益肺飲聯(lián)合CIK細胞對肺癌A549細胞免疫逃逸干預(yù)的研究

孫凱廷　蔡美　曾梅艷

〔摘要〕 目的 通過對肺癌細胞增殖和凋亡的分析以及肺癌細胞TGF-β、VEGF的表達情況，從分子水平上觀察益肺飲和CIK細胞聯(lián)合應(yīng)用時對肺癌細胞免疫逃逸的影響。方法 將肺癌細胞分為6組進行干預(yù)，A：10% FBS組、B：無藥血清組、C：CIK+無藥血清組、D：益肺飲組、E：CIK組、F：益肺飲+CIK組。采用CCK-8法、流式細胞儀檢測A549細胞的增殖、凋亡情況，運用ELISA法檢測A549細胞TGF-β、VEGF的表達情況。結(jié)果 （1）與A、B組比較，益肺飲和CIK單用或聯(lián)用時有明顯的增殖抑制、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用（P<0.05）;E組與F組比較，肺癌細胞的增殖、凋亡情況無明顯差異（P>0.05）。（2）相比于A、B組，D、E、F組對TGF-β、VEGF的分泌均有抑制作用（P<0.05）。與D、E組比較，F(xiàn)組對TGF-β的抑制效果最明顯（P<0.05），但VEGF的表達情況無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 益肺飲與CIK細胞聯(lián)合應(yīng)用能增強對肺癌細胞TGF-β的抑制效果，但對VEGF的抑制效果無明顯增強作用;不能增強對A549細胞增值抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 益肺飲;肺癌;CIK;細胞凋亡;免疫逃逸

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.007

Study on Intervention of Yifei Decoction Combined with CIK Cells in Immune

Escape of Lung Cancer A549 Cells

SUN Kaiting1， CAI Mei2*， ZENG Meiyan1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan

Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Yifei Decoction combined with CIK cells in immune escape of lung cancer cells at molecular level， through analysis of proliferation and apoptosis of lung cancer cells and expressions of transforming growth factor-β （TGF-β） and VEGF in the lung cancer cells. Methods The lung cancer cells were divided into 6 groups for intervention. A： 10% FBS group， B： drug-free serum group， C： CIK + drug-free serum group， D： Yifei Decoction group， E： CIK group， and F： Yifei Decoction + CIK group. The proliferation and apoptosis of A549 cells were detected by CCK-8 method and flow cytometry. ELISA was used to detect the expressions of TGF-β and VEGF in A549 cells. Results （1） Compared with the group A and the group B， single use of Yifei Decoction or CIK， or their combination showed significant effects of inhibition on proliferation and induction of apoptosis （P<0.05）. There was no significant difference in proliferation and apoptosis of lung cancer cells between the group E and the group F （P>0.05）. （2） Compared with the groups A and B， there was an effect of inhibition on the secretion of TGF-β and VEGF in the groups D， E and F （P<0.05）. Compared with the groups D and E， there was the most obvious inhibitory effect on TGF-β in the group F （P<0.05）， but there was no significant difference in the expression of VEGF （P>0.05）. Conclusion Yifei Decoction can enhance the inhibitory effect on TGF-β in lung cancer cells when combined with CIK cells， but it has no obvious enhancement effect on the inhibition of VEGF. And it can not enhance the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in A549 cells.

〔Keywords〕 Yifei Decoction; lung cancer; CIK; cell apoptosis; immune escape

由于腫瘤免疫逃逸機制的存在，腫瘤細胞可以通過一系列手段避開免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，從而使腫瘤發(fā)生進展、轉(zhuǎn)移?；诖耍S著對腫瘤免疫機制的研究逐漸深入，腫瘤的免疫治療成為了當(dāng)今研究的一大熱點，越來越多的免疫治療策略面世，為腫瘤患者帶來了新的福音，如過繼免疫治療、肺癌疫苗、免疫檢查點抑制等[1]。細胞因子誘導(dǎo)殺傷（cytokine induced killer， CIK）細胞是將游離人體的外周血單個核細胞加入多種細胞因子后培養(yǎng)一段時間后獲得的細胞。CIK具有抗腫瘤活性強，殺瘤譜廣，且具有很強的體外擴增能力等特點，作為過繼免疫治療的代表，具有明確的抗腫瘤效應(yīng)[2]。

