不同氮源對脫胚玉米擠出物發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響

葉向庫，申德超

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定，071001) 2(煙臺大學(xué)，山東 煙臺，264005) 3(山東理工大學(xué)，山東 淄博，255091)

檸檬酸是目前世界工業(yè)用量較大的有機(jī)酸之一。食品工業(yè)中所使用的檸檬酸主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)[1]，在過去的100多年中，發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸先后使用薯干粉[2]、木薯粉[3]、淀粉[4]、葡萄糖母液[5]、糖蜜[6]、馬鈴薯[7]、小麥粉[8]和玉米粉[9-11]等作為原料進(jìn)行生產(chǎn)，人們又嘗試了用菠蘿[12]、角豆莢[13]和甘蔗渣[14]等進(jìn)行生產(chǎn)。在使用來源豐富的淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)檸檬酸時，都需要將原料中的淀粉先經(jīng)糊化、液化、糖化過程水解成菌種可以利用的單糖或雙糖后才能被利用。傳統(tǒng)工廠中生產(chǎn)檸檬酸所用原料主要是全籽粒玉米，經(jīng)粉碎、噴射液化、糖化后用黑曲霉Co827進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。本文采用脫胚玉米加酶低溫擠出處理后再經(jīng)液化、糖化后作為原料，仍以黑曲霉Co827作為發(fā)酵菌種。實驗室前期對檸檬酸生產(chǎn)及處理過程中的能耗以及相關(guān)的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了詳細(xì)地分析，以為該法與現(xiàn)有方法相比，有利于玉米的綜合利用，降低糊化能耗，提高檸檬酸產(chǎn)率，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。但是由于以脫胚玉米為原料，處理后所得發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量較低，只有約0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，不能完全滿足黑曲霉發(fā)酵過程中對氮源的需要(目前以全玉米為原料，生產(chǎn)發(fā)酵液中控制蛋白質(zhì)含量為0.7%～0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，后期需補(bǔ)加氮源。因此本試驗考察脫胚玉米加酶低溫擠出所得發(fā)酵液添加不同氮源對檸檬酸發(fā)酵過程的影響，得到脫胚玉米加酶低溫擠出物適合檸檬酸發(fā)酵的氮源及添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

全籽粒玉米，市購(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.7%、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)71.2%、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.4%、粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.8%)。

脫胚玉米擠出物，脫胚玉米(水分含量13.5%、淀粉含量79.68%、蛋白質(zhì)含量7.56%、粗脂肪含量0.84%)在原料含水量30%、螺桿轉(zhuǎn)速110 r/min、擠壓時套筒溫度60 ℃、添加耐高溫α-淀粉酶(3×104U/mL)1.0 L/t的條件下經(jīng)山東理工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工教研室研制的單螺桿擠出機(jī)擠出得到。

菌種：黑曲霉Co827，山東萊蕪泰禾生化有限公司提供。

1.2 試驗方法

培養(yǎng)基的制備：取干燥發(fā)芽大麥用粉碎機(jī)粉碎成大麥芽粉，取適量大麥芽粉于500 mL錐形瓶中，加入3.5倍的蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻，然后放入恒溫水浴鍋中于65 ℃保溫糖化5～6 h，直至碘液不變藍(lán)為止。然后保溫真空過濾，得濾液用波美計調(diào)波美度到10 °Be，經(jīng)121 ℃滅菌20 min冷卻后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

(1)全玉米(對照樣)發(fā)酵液培養(yǎng)基：全玉米用粉碎機(jī)粉碎至40目篩，未通過量<15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))即可，置于容器中加2.5倍的水，加熱至90 ℃，同時每克原料加入10 U的耐高溫α-淀粉酶，恒溫液化至碘液不變藍(lán)為止。取液化液保溫真空抽濾，濾過液用10%(體積分?jǐn)?shù)) H2SO4調(diào)pH值為4.5，按每克原料加入160 U糖化酶在60 ℃進(jìn)行糖化，當(dāng)DE值>90%時糖化結(jié)束。該發(fā)酵液經(jīng)121 ℃滅菌20 min冷卻后備用。

(2)脫胚玉米擠出物發(fā)酵液培養(yǎng)基：取脫胚玉米擠出物經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，置于容器中加2.5倍70 ℃熱水混勻后迅速放于90 ℃水浴鍋中加熱，其余操作與全玉米發(fā)酵液培養(yǎng)基制作方法相同。

(3)菌種的活化和擴(kuò)培：從斜面挑取菌種2～3環(huán)接入麥芽汁培養(yǎng)基中，于35 ℃、230 r/min恒溫?fù)u床上通風(fēng)培養(yǎng)24 h，重新再活化1次，作為菌種發(fā)酵液。

