一株具α-糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細(xì)菌活性的香椿內(nèi)生真菌的篩選與鑒定

王曉敏,萬(wàn)景瑞,史冠瑩,張樂(lè),蔣鵬飛,程菁菁,王趙改

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州, 450000)

香椿是我國(guó)特有的集材、菜、藥為一體的珍貴木本植物，具有抗逆性強(qiáng)、不易發(fā)生病蟲害的特點(diǎn)[1]。據(jù)文獻(xiàn)記載，香椿含有多酚、黃酮、生物堿、皂苷、萜類等多種活性物質(zhì)[2-3]，具有重要的生物活性，如降血糖[4-5]、抗氧化[6-7]和抗菌活性[8-9]等。

內(nèi)生真菌是一類生活在宿主植物組織中，并對(duì)其組織不引起明顯病癥的微生物。根據(jù)共生理論，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[10-11]，且具有生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵周期短、易于工業(yè)化等特點(diǎn)[12]，因此，植物內(nèi)生真菌已成為尋找和發(fā)現(xiàn)各種天然生物活性物質(zhì)的新資源。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類治療Ⅱ型糖尿病的口服降糖藥，主要通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后高血糖[13-14]。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)對(duì)糖尿病患者控制餐后血糖水平具有重要意義?；钚匝跏羌?xì)胞代謝中所產(chǎn)生的自由基，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂肪、DNA等生物大分子的氧化損傷，而長(zhǎng)期處于氧化損傷狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致諸如心血管疾病、慢性炎癥等慢性疾病[15]。因此，抗氧化劑的研究對(duì)治療心血管疾病、延緩機(jī)體衰老也具有重要意義。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和濫用，耐藥菌株不斷增加，抗感染治療陷入耐藥菌危機(jī)之中。為了應(yīng)對(duì)耐藥菌感染，人們不斷研究和開發(fā)新型抗菌藥物。而香椿內(nèi)生真菌作為一種天然活性物質(zhì)資源庫(kù)，對(duì)開發(fā)具有降糖、抗氧化和抗菌活性的活性物質(zhì)具有重要的研究意義。

因此，本研究首次以河南香椿植物為材料，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化活性和抗細(xì)菌活性為指標(biāo)，篩選出高活性菌株。然后通過(guò)rDNA序列分析，在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行菌株的分類鑒定。這為后期香椿內(nèi)生真菌的開發(fā)利用提供了理論參考，為從香椿內(nèi)生真菌中獲得結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣高效的次生代謝產(chǎn)物提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅油香椿，采自河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香椿示范基地；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及PCR相關(guān)試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯基葡萄糖苷，美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、鏈霉素，北京索萊寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其他分析純?cè)噭?，鄭州博越商貿(mào)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SII-01-00立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；R-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；GENESYS 10S UV-VIS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；XSP-BM8A型生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosystems；DYCP-31DN電泳儀，北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化[16]

表面消毒：用流水將香椿莖表面浮土沖洗干凈，然后用無(wú)菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，在無(wú)菌條件下，將香椿莖用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇浸泡1 min，次氯酸鈉溶液(有效氯30 g/L)浸泡1min，70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水漂洗3次，無(wú)菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?/p>

菌株的分離、純化：表面消毒好的香椿莖，無(wú)菌條件下，用滅菌剪刀剪成0.5 cm左右的小塊放在馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上，每板3～5根，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。當(dāng)植物組織內(nèi)部向培養(yǎng)基周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，將內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)移到新的PDA平板培養(yǎng)基上對(duì)其劃線培養(yǎng)，3～5 d后分離純化得到單菌落，然后轉(zhuǎn)移到PDA斜面上，4℃冰箱保存，編號(hào)備用。其中，PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20。

1.2.2 次級(jí)代謝產(chǎn)物的制備

發(fā)酵：將4℃冰箱保藏的香椿內(nèi)生真菌接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)4 d，然后接種到盛有200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，28 ℃ 150 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d。其中，PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖10，麥芽糖20，甘露醇20，蛋白胨5，酵母膏3，味精5，pH 6.0。

提取：菌株發(fā)酵完成后，發(fā)酵培養(yǎng)液先用勻漿攪拌機(jī)攪碎，再用布氏漏斗抽濾，得到發(fā)酵液和菌絲體。然后分別采用等量乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液和菌絲體進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，合并得到乙酸乙酯提取液。

濃縮：將乙酸乙酯提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃減壓濃縮蒸干，即得到菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物浸膏。