腫瘤的免疫逃逸機制非常復(fù)雜，而其分泌相關(guān)的免疫抑制因子是其中重要的機制之一，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[3]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth，VEGF）[4]等，能夠改變腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤免疫反應(yīng)。作為腫瘤免疫逃逸的頭號主導(dǎo)者，大量實驗證明TGF-β通過多條途徑來發(fā)揮免疫抑制作用，如抑制免疫細胞的增殖和活化、調(diào)節(jié)細胞表型、抑制淋巴細胞分化、促進Treg細胞（一類能發(fā)揮重要腫瘤免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細胞）的產(chǎn)生等[5-6]。VEGF能夠刺激內(nèi)皮細胞的增殖和存活，導(dǎo)致新血管的形成，除此之外，VEGF能夠通過多種途徑發(fā)揮免疫抑制的作用，包括促進抑制性免疫細胞亞群的擴增[7]。同時針對VEGF的免疫抑制劑也一直是研究的熱點，聯(lián)合VEGF免疫抑制劑的抗腫瘤治療有望在未來成為新的治療策略[8]。

諸多研究表明，中醫(yī)藥可以下調(diào)TGF-β、VEGF等免疫抑制因子的表達[9]。因此，以提高患者生存質(zhì)量，改善患者癥狀，調(diào)節(jié)患者免疫功能的生物免疫聯(lián)合中醫(yī)藥治療模式可能成為肺癌治療的趨勢。

中藥復(fù)方益肺飲臨床用于治療老年肺癌有一定的療效，我們前期的實驗研究表明益肺飲具有良好的抑制肺癌細胞增殖誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究通過益肺飲含藥血清聯(lián)合CIK細胞，觀察對肺癌細胞增殖、凋亡以及免疫逃逸相關(guān)因子VEGF、TGF-β的影響，以進一步探索益肺飲的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

20只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為（200±20）g，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2? 實驗細胞

人肺癌細胞A549，由中國科學(xué)院干細胞庫提供。外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）：CIK細胞的前體細胞，由健康志愿者獲得知情同意后捐獻。

1.3? 實驗藥材

益肺飲：黃芪15 g，臭牡丹15 g，黨參15 g，茯苓10 g，土鱉蟲5 g，白術(shù)10 g，土貝母5 g，陳皮10 g，淫羊藿10 g，法半夏10 g，白花蛇舌草15 g，補骨脂10 g，瓜蔞殼10 g，半枝蓮15 g，甘草5 g。以上飲片采購于湖南省中醫(yī)藥研究院名醫(yī)堂中藥房，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥師彭偉鑒定。

1.4? 主要試劑與儀器

PRMI 1640培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清、L-Glutamine、200 mmol/L Solution均購自美國 Gibco 公司;Ficoll淋巴細胞分離液（美國GE Healthcare Bioscience公司）;人IFN-γ、IL-1α、IL-2均購自美國Peprotech公司;抗CD3單克隆抗體Anti-Human CD3（eBioscience公司）;Annexin V FITC/PI Kit、Anti-Human CD56， APC、Anti-Human CD8，PE、Anti-Human CD3， FITC均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;CCK-8試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）。流式細胞儀（BDFACSJazz碧迪醫(yī)療器械有限公司）;酶標(biāo)儀（MK3上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）。

1.5? 主要試劑配制

CIK培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基，加1 000 U/mL的IL-2，1%的L-谷氨酰胺，10%的FBS。

1.6? 方法

通過前期的濃度篩選，益肺飲含藥血清濃度在15%時，對肺癌A549細胞的增殖、凋亡都有較好的作用。故本實驗取15%濃度進行試驗。

1.6.1? 含藥血清制備? 將益肺飲藥物煎煮好后，減壓濃縮（減壓薄膜濃縮法：濃縮溫度80 ℃，濃縮轉(zhuǎn)速30 r/min），濃縮至432 mL，濃度約為2.22 g/mL，密封后4 ℃保存?zhèn)溆谩⒋笫?0只，分為2組，每組10只，設(shè)實驗組予益肺飲灌胃，對照組予等量生理鹽水灌胃。益肺飲方，按人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算，200 g大鼠等效量為160/60×6.25×4=66.7（g/kg），大鼠灌胃體積按1.5 mL/100 g，每日2次，連續(xù)3 d，第4天1次服用全天劑量，灌胃2 h后，麻醉解剖，腹主動脈采血，離心分離血清，獲得實驗組血清（含藥血清）及對照組血清（無藥血清），標(biāo)記后，-40 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2? CIK細胞培養(yǎng)? 收集健康志愿者外周血，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法[10]分離PBMC，取15 mL Ficoll淋巴細胞分離液加入至50 mL離心管中，加入1∶1鹽水稀釋的30 mL血液稀釋液沿管壁緩慢加至Ficoll淋巴細胞分離液面上;離心;可見離心管中出現(xiàn)明顯的分層，從上到下依次為稀釋的血漿混合液層、單核細胞層、分離液層、紅細胞層。小心吸取單核細胞層，置于新的離心管中，加入適量的生理鹽水。再次離心;重復(fù)上述步驟離心洗滌2次，獲得細胞。