檸檬酸的測定：試樣離心后，上清液經(jīng)0.3 μm濾膜抽濾，以(NH4)2HPO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.7)為流動相，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，用C18色譜柱進(jìn)行分離，紫外檢測器于210 nm處測定，用峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線對檸檬酸進(jìn)行定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,以檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積均值為縱坐標(biāo)，得檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=82.172X+197.01(R2=0.999 7)。檸檬酸色譜圖如圖1所示。

圖1 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰形圖Fig.1 Citric acid titer of chromatographic peak graph

蛋白質(zhì)的測定參照GB/T 5009.5。

還原糖的測定參照GB/T 5009.7。

總糖的測定參照酸水解法。

pH的測定參照pH計測定法。

檸檬酸發(fā)酵方法：發(fā)酵液置于錐形瓶中，接入10%(體積分?jǐn)?shù))菌種，35 ℃、230 r/min恒溫?fù)u床上通風(fēng)發(fā)酵72 h，取出測定檸檬酸產(chǎn)量。

1.3 試驗內(nèi)容

1.3.1 無機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵過程的影響

選擇NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4作為無機(jī)氮源[15-16]，分別取1、2、3 g/L的添加量進(jìn)行試驗。

1.3.2 有機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵過程的影響

有機(jī)氮源分為外源性氮和內(nèi)源性氮，外源性氮選擇尿素，內(nèi)源性氮選擇脫胚玉米經(jīng)液化、糖化后過濾的濾渣。

1.3.2.1 尿素與玉米渣的可行性試驗

尿素可以促進(jìn)真菌的生長，以生產(chǎn)發(fā)酵液總蛋白量為參考，向調(diào)整到總糖18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的擠出物玉米糖化液中加入質(zhì)量濃度6.4 g/L的尿素進(jìn)行發(fā)酵試驗。

同時取18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))擠出物玉米糖化液加入相當(dāng)于質(zhì)量濃度6 g/L蛋白質(zhì)的玉米渣作為有機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗。

1.3.2.2 添加玉米渣對檸檬酸發(fā)酵過程的影響

按照目前生產(chǎn)中發(fā)酵液控制的總蛋白質(zhì)含量0.7%～0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))計算，向擠出物制備的發(fā)酵液中添加相當(dāng)于質(zhì)量濃度1、2、3、4、5、6 g/L蛋白含量的玉米渣。

2 結(jié)果與分析

2.1 無機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵效果的影響

表1 不同無機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵的影響Table 1 Effects of inorganic nitrogen on fermentation

由表1可以看出，向發(fā)酵底物中添加一定量的NH4Cl、(NH4)2SO4對黑曲霉發(fā)酵檸檬酸有不同程度的促進(jìn)作用，其中，(NH4)2SO4促進(jìn)產(chǎn)酸效果尤為顯著，而NH4NO3促進(jìn)作用不明顯。對(NH4)2SO4和NH4NO3、NH4Cl數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析[18](表2、表3)，可以看出，t1(6)=1.616 6>t0.10(6)=1.439 8，t2(6)=1.132 8>t0.25(6)=0.717 6，相對于NH4NO3，(NH4)2SO4對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的影響差異非常顯著，相對于NH4Cl，(NH4)2SO4對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的影響差異較顯著。對比(NH4)2SO4的不同添加量可以看出，當(dāng)(NH4)2SO4的添加量為3 g/L時，檸檬酸的產(chǎn)率最高。當(dāng)(NH4)2SO4的添加量超過或者低于3 g/L時促進(jìn)產(chǎn)酸效果減弱。這與孫榮[19]的試驗結(jié)果一致。

表2 (NH4)2SO4與NH4NO3的t檢驗Table 2 t-test of (NH4)2SO4 and NH4NO3

表3 (NH4)2SO4與NH4Cl的t檢驗Table 3 t-test of (NH4)2SO4 and NH4Cl

2.2 有機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵效果的影響

2.2.1 尿素與玉米渣可行性試驗結(jié)果

添加有機(jī)氮源選擇外源性氮和內(nèi)源性氮。從工業(yè)應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性角度出發(fā)，外源性氮首選尿素[10]，內(nèi)源性氮選擇原料經(jīng)液化、糖化過濾后蛋白質(zhì)含量較高的玉米渣為原料，經(jīng)測定脫胚玉米擠出物經(jīng)液化、糖化后過濾所得玉米渣中蛋白質(zhì)含量為23.1%。可行性試驗結(jié)果如表4所示。

