蘘荷與抗生素配伍前后對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的比較

蔣 平, 李雅茹, 孫桃桃, 陶 穎, 張新義, 倪仁潔, 汪 磊, 黃仁術(shù)

蘘荷與抗生素配伍前后對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的比較

蔣 平1,2, 李雅茹1, 孫桃桃1,2, 陶 穎1, 張新義1, 倪仁潔1, 汪 磊1,*黃仁術(shù)1,2

(1. 皖西學(xué)院生物制藥工程學(xué)院, 安徽，六安 237012；2. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室, 安徽，六安 237012)

為了探討常用抗生素與蘘荷配伍后的聯(lián)合抑菌效果。使用蘘荷、頭孢拉定、左氧氟沙星、頭孢曲松、青霉素和頭孢呋辛為試驗(yàn)藥物，使用金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌種，采用倍比稀釋法和棋盤稀釋法分別檢測(cè)最小抑菌濃度和聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)。表明蘘荷、青霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢呋辛、左氧氟沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為32 mg/mL和0.25、2、2、0.5、0.125 μg/mL，蘘荷分別與頭孢曲松、青霉素聯(lián)用后表現(xiàn)為相加作用，蘘荷分別與頭孢拉定、頭孢呋辛聯(lián)用后表現(xiàn)為無關(guān)作用，蘘荷與左氧氟沙星聯(lián)用后表現(xiàn)為拮抗作用。表明蘘荷分別與頭孢曲松、青霉素聯(lián)用可以達(dá)到高效抑制金黃色葡萄的作用，對(duì)蘘荷臨床應(yīng)用具有參考意義。

蘘荷；抗生素；金黃色葡萄球菌；最小抑菌濃度；聯(lián)和抑菌指數(shù)

近年來由于抗生素的廣泛使用帶來了諸多問題，其中最突出的問題就是細(xì)菌耐藥性，尤其是超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，給人們的生命安全帶來極大的影響。屠銀芳等[1]在婦幼感染中耐藥金黃色葡萄球菌研究中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、青霉素類出現(xiàn)較高的耐藥性，其中青霉素的耐藥率高達(dá)75%以上。龐偉斌等[2]分別對(duì)臨床標(biāo)本和食品中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對(duì)臨床常用的芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素等耐藥率較高。可見在臨床和食品中，金黃色葡萄球菌耐藥性越發(fā)嚴(yán)重，會(huì)直接導(dǎo)致臨床中可選用的抗生素種類越來越少。

為了有效的解決抗生素耐藥越發(fā)嚴(yán)重等問題，近年來國(guó)內(nèi)學(xué)者從中藥的角度來考慮抗菌抑菌的問題，以期緩解抗生素耐藥性的問題。但是中藥的抗菌效果不及抗生素，致使其在臨床中很少單獨(dú)使用；而多與抗生素一起聯(lián)合應(yīng)用。目前已發(fā)現(xiàn)，苦參[3]、勒馬回[4]、膽木[5]等多種中藥具有提高抗生素抗菌效果和降低抗生素使用量的作用，有效的減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。但是在中西藥聯(lián)用時(shí)也要考慮藥物之間的配伍效應(yīng)，防止藥物之間拮抗和不良反應(yīng)的發(fā)生。

蘘荷是一種食藥兼用的保健型植物，其根、莖、花、葉均可制藥，具有消食健胃、清理腸道、活血化瘀、祛痰止咳、溫中理氣等功效。黃仁術(shù)等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘘荷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均具有顯著的抑制作用。但是，蘘荷與抗生素的聯(lián)合后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果相關(guān)文獻(xiàn)少見。因此，本試驗(yàn)主要探究蘘荷及其與抗生素的聯(lián)合用藥后對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果，以期對(duì)臨床治療細(xì)菌性疾病的提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（CMCC 26112），購(gòu)自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。