將獲得的PBMC用1 640培養(yǎng)基（含10% FBS）按照1×106個/mL密度種入T25培養(yǎng)瓶后，加入1%

L-谷氨酰胺，3 000 U/mL的IFN-γ，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)24 h后，加入1 000 U/mL的IL-2，2 000 U/mL的IL-1α，300 ng/mL的CD3單克隆抗體;每天觀察細胞并計數(shù)，通過補充含1 000 U/mL IL-2，1%的L-谷氨酰胺，10%的FBS的CIK培養(yǎng)基，使細胞密度不超過2×106個/mL。約2周后即可收獲CIK細胞。

1.6.3? CCK-8法檢測益肺飲聯(lián)合CIK細胞對A549細胞增殖影響? 共設(shè)置6個分組，A：10%FBS組（10%FBS）、B：無藥血清組（10%無藥血清）、C：CIK+無藥血清組（CIK+10%無藥血清）、D：益肺飲組（15%含藥血清）、E：CIK組、F：益肺飲+CIK組（15%含藥血清+CIK）

根據(jù)實驗設(shè)計，取生長良好的肺癌A549細胞計數(shù)，將A549細胞以3 000個/孔種入96孔板，CIK細胞以20∶1的效靶比鋪板，每組設(shè)置4個復(fù)孔。12 h后，根據(jù)分組進行干預(yù)。干預(yù)24 h后，吸棄孔板中原液，加入新鮮培養(yǎng)基，再加入CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處各孔的吸光度。抑制率按以下公式計算：

抑制率=（1-實驗組OD值均數(shù)/10%FBS組OD值均數(shù)）×100%

1.6.4? 流式細胞儀檢測益肺飲聯(lián)合CIK細胞對A549細胞凋亡影響? 分組同前，根據(jù)實驗設(shè)計，取生長良好的肺癌A549細胞，按照實驗分組進行干預(yù)，其中CIK細胞效靶比為20∶1。24 h后收集細胞，離心洗滌細胞2～3次。根據(jù)Annexin V FITC/PI Kit說明書，每管取500 μL流式緩沖液重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V FITC/10 μL PI，室溫避光孵育5 min后上機檢測。

1.6.5? ELISA法檢測A549細胞免疫逃逸相關(guān)因子TGF-β1、VEGF? 取生長良好的A549細胞，根據(jù)實驗要求，分別進行干預(yù)。干預(yù)24 h后，吸取細胞上清液，加入至離心管中，800 g，5 min，離心后吸取上清，按照實驗分組進行標(biāo)記，根據(jù)ELISA試劑盒所示步驟（雙抗夾心法），分別檢測TGF-β、VEGF的OD值，各組每個指標(biāo)設(shè)3個復(fù)孔，取平均OD值根據(jù)標(biāo)準曲線計算細胞因子的表達水平。

1.7? 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布及組間方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立t檢驗，若不符合方差齊性，采用Wilconxon秩和檢驗，檢驗水平采用a=0.05。

2 結(jié)果

2.1? CCK-8法檢測細胞增殖活性

通過CCK-8實驗，各組對A549細胞的抑制率見表1。根據(jù)實驗結(jié)果，益肺飲和CIK細胞單用及聯(lián)用其抑制率與A組、B組相比有明顯差異（P<0.05）。E組增殖抑制最明顯，平均抑制率可達75.07%，C、E、F組之間比較抑制率無明顯差異，但均優(yōu)于D組（P<0.05）。

2.2? 流式細胞儀檢測益肺飲聯(lián)合CIK細胞對A549細胞凋亡影響

通過流式檢測，實驗結(jié)果顯示（見表2、圖1）：D組的凋亡率可達（17.20±1.72）%，E組的凋亡率可達（25.13±3.00）%，F(xiàn)組凋亡率可達（26.57±3.04）%，均明顯優(yōu)于A、B組（P<0.05）。C、E、F組促凋亡作用明顯優(yōu)于D組（P<0.05），但是3組兩兩比較無明顯差異（P>0.05）。