樣品液配制：將濃縮后的發(fā)酵浸膏用無(wú)水乙醇溶解配制成10 g/L的溶液。備用待測(cè)。

1.2.3 體外活性評(píng)價(jià)

1.2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性[17]

在620 μL 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)中，加入5 μL α-葡萄糖苷酶溶液與10 μL待測(cè)樣品液，37.5 ℃預(yù)熱20 min，加入10 μL對(duì)硝基苯基葡萄糖苷(pNPG，10 mmol/L)作為反應(yīng)底物以啟動(dòng)反應(yīng)，37.5 ℃下反應(yīng)30 min。然后加入650 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在 410 nm處測(cè)定酶活。同時(shí)以相同濃度的阿卡波糖溶液為對(duì)照，平行測(cè)定3次。樣品液用量如表1所示。

表1 反應(yīng)條件 單位：μL

計(jì)算公式(1)如下：

(1)

式中：A空白為未知樣品液的改光度值;A樣品為樣品與酶反應(yīng)后的吸光度值；A背景為樣品空白吸光度值。

1.2.3.2 抗氧化活性

(1)ABTS+·清除活性[18-19]

參照OZCAN[18]提出的用H2O2/ABTS/醋酸鹽緩沖液體系來(lái)生成ABTS+·，這種方法產(chǎn)生的ABTS+·十分穩(wěn)定。具體方法如下：

將0.549 g ABTS+·溶解在100 mL的2 mmol/L H2O2醋酸鈉鹽溶液中(最終濃度10 mmol/L)，室溫放置1 h，有特征的藍(lán)綠色ABTS+·產(chǎn)生。然后將10 mmol/L 的ABTS+·用醋酸鈉鹽緩沖液(pH 3.6)稀釋到734 nm下吸光度(0.70±0.02)。取150 μL無(wú)水乙醇溶解的樣品溶液，加入3 mL ABTS+·溶液，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定反應(yīng)液在734 nm下的吸光度值。同時(shí)以相同濃度的Vc溶液為對(duì)照，平行測(cè)定3次。ABTS+·清除率計(jì)算如公式(2)：

(2)

式中：A0為未加樣的ABTS+·的吸光度值；At為樣品與ABTS+·反應(yīng)后的吸光度值；B為樣品空白的吸光度值。

(2)DPPH·清除活性[20]

準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH，用無(wú)水乙醇定容至250 mL，配成2×10-4mol/L的DPPH溶液。取樣品液和2×10-4mol/L DPPH溶液各2 mL分別加入試管中，搖勻，室溫下避光放置30 min，使其充分反應(yīng)。以無(wú)水乙醇為參比在517 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定其吸光度Ai；同時(shí)測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH溶液的混合液的吸光度Ac和2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇的吸光度Aj。同時(shí)以相同濃度的Vc溶液為對(duì)照，平行測(cè)定3次。計(jì)算DPPH·清除率見(jiàn)公式(3)：

(3)

1.2.3.3 抗細(xì)菌活性[21]

病原細(xì)菌：歐文氏菌(Erwiniasp.) (ATCC 02203)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum) (ATCC 01474)、水稻白葉枯(Xanthomonasoryzae) (ATCC 11602)、豪氏變形桿菌(Proteushauseri) (ATCC 10497)、銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa) (ATCC 10500)、大腸桿菌(Escherichiacoli) (ATCC 25922)、金黃色葡萄糖球菌Staphylococcusaureus(ATCC 25923)。

測(cè)試細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h。

將培養(yǎng)基在121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至約40～50 ℃后，在凈化工作臺(tái)上將無(wú)菌培養(yǎng)基倒入90 mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后，吸取200 μL菌懸液置于培養(yǎng)皿中央，用涂布棒涂布均勻，然后用滅菌鑷子在培養(yǎng)皿中放入無(wú)菌牛津杯(直徑Φ=6 mm)，在其中加入200 μL供試樣液(平行3次)，同時(shí)作溶劑和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。平板于30 ℃培養(yǎng)12 h后觀察并測(cè)定抑菌圈的直徑(mm)。其中，陽(yáng)性對(duì)照為相同濃度的鏈霉素溶液，陰性對(duì)照為無(wú)水乙醇溶劑。

其中，液體培養(yǎng)基：

營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉提取物3，NaCl 5，pH 7.0。

胰化酪蛋白胨大豆肉汁培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)30。

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。

固體培養(yǎng)基：

營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉提取物3，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0。

