現有的數據進行分析處理，運用網絡藥理學的方法從分子機制和信號通路層面探討當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的具體作用機制。

1 資料和方法

1.1? 當歸芍藥散活性成分與靶標基因的獲取

本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“當歸”“白芍”“茯苓”“白術”“澤瀉”和“川芎”6個中藥成分作為Herb name檢索當歸芍藥散中當歸、白芍、茯苓、白術、澤瀉和川芎的所有活性成分，并利用口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）進行活性成分的篩選。OB是藥物吸收、分布、代謝、排泄特性中最重要的藥代學參數，其代表口服藥物到達體循環(huán)所占口服劑量的比例，是決定活性成分DL的關鍵指標之一[9]。因此，本課題通過設置OB≥30%和DL≥0.18[10]來進行當歸芍藥散活性成分的篩選，以提高數據分析處理的價值。通過TCMSP數據庫獲取當歸芍藥散活性成分對應的靶點，并輸入到STRING數據庫（https：//string-db.org/），獲得藥物靶點的標準基因名稱。

1.2? 慢性盆腔炎靶標基因的篩選

以”Chronic pelvic inflammatory disease”為關鍵詞從GeneCards： The Human Gene Databas（https：//www.genecards.org/）數據庫中搜索慢性盆腔炎相關靶標基因，設置Score>10以保證數據的可處理性。

1.3? 網絡模型的構建和分析

將當歸芍藥散所有靶標基因輸入到STRING數據庫（https：//string-db.org/），設置物種為“Homo sapiens”，選擇最高置信度”highest confidence”（0.900），并隱藏PPI網絡中不相關的節(jié)點，其余參數設置保持默認，獲取當歸芍藥散靶標基因PPI信息。同樣，獲取慢性盆腔炎靶標基因PPI信息。運用Cytoscape

3.7.0軟件（http：/cytoscape.org/）分別構建當歸芍藥散與慢性盆腔炎靶標基因PPI網絡，使用軟件中的Merge功能將兩個PPI網絡進行交集映射，得到當歸芍藥散治療慢性盆腔炎作用靶標的PPI網絡圖。將獲得的作用靶標輸入到DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）生物過程分析和KEGG通路分析。最后，將分析得到的KEGG通路與作用靶標、當歸芍藥散活性成分相對應，構建“活性成分—作用靶標—KEGG信號通路”網絡圖。

2 結果

2.1? 當歸芍藥散活性成分與靶標基因的篩選

在TCMSP數據庫中檢索當歸芍藥散各藥物活性成分，設置OB≥30%和DL≥0.18，同時篩去無對應靶標基因的成分，最終共獲得31個活性成分（見表1）與103個靶標基因。

2.2? 慢性盆腔炎靶標基因的篩選與PPI網絡的構建

在GeneCards： The Human Gene Databas數據庫中共篩選得到慢性盆腔炎靶標基因1014個，將當歸芍藥散靶標基因PPI網絡與慢性盆腔炎靶標基因PPI網絡進行交集映射，得到當歸芍藥散治療慢性盆腔炎作用靶標PPI網絡圖（由于部分作用靶標未參與網絡構建，故舍去），見圖1。圖中40個節(jié)點代表當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標，節(jié)點顏色越深代表其在網絡中度值越大，這40個作用靶標間有相互作用，表明這些作用靶標可能在某些層面上是相互關聯(lián)的并通過多方面、多途徑的協(xié)調起到治療慢性盆腔炎的作用。

2.3? GO生物學過程富集分析和KEGG通路富集分析

將上述得到的當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標導入David數據庫中，選取排名前15名的GO生物學過程富集分析和KEGG通路富集分析。使用Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com）分別繪制生物學過程氣泡圖（見圖2）和KEGG通路氣泡圖（見圖3）。由圖中可知，當歸芍藥散對凋亡過程的負調節(jié)、信號轉導等的影響較大;當歸芍藥散治療慢性盆腔炎涉及的通路主要是TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等。