2.3? ELISA法檢測免疫逃逸相關(guān)因子TGF-β1、VEGF

ELISA法檢測結(jié)果表明（見表3），與A組和B組相比，D組和E組對TGF-β、VEGF的分泌均有一定的抑制作用（P<0.05），但D、E兩組比較無明顯差異（P>0.05）。各組間兩兩比較，F(xiàn)組對TGF-β的抑制效果最明顯（P<0.05），F(xiàn)組VEGF濃度最低290.17 pg/mL，但與D、E組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

正常機體的免疫系統(tǒng)可識別惡變的腫瘤細胞，并通過特異性免疫應(yīng)答來清除腫瘤細胞。然而，因為免疫逃逸機制的存在，使得機體免疫系統(tǒng)無法有效及時地清除異變細胞。腫瘤免疫逃逸的機制是如今研究的熱點，這有助于進一步尋找有效的藥物靶點。

李宏良等[11]的研究顯示天冬、薏苡仁、北沙參等中藥有助于提高CIK細胞活性，促進其增殖，為CIK聯(lián)合中藥治療方法提供了實驗依據(jù)。孟祥林等[12]的研究顯示中醫(yī)扶正固本法結(jié)合CIK細胞過繼免疫在改善患者CEA、AFP、CA125腫瘤標(biāo)志物以及CD3、CD4免疫功能方面能更好地降低患者腫瘤標(biāo)志物水平，改善患者的免疫功能。鄭心等[13]研究報告了肺抑瘤膏聯(lián)合DC-CIK細胞可降低血清VEGF水平。由此可見中醫(yī)藥聯(lián)合CIK治療惡性腫瘤不失為一種新的治療方向和思路。

基于此，通過益肺飲聯(lián)合CIK細胞對肺癌細胞免疫逃逸干預(yù)的實驗研究，以期在細胞及分子水平上研究益肺飲含藥血清聯(lián)合CIK細胞的抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。通過CCK-8、流式細胞檢測，我們發(fā)現(xiàn)益肺飲聯(lián)合CIK細胞時對A549細胞的增殖抑制及促凋亡并沒有明顯的協(xié)同作用，考慮原因可能是含藥血清對CIK細胞活性有影響。通過ELISA法檢測經(jīng)藥物干預(yù)后的A549細胞上清液，結(jié)果表明，益肺飲含藥血清能夠有效地降低A549細胞分泌TGF-β1、VEGF的濃度。益肺飲聯(lián)合CIK細胞組對TGF-β濃度抑制顯得更為有效，但益肺飲聯(lián)合CIK細胞并不能對VEGF產(chǎn)生更為有效的抑制效果。TGF-β的分泌可因不同的刺激誘導(dǎo)，包括類固醇、維甲酸、表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF），神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）、淋巴細胞活化劑等。而VEGF可由多種信號分子包括低氧、腫瘤壞死因子、NO、成纖維細胞生產(chǎn)因子、白細胞介素-1及胰島素生長因子等誘導(dǎo)產(chǎn)生。益肺飲與CIK細胞聯(lián)用時對TGF-β1及VEGF的分泌產(chǎn)生不同抑制效果的原因，或許與其抑制機制有關(guān)，這需要之后進一步的深入研究。

通過本研究，我們雖然未取得預(yù)期的實驗結(jié)果，益肺飲聯(lián)合CIK細胞并不能增強對肺癌A549細胞的增殖抑制及抗凋亡效應(yīng)，同時也沒有對VEGF的分泌產(chǎn)生更明顯的抑制效果。但是我們證實了益肺飲聯(lián)合CIK可以有效降低A549細胞分泌TGF-β。這為我們臨床使用益肺飲治療肺癌患者提供了實驗數(shù)據(jù)支持，同時為進一步研究益肺飲對免疫逃逸干預(yù)的機制提供了研究方向。

近年來，腫瘤的免疫治療是最具有前景也是最熱門的研究之一。免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療打開了一扇新的大門，越來越多的免疫檢查靶點被發(fā)現(xiàn)，如CTLA-4、PD-1、TIM3、LAG-3、CD122等[14-15]。關(guān)于肺癌的免疫治療一直是研究熱點，免疫治療聯(lián)合化療已經(jīng)成為治療非小細胞肺癌一線方案[16]。大量的研究表明，中藥能夠通過多種機制來調(diào)節(jié)肺癌細胞免疫抑制[17]，因此，中醫(yī)藥聯(lián)合免疫治療是一個很有價值的研究方向，同時面對越來越豐富的免疫治療，如何避免免疫治療耐藥，又將為中醫(yī)藥的研究提供一個新的思路。

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