胰化酪蛋白胨大豆肉汁瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：TSB 30，瓊脂20。

LB瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將待鑒定的內(nèi)生真菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃連續(xù)培養(yǎng)4～5 d，觀察菌落形態(tài)特征。挑取菌落邊緣菌絲，制作水浸片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)特征。

1.2.4.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定[22]

(1)DNA提取：從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4～5 d?；蚪MDNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(150 V，100 mA、20 min)。4 ℃保存?zhèn)溆?，或?20 ℃中長(zhǎng)期保存。

(2)PCR擴(kuò)增18S序列

18S rDNA擴(kuò)增引物：NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)/NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃、4 min，變性94 ℃、45 s，退火55 ℃、45 s，延伸72 ℃、1 min， 共30個(gè)循環(huán)，最后修復(fù)延伸72 ℃、10 min。

PCR擴(kuò)增采用25 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 19.8 μL，PCR緩沖液(10×, Mg+plus) 2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 1 μL，引物-F(10 μmol/L) 0.5 μL，引物-R(10μmol/L) 0.5 μL，DNA 0.5 μL，Taq 聚合酶 0.2 μL。

(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4) PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序：由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析[23-24]

采用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Tukey多重比較法檢驗(yàn)差異顯著性，5%為顯著水平。

系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建：將所測(cè)得的序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，下載與供試菌株序列同源性相近的菌株序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行序列的多重比對(duì)，利用MEGA7.0軟件N-J方法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 香椿內(nèi)生真菌的活性篩選

香椿經(jīng)分離、純化，共分離得到6株內(nèi)生真菌。將分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到其次級(jí)代謝產(chǎn)物，然后對(duì)其進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細(xì)菌活性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在10 g/L的樣品質(zhì)量濃度下，6株香椿內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物均具有一定程度的抑制α-葡萄糖苷酶活性。其中，菌株56-50抑制活性最高，為(24.98±1.89)%，高于對(duì)照品(19.64±1.00)%，但兩者無(wú)顯著差異(P>0.05)，與菌株TS47的α-葡萄糖苷酶抑制活性差異顯著(P<0.05)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出,在10 g/L的樣品質(zhì)量濃度下，菌株56-50和TS47均具有較好的抗氧化活性。其中，菌株56-50對(duì)ABTS+·的清除活性為(95.92±0.40)%，與對(duì)照品Vc無(wú)顯著差異(P>0.05)，與其他樣品差異顯著(P<0.05)。菌株56-50和TS47對(duì)DPPH·的清除活性分別為(91.77±0.45)%和(94.55±0.15)%，均與對(duì)照品Vc無(wú)顯著差異(P>0.05)，與其他樣品差異顯著(P<0.05)。

注：抗菌活性以菌圈直徑(mm)計(jì)；“-”表示未檢出活性。

抑菌圈的大小表示抑菌活性高低。其中抑菌圈越大，表示抑菌活性越高，反之，抑菌活性越低。由表4可看出，陰性對(duì)照乙醇沒(méi)有抑菌圈，說(shuō)明沒(méi)有抑菌活性，從而排除溶劑影響。在10 g/L的質(zhì)量濃度下，陽(yáng)性對(duì)照鏈霉素抑菌效果明顯。菌株TS8對(duì)軟腐病歐文氏菌具有較強(qiáng)的抑制活性，與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。菌株56-50對(duì)豪氏變形桿菌具有較強(qiáng)抑制活性，與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。

內(nèi)生真菌與植物的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，可能導(dǎo)致了內(nèi)生真菌與宿主植物有基因交流，致使內(nèi)生真菌與宿主植物有相同或相似的代謝途徑，因而可能會(huì)產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物[25]。這為在植物內(nèi)生真菌中尋找與其宿主相同或相似的活性化合物提供理論基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，香椿能產(chǎn)生降糖、抗氧化或抗菌的活性物質(zhì)，其內(nèi)生真菌也可能會(huì)產(chǎn)生此類或者相似的生物活性物質(zhì)。因此，香椿植物內(nèi)生真菌是一類亟待開發(fā)的微生物資源，在食品、生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)香椿植物內(nèi)生真菌進(jìn)行了活性測(cè)試，結(jié)果表明菌株56-50的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較好的α-糖苷酶抑制活性、抗氧化活性以及抗細(xì)菌活性，提示該菌株可能產(chǎn)生具有降糖、抗氧化和抗菌作用的活性物質(zhì)。因此，選擇菌株56-50對(duì)后續(xù)開發(fā)天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