1.2 藥品和試劑

蘘荷采自大別山區(qū)，并由皖西學(xué)院黃仁術(shù)教授鑒定；青霉素鈉（國(guó)藥準(zhǔn)字H20033946，魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；頭孢拉定（國(guó)藥準(zhǔn)字H44023313，廣州白云山天心制藥股份有限公司）；頭孢曲松鈉（國(guó)藥準(zhǔn)字H10920097，深圳華潤(rùn)九新藥業(yè)有限公司）；頭孢呋辛鈉（國(guó)藥準(zhǔn)字H20051155，華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司）；鹽酸左氧氟沙星注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H19990324，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；LB 液體( 批號(hào)為 20170921) ，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司; LB 固體( 批號(hào)為 20171030－00) ，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司; MH固體( 批號(hào)為20180223001) ，購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘘荷的提取

在冷凝回流裝置中加入5 g蘘荷和425 mL 95%乙醇溶液，并置于95 ℃水浴鍋中加熱1 h。使用定性濾紙乘熱過濾，過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，再將濃縮液放入水浴鍋除去乙醇，并使用蒸餾水定容，所得蘘荷工作液濃度為0.5 g/mL。

1.2.2 抗生素工作液制備

稱取適量青霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢呋辛和左氧氟沙星置于100 mL 容量瓶中，使用生理鹽水定容至工作液濃度為500 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 培養(yǎng)基的配制

按照說明書的要求配置MH瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基和LB肉湯培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值至7.2 ± 0.1，高壓滅菌，備用。

1.2.4 菌液制備

取出凍存的金黃色葡萄球菌，將其接種到 LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24 h（37 ℃）進(jìn)行活化，取1~3個(gè)單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng) 24 h后計(jì)數(shù)，臨用前血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，稀釋菌液濃度至1.5×105CFU/mL。

1.2.5 最小抑菌濃度測(cè)定（MIC）

按照美國(guó)臨床試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的方法：將各個(gè)抗生素工作液和蘘荷工作液分別加入已滅菌的MH瓊脂培養(yǎng)基中，使 MH 瓊脂培養(yǎng)基中抗生素終濃度16、8、4、2、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，蘘荷終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/mL，之后將含藥培養(yǎng)基倒入6孔板中；另取不含藥的MH瓊脂培養(yǎng)基倒入6孔板中作為陰性和陽性對(duì)照，冷凝備用。

向含藥培養(yǎng)基孔和陽性對(duì)照孔的培養(yǎng)基中分別加入100 μL金球菌的菌液（1.5×105CFU/mL），陰性對(duì)照組中加入等量的生理鹽水，用涂布器涂布均勻。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后觀察以無菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。

1.2.6 體外聯(lián)合抑菌（FIC）指數(shù)的測(cè)定

采用棋盤稀釋法[5]測(cè)定蘘荷與頭孢拉定、左氧氟沙星、頭孢曲松、青霉素、頭孢呋辛聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)金球菌的抑菌效果。以抗生物和蘘荷單用時(shí)MIC值的2倍、1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍為組合，方法同“最小抑菌濃度( MIC) 測(cè)定”。并按照公式計(jì)算FIC指數(shù)[FIC 指數(shù)=(甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC /甲藥單用時(shí)的MIC)+(乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC /乙藥單用時(shí)的MIC)]，藥物的配伍效應(yīng)按照表1分析。每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。

表1 配伍效應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Classification criteria for compatibility effects

FIC值范圍配伍效應(yīng) FIC ≤ 0.5協(xié)同作用 0.5 < FIC ≤ 1相加作用 1 < FIC ≤ 2無關(guān)作用 FIC > 2拮抗作用

2 結(jié)果與分析

蘘荷與抗生素MIC檢測(cè)的結(jié)果表明，蘘荷、青霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢呋辛、左氧氟沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為32 mg/mL和0.25、2、2、0.5、0.125 μg/mL，蘘荷分別與頭孢拉定、頭孢呋辛聯(lián)用后表現(xiàn)為無關(guān)作用，蘘荷與左氧氟沙星聯(lián)用后表現(xiàn)為拮抗作用，蘘荷分別與頭孢曲松、青霉素聯(lián)用后表現(xiàn)為相加作用。

表2 蘘荷與五種抗生素聯(lián)合用藥時(shí)體外抑菌指數(shù)