2.4? 當歸芍藥散治療慢性盆腔炎“活性成分—作用靶標—通路”網絡

將KEGG通路富集分析得到的基因富集數排名前15的通路與當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標和活性成分相對應，得到“活性成分—作用靶標—KEGG信號通路”網絡，見圖4。該網絡由57個節(jié)點和506條邊組成，13個綠色菱形節(jié)點代表當歸芍藥散活性成分，29個紅色圓形節(jié)點代表當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標，15個橙色箭頭節(jié)點代表KEGG信號通路，邊代表三者間的相互作用。圖中節(jié)點越大，說明其在網絡中越重要，對慢性盆腔炎的影響也越大。網絡拓撲學結果表明，山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等活性成分與PTGS2、TNF-α、JUN等靶標基因在網絡中的節(jié)點度值排名靠前可能是當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的核心活性成分與核心作用靶標。網絡中每種活性成分對應多個作用靶標，每個作用靶標又連接多種活性成分，且多條通路中間通過共有作用靶標相互連接，表示當歸芍藥散治療慢性盆腔炎具備多成分、多靶點、多通路的特點，與中醫(yī)學整體觀念不謀而合。

3 討論

本研究基于網絡藥理學的方法探討當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制，結果顯示山柰酚、β-谷甾醇等可能是核心活性成分。山柰酚是一種黃酮類化合物，相關研究表明其具有抗氧化反應、抗炎、保護神經等諸多作用[11]。山柰酚可以抑制PTGS2（COX-2）、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥介質的釋放，減少炎癥反應的發(fā)生與減輕炎癥反應過程中出現的黏膜充血、水腫、局部紅腫熱痛等癥狀[12-13]。β-谷甾醇能夠增強機體氧自由基清除能力，提升血清NO含量，抑制TNF-α等炎性因子的聚集與釋放，下調NF-κB信號轉導通路的活化[14-15]，具有廣泛的抗炎活性。因此，筆者推測當歸芍藥散的關鍵活性成分與抗炎機制有一定的關聯(lián)，其通過抗炎機制作用于慢性盆腔炎，與近年來研究當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的機制基本一致。

本研究預測出PTGS2、TNF-α、IL-6、JUN等為當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的核心作用靶標。PTGS2又稱環(huán)氧酶-2（COX-2），在細胞受到促炎細胞因子等刺激時，COX-2 表達上調，并參與炎癥的形成和發(fā)展[16]。許多實驗研究表明，通過下調COX-2可以減輕炎癥反應[17-18]。TNF-α、IL-6為重要的炎性因子，其大量分泌能夠導致細胞因子水平的失衡與紊亂，最終引起盆腔周圍結締組織發(fā)生充血、水腫，逐漸演變成慢性盆腔炎[19-20]。c-jun在整個月經周期中對子宮內膜的細胞增殖和凋亡起作用，c-jun蛋白水平的循環(huán)變化可以防止基質細胞在晚期分泌期進入細胞凋亡[21]。因此，這些靶標基因都在炎癥反應、細胞增殖與凋亡、免疫反應中起到重要作用，是當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的關鍵作用靶標。

KEGG富集結果顯示，作用靶標顯著富集在TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等信號通路上。TNF信號通路是由于TNF與TNFR1相互結合而激活，激活的TNF信號通路可以加強促炎性細胞因子、生長因子和TNF-α本身等基因的表達[22]。Toll樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于白細胞介素-1受體超家族成員，TLRs廣泛存在于免疫細胞表面，可激活先天性免疫系統(tǒng)產生親炎癥細胞因子，啟動后天性免疫系統(tǒng)。TLRs介導免疫的信號轉導途徑中的 TLRs/NF-κB信號通路已基本闡明，此通路在免疫調節(jié)中發(fā)揮著極其重要的作用[23]。當歸芍藥散可能通過作用于該通路，啟動如后天免疫系統(tǒng)，激活相關活性因子如NF-κB，調控相關炎癥的基因表達，激活特異性免疫系統(tǒng)，抑制相關炎癥因子的釋放，從而起到抗炎等治療效果，其與王志國[4]、張志鵬[5]和高升[6]等人通過大鼠動物實驗推測與調節(jié)機體免疫功能有關相吻合。

綜上所述，本研究通過運用網絡藥理學的研究方法，對當歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制進行探討，結果表明：當歸芍藥散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等活性成分可能通過TNF、Toll樣受體等信號通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等關鍵靶標基因進而發(fā)揮其臨床功效，達到治療慢性盆腔炎等疾病的目的。分析結果與近年來基礎研究及臨床研究結果具有高度的一致性，具有一定的參考和提示價值，將為本課題組進一步深入設計實驗研究當歸芍藥散抗炎抗菌、調控機體免疫力等復雜效用機制奠定基礎，也為其它復雜成分方藥的研究提供一定的方法學參考。

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