2.2 菌株56-50的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

菌落形態(tài)特征：菌株56-50在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，可產(chǎn)生零星的放射狀白色菌絲，4 d后菌落直徑為6.0 cm，絨毛狀或棉絮狀，具明顯的同心輪紋，中央為墨綠色，外部淡黃色至灰綠色，菌落平坦，表面具少量稀疏的白色氣生菌絲(圖1-a)，8 d后菌落布滿培養(yǎng)皿。

孢子形態(tài)特征：分生孢子頂生，暗褐色，近卵形；分生孢子梗單生，深褐色，具明顯的橫隔(圖1-b、圖1-c)。

a-在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4 d后的菌落正面形態(tài)；b～c-菌絲、分生孢子及分生孢子梗(×100)圖1 內(nèi)生真菌56-60的菌落特征Fig.1 Morphological characteristics of the endophytic fungus 56-60

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

由于形態(tài)學(xué)特征無(wú)法準(zhǔn)確判定菌株56-50的種屬地位，因此采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定：以提取出的菌株56-50的DNA為模板，對(duì)其18S rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 300 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，大小與期望值相符。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，該菌株的18S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1 322bp。菌株56-50交由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏(保藏號(hào)：CGMCC No.12980)。

將PCR擴(kuò)增獲得的18S rDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明，菌株56-50的18S rDNA序列與鏈格孢屬Alternariasp.的18S序列同源性最高，相似性達(dá)100%。利用ClastalX與Mega 5.0軟件，基于18S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見(jiàn)圖2，從系統(tǒng)進(jìn)化樹上可以看出，每一個(gè)屬分別形成一個(gè)獨(dú)立的分枝，菌株56-50與Alternariasp.(KT192438.1)和Alternariasp.(GQ253348.1)處于同一分枝，親緣關(guān)系最近，判斷該菌株為鏈格孢屬Alternariasp.。

圖2 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on 18S rDNA gene sequences

3 討論與結(jié)論

1993年，STIERLE等[26]首次從短葉紅豆杉中分離得到1株能產(chǎn)生抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，表明內(nèi)生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性物質(zhì)的能力，從而使植物內(nèi)生真菌成為尋找和發(fā)現(xiàn)各種天然生物活性物質(zhì)的新資源。周生亮等[27]研究了4株薯蕷(Dioscoreazingiberensis)內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和菌絲的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)這4株菌株的菌絲和發(fā)酵液具有不同的抗氧化活性。劉軍生等[28]從七葉樹Aesculuschinensis根和莖中分離得到1株內(nèi)生真菌EA-LJS80，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌活性，這為挖掘?qū)θ梭w有益的活性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。

真菌傳統(tǒng)的主要分類依據(jù)是形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特征等，但由于真菌種類繁多，形態(tài)復(fù)雜，因此，在傳統(tǒng)真菌分類中常引起誤鑒或錯(cuò)鑒。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，在真菌現(xiàn)代分類學(xué)中引入了分子生物學(xué)技術(shù)的鑒定方法，通過(guò)提取真菌DNA基因組進(jìn)行測(cè)序分析，確定菌株的屬種地位，使真菌分類研究變得簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠。

本文首次以河南紅油香椿為研究材料，從其體內(nèi)分離純化出6株內(nèi)生真菌，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細(xì)菌活性為靶標(biāo)，篩選出1株具有最好生物活性的菌株56-50。然后采用分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特征相結(jié)合的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，根據(jù)18S rDNA基因測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，并通過(guò)MEGA 5.0序列分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果，結(jié)合培養(yǎng)特征，將菌株56-50鑒定為鏈格孢屬Alternariasp.。

香椿植物本身具有重要的降糖、抗氧化和抗細(xì)菌等生理活性，而在本實(shí)驗(yàn)中，從香椿中分離出來(lái)的Alternariasp.也表現(xiàn)出較好的α-糖苷酶抑制能力、抗氧化能力以及抗細(xì)菌能力，這顯示出內(nèi)生真菌與宿主在功能上的一致性，將為進(jìn)一步豐富該真菌的功能多樣性提供了證據(jù)，也為從香椿內(nèi)生真菌中尋找新的天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑提供了可能。今后，將進(jìn)一步對(duì)該菌進(jìn)行大量發(fā)酵，通過(guò)采用分離純化技術(shù)，進(jìn)一步研究其中的單體化合物結(jié)構(gòu)，為深入揭示內(nèi)生真菌和宿主香椿之間的關(guān)系以及挖掘天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑提供理論依據(jù)。