Table 2 the FIC results of Zingber mioga and five antibiotics combinations

聯(lián)合藥物 蘘荷 頭孢拉定 左氧氟沙星 頭孢曲松 青霉素 頭孢呋辛FIC值作用效應(yīng) MIC μg/mL MICMIC MICMIC MICMIC MICMIC MICMIC MICMIC 單合 單合 單合 單合 單合 單合 蘘荷＋青霉素 3200016000 0.250.125 1相加 蘘荷＋頭孢拉定 3200016000 21.5 1.25無關(guān) 蘘荷＋頭孢曲松 3200016000 21 1相加 蘘荷＋頭孢呋辛 3200016000 0.50.51.5無關(guān) 蘘荷＋左氧氟沙星 3200064000 0.1250.0625 2.5拮抗

3 討論

蘘荷味辛、性溫，具有活血調(diào)經(jīng)、祛痰止咳、解毒消腫等功效。可用于跌打損傷、咳嗽氣喘、癰疽腫毒等病治療，并具有良好的抗菌效果[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蘘荷多糖和總黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的體外抑制作用[6-7]。王玉榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蘘荷花蕾甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有較強(qiáng)抑菌作用，表明蘘荷可以有效的抑制金黃色葡萄球菌，并表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。與抗生素相比，蘘荷抗菌作用不是依靠單一成分，而是蘘荷多成分的協(xié)同作用。呂晴等[9]和Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蘘荷中含有β-欖香烯、β-石竹烯、α-水芹烯、β-水芹烯、α-蒎烯、β-蒎烯等多種抗菌活性成分，這些活性成分具有較好的抗菌作用。劉松鑫[11]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可通過抑制金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性、可溶性蛋白和核酸合成來細(xì)菌的生長(zhǎng)，可造成菌體破裂、死亡。由于抗生素的長(zhǎng)期濫用易導(dǎo)致主要病原菌出現(xiàn)耐藥性，通過中草藥與抗生素類聯(lián)用可達(dá)到一定的協(xié)同作用，彌補(bǔ)中草藥和抗菌素單獨(dú)使用藥效不足等問題[12]。

由于抗生素濫用導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌等耐藥菌的出現(xiàn)，而使用傳統(tǒng)中藥替代抗生素應(yīng)用于臨床抗菌抑菌治療的呼聲越來越高，并且許多專家學(xué)者在這一方面取得諸多成果。景明來等[13]通過抗菌藥物與中藥聯(lián)合治療婦科慢性盆腔感染時(shí)發(fā)現(xiàn)，中西醫(yī)綜合治療的臨床效果明顯優(yōu)于僅用中醫(yī)治療者。房華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，亞胺培南與小檗堿、頭孢他啶與五倍子聯(lián)合可以增加各自對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的敏感性。本研究通過棋盤稀釋法測(cè)定蘘荷與抗生素的聯(lián)合抑菌指數(shù)，結(jié)果表明蘘荷分別與頭孢曲松、青霉素聯(lián)用后表現(xiàn)為相加作用。與上述結(jié)論相似；表明中西藥聯(lián)用會(huì)增強(qiáng)抗生素的抗菌能力。

但是，我們?cè)谂R床用藥時(shí)應(yīng)注意中藥與抗生素聯(lián)用存在嚴(yán)格的配伍效應(yīng)。蔡長(zhǎng)春等[15]研究發(fā)現(xiàn)，頭孢唑林、頭孢呋辛、左氧氟沙星、克林霉素與清開靈注射液、雙黃連粉針劑聯(lián)合應(yīng)用后，抗生素MIC值顯著的下降，但其在對(duì)86例醫(yī)院內(nèi)金黃色葡萄球菌感染患者的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用抗菌藥物治療的 45例，無不良反應(yīng)發(fā)生；聯(lián)合中藥制劑治療的41例患者中，有2例出現(xiàn)皮疹。姜永祥等[16]認(rèn)為中西藥聯(lián)合應(yīng)用可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)或負(fù)向作用，如含有機(jī)酸類的中藥不宜與磺胺類、氨基糖苷類、制酸藥同服，可能會(huì)降低其療效，增加其毒性，從而增加醫(yī)療事故的發(fā)生率；梁生林等[17]發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類抗菌藥能降低氨茶堿的總清除率，升高血藥濃度而導(dǎo)致中毒反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，蘘荷分別與頭孢拉定、頭孢呋辛聯(lián)用后表現(xiàn)為無關(guān)作用，與左氧氟沙星聯(lián)用后表現(xiàn)為拮抗作用，表明中藥與抗生素的聯(lián)用不是簡(jiǎn)單的兩兩相加，必須做好充分的臨床應(yīng)用及臨床前研究，防止醫(yī)療事故的發(fā)生。