表4 添加尿素與玉米渣的可行性試驗Table 4 Feasibility test of citric acid production addingurea or corn cinder

由表4可以看出，添加尿素的發(fā)酵液樣品經(jīng)過72 h的發(fā)酵產(chǎn)生的檸檬酸只有1.61 g/100 g，鏡檢發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌絲球形狀很好，結(jié)構(gòu)緊密，也沒有出現(xiàn)衰老死亡、孢子松散的狀態(tài)，無雜菌污染，但活力很低，發(fā)酵產(chǎn)酸弱，不能用于檸檬酸生產(chǎn)中氮源的使用，具體原因尚待研究。添加玉米渣的發(fā)酵液樣品經(jīng)過72 h的搖床培養(yǎng)，產(chǎn)生6.45 g/100 g的檸檬酸，發(fā)酵狀態(tài)比較好，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲球體積明顯增大，外部邊緣不清晰，有松散孢子分散出來，發(fā)酵活力減弱，已到發(fā)酵終點[20]?？梢哉f明，玉米渣可以作為有機(jī)氮源的添加物進(jìn)行下一步試驗。

2.2.2 添加玉米渣對檸檬酸發(fā)酵效果的影響

玉米渣為原料中原有產(chǎn)物，傳統(tǒng)發(fā)酵法中為滿足黑曲霉的繁殖和代謝，在發(fā)酵初需控制發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量在0.7%～0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，脫胚玉米經(jīng)加酶低溫擠出后，進(jìn)行液化、糖化、過濾后得到的發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量約0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，而玉米渣中含有23.1%的蛋白質(zhì)。用玉米渣補(bǔ)充氮源，一方面減少廢棄物的排放量和處理費(fèi)用，另一方面又有利于發(fā)酵生產(chǎn)過程的調(diào)節(jié)作用。

表5 有機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵的影響Table 5 Effects of organic nitrogen on fermentation

由表5可以看出，玉米渣隨著添加量的增多，發(fā)酵產(chǎn)酸量反而減少，呈負(fù)相關(guān)性。雖然低溫加酶擠出脫胚玉米制得檸檬酸發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量并不高，只有約0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，遠(yuǎn)低于目前生產(chǎn)中使用的0.7%～0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蛋白質(zhì)含量水平，但添加質(zhì)量濃度1 g/L玉米渣后檸檬酸發(fā)酵良好，經(jīng)72 h發(fā)酵后產(chǎn)酸達(dá)到9.82 g/100 g。表明發(fā)酵液體系中有滿足黑曲霉菌體生長和代謝產(chǎn)酸所需要的氮源。表明脫胚玉米經(jīng)過加酶擠出后蛋白質(zhì)受到了較徹底的破壞，部分發(fā)生降解，溶入發(fā)酵液中的游離態(tài)氮源增多，更利于菌種的吸收利用，雖然總量不多，但可以滿足黑曲霉菌體生長和產(chǎn)酸的需要。

3 結(jié)論

(1)以脫胚玉米加酶低溫擠出物制備檸檬酸發(fā)酵液，向其中添加無機(jī)氮源((NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl)。結(jié)果顯示，(NH4)2SO4、NH4Cl對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸有促進(jìn)作用，其中(NH4)2SO4促進(jìn)產(chǎn)酸效果尤為明顯，當(dāng)(NH4)2SO4添加量為3 g/L時，檸檬酸的產(chǎn)率達(dá)到7.86 g/100 g。

(2)以脫胚玉米加酶低溫擠出物制備檸檬酸發(fā)酵液，向其中添加有機(jī)氮源(尿素、脫胚玉米淀粉水解后的玉米渣)發(fā)現(xiàn)，尿素能維持黑曲霉菌絲球良好狀態(tài)，但發(fā)酵產(chǎn)酸能力很弱。玉米渣對黑曲霉發(fā)酵有明顯影響，隨著添加量的增多，發(fā)酵產(chǎn)酸量反而減少，呈負(fù)相關(guān)性。添加質(zhì)量濃度1 g/L后檸檬酸發(fā)酵良好，經(jīng)72 h發(fā)酵后產(chǎn)酸達(dá)到9.82 g/100 g。

(3)脫胚玉米經(jīng)加酶低溫擠出后制備檸檬酸發(fā)酵液，添加無機(jī)氮源和有機(jī)氮源均對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)生影響。從發(fā)酵后檸檬酸產(chǎn)率來看，添加有機(jī)氮源玉米渣優(yōu)于添加無機(jī)氮源硫酸銨對檸檬酸發(fā)酵的促進(jìn)效果。