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COMPARISON OF ANTIBACTERIAL EFFECT AGAINSTBEFORE AND AFTER THE COMBINATION OFWITH COMMON ANTIBIOTICS

JIANG Ping1,2, LI Ya-ru1,2, SUN Tao-tao1,2, TAO Ying1, ZHANG Xin-yi1, NI Ren-jie1, WANG Lei1,*HUANG Ren-shu1,2

(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an, Anhui 237012, China; 2. Anhui Engineering Laboratory for Conservation and Sustainable Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources, Lu’an, Anhui 237012, China)

To investigate the antibacterial effect of common antibiotics combined with., penicillin, cefradine，ceftriaxone, cefuroxime and levofloxacin were selected as investigational drug, and thewas selected as the tested bacterium, and then the method of double dilution and chessboard dilution method were used to detect the minimal inhibitory concentration and fractional inhibitory concentration, respectively.The results showed that the minimal inhibitory concentration ofpenicillin, cefradine, ceftriaxone, cefuroxime and levofloxaci were 32 mg/mL, 0.25 μg/mL, 2 μg/mL, 2 μg/mL, 0.5 μg/mL and 0.125 μg/mL, respectively. It showed the additive action in antibacterial effect for the combination ofwith penicillin or ceftriaxone, independent action for the combination with cefradine or cefuroxime, and antagonistic action for the combination with levofloxacin.The combination ofand penicillin or ceftriaxone can effectively inhibit thewhich has a reference for the clinical application.

; antibiotics;; minimal inhibitory concentration; fractional inhibitory concentration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2021.02.016

1674-8085(2021)02-0094-04

2020-10-12；

2021-01-07

國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；安徽省高校自然科學(xué)項(xiàng)目（KJ2018A0413, KJ2017a407）；安徽省本科質(zhì)量工程項(xiàng)目（2016sjjd079, 2018zygc075, 2018jyxm1153,2018jyxm1155,2018SXZX49）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201910376056）；皖西學(xué)院本科質(zhì)量工程項(xiàng)目（wxxy2017116，wxxy2018026，WXXY2019006）；皖西學(xué)院自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（WXZR201932）；皖西學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（WXZR201629）；安徽省高校優(yōu)秀拔尖人才培育項(xiàng)目（gxgnfx2018027），皖西學(xué)院校級(jí)扶貧專項(xiàng)（WXZR201740）

蔣 平(1989-)，男，安徽定遠(yuǎn)人，助教，從事中西藥藥理及中藥應(yīng)用研究(E-mail:837264050@qq.com);

李雅茹(1996-)，女，安徽宿州人，皖西學(xué)院生物制藥工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)2016級(jí)本科生(E-mail:3034125357@qq.com);

孫桃桃(1992-)，女，安徽亳州人，助教，碩士，主要從事中西藥藥理及中藥應(yīng)用研究(E-mail:694536660@qq.com);

陶 穎(1998-)，女，安徽蕪湖人，皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)2017級(jí)本科生(E-mail:3029145791@qq.com);

張新義(1998-)，男，安徽蒙城人，皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)2017級(jí)本科生(E-mail:407091299@qq.com);

倪仁潔(1997-)，女，安徽蕪湖人，皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)專業(yè)2017級(jí)本科生(E-mail:1324196221@qq.com);

汪 磊(2001-)，女，安徽安慶人，皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)2018級(jí)本科生(E-mail:1141950082@qq.com);

*黃仁術(shù)(1977-)，女，新疆阿克蘇人，教授，碩士，主要從事天然活性物質(zhì)及中西藥藥理研究(E-mail:ahhrs@126.com).