基于葉面葉綠素分布特征的黃瓜葉片氮鉀元素虧缺診斷

石吉勇 李文亭 郭志明 黃曉瑋 李志華 鄒小波

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮(zhèn)江 212013)

0 引言

N、K元素虧缺往往引起作物葉綠素合成障礙，導致作物生長發(fā)育遲緩，甚至異常，進而影響作物的產(chǎn)量[1-2]，且易導致產(chǎn)品內(nèi)部營養(yǎng)組分含量下降，進而影響作物的質(zhì)量[3-4]。凱氏定氮法、原子吸收法等元素分析方法可準確檢測N、K元素虧缺，然而診斷過程耗時、操作復雜，難以實現(xiàn)N、K元素虧缺的高效診斷[5-6]。

葉綠素含量作為作物營養(yǎng)元素虧缺的診斷依據(jù)，已被廣泛用于作物N、K元素虧缺的快速、無損診斷[7-9]。借助光譜信號與葉綠素含量之間的對應關系，可見光譜、近紅外光譜等方法已被用于快速檢測葉片的葉綠素含量，進而實現(xiàn)N、K元素虧缺的快速診斷[10-12]。然而，上述方法僅能感知葉片采樣點處的葉綠素含量，無法描述葉綠素含量的葉面分布情況，故難以精確表征葉片不同區(qū)域的缺素特性。

利用高光譜圖像數(shù)據(jù)既包含樣品的光譜信息又包含樣品的圖像信息[13-15]的特點，本課題組實現(xiàn)了黃瓜葉片、枇杷葉、銀杏葉等的品質(zhì)指標分布檢測[16-19]。在此基礎上，本文采用高光譜圖像技術檢測N、K元素虧缺的黃瓜葉片葉綠素含量(質(zhì)量比)分布，重點分析N、K元素虧缺導致的葉綠素分布差異，提取葉綠素分布特征作為N、K元素虧缺診斷依據(jù)，并建立N、K元素虧缺診斷方法。

1 材料與方法

1.1 缺素樣本培育及驗證

以水果黃瓜缺N植株、缺K植株以及對照植株的新鮮葉片為研究樣本。將水果黃瓜種子(碧玉3號，上海富農(nóng)種業(yè)有限公司)置于穴盤中育苗，待幼苗2片子葉完全長出后移栽至含有珍珠巖(使用前消毒，鎮(zhèn)江培蕾有機肥有限公司)的花盆或枕袋。按照山崎配方配置對照組營養(yǎng)液(包含植株所需的全部營養(yǎng)元素)，在溫室大棚內(nèi)用配置的營養(yǎng)液澆灌黃瓜植株。待黃瓜植株長出3片葉子時，將所有黃瓜植株分為缺N組、缺K組和對照組。缺N組植株使用的營養(yǎng)液為對照組營養(yǎng)液中完全去除N元素，缺K組植株使用的營養(yǎng)液為對照組營養(yǎng)液中完全去除K元素。為了保證試驗結(jié)果的可靠性，分3批次培育缺N組植株40株、缺K組植株40株以及對照組植株50株。利用凱氏定氮法分別檢測缺N組植株、對照組植株葉片的N元素含量[20]，利用原子吸收法分別檢測缺K組植株、對照組植株葉片的K元素含量[6]，從而進一步驗證缺N組植株、缺K組植株的缺素狀態(tài)。

1.2 高光譜圖像采集

采用可見光/近紅外高光譜成像系統(tǒng)獲取缺素樣本的高光譜圖像數(shù)據(jù)。高光譜成像系統(tǒng)硬件由線掃描高光譜儀(V10E型，Spectral Imaging Ltd.，芬蘭)、線光源(DC-950A型，Dolan-Jenner Ltd.，美國)、電控平移臺(TSA200-A型，北京卓立漢光有限公司，中國)、光箱和計算機組成[16]。高光譜成像系統(tǒng)軟件為SpectralCube(Spectral Imaging Ltd.，芬蘭)。高光譜圖像采集參數(shù)設定如下：曝光時間為45 ms，圖像分辨率為600像素×1 280像素，采樣間隔為0.67 nm，電控位移平臺速度為1.25 mm/s，電控位移平臺行程為100 mm。樣本采集過程中，整個系統(tǒng)均處于封閉狀態(tài)以避免外界光線的干擾。采集得到的黃瓜葉片高光譜圖像數(shù)據(jù)塊如圖1a所示，該數(shù)據(jù)塊不僅包含單波段下黃瓜葉片的二維圖像(圖1b)，而且包含單像素點下的光譜信息(圖1c、1d)。

圖1 黃瓜葉片高光譜圖像數(shù)據(jù)塊Fig.1 Cucumber leaf hyperspectral image data cube

1.3 葉綠素含量檢測

采用高效液相色譜法檢測黃瓜葉片樣本對應的葉綠素含量，采用的主要儀器有高效液相色譜儀(LC-20A型，島津，日本)、C18反相色譜柱(Agilent，Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)、紫外可見光檢測器(Prominence SPD-20A，島津，日本)、梯度系統(tǒng)(LC-20AT型)，涉及的主要試劑有葉綠素a標準品(#C5753，Sigma公司，美國)、葉綠素b標準品(# C5758，Sigma公司，美國)、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、三乙胺、二丁基羥基甲苯。首先利用外標法建立葉綠素含量標準曲線，然后定量稱取黃瓜葉片30～40 mg于丁酮水溶液中提取葉綠素后，將提取液送入高效液相色譜儀于440 nm波長下獲取檢測信號，并利用葉綠素含量標準曲線計算黃瓜葉片樣本對應的葉綠素含量[19]。

1.4 基于葉面葉綠素分布特征的N/K缺素診斷

圖2 葉面葉綠素分布特征無損表征及N、K元素虧缺診斷流程圖Fig.2 Flow chart for nondestructive diagnostics of nitrogen and potassium deficiencies based on chlorophyll distribution features

葉面葉綠素分布特征無損表征及N、K元素虧缺診斷對應的流程如圖2所示。首先，從校正集/預測集對應的高光譜數(shù)據(jù)塊中提取感興趣區(qū)域?qū)墓庾V信息，構(gòu)建校正集/預測集光譜數(shù)據(jù)集，結(jié)合校正集/預測集樣本對應的葉綠素含量參考值，建立區(qū)間偏最小二乘(Interval partial least squares,IPLS)、聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘(Synergy interval partial least squares,SIPLS)、遺傳偏最小二乘(Genetic algorithm-partial least squares,GA-IPLS)葉綠素含量校正模型[21]。其次，提取測試集樣本高光譜數(shù)據(jù)塊對應的光譜信息，構(gòu)建測試集對應的光譜數(shù)據(jù)集，將其代入已建立的葉綠素含量校正模型計算葉綠素含量預測值，通過比較葉綠素含量預測值對葉綠素含量參考值的接近程度來驗證葉綠素含量校正模型[22]。然后，利用待測黃瓜葉片高光譜數(shù)據(jù)塊中各個像素點對應的光譜信息，結(jié)合驗證后的葉綠素含量校正模型，得到各個像素點對應的葉綠素含量值，根據(jù)像素點坐標將其進行二維顯示得到葉綠素含量分布圖。最后，采集缺素葉片及對照組葉片的高光譜圖像，檢測缺素葉片及對照組葉片的葉綠素含量分布圖，從中提取葉綠素的分布特征并建立N、K元素虧缺診斷模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺素樣本驗證結(jié)果

在3個批次樣本培養(yǎng)試驗后期，分別從每個批次取3株缺N植株、3株缺K植株、3株對照組植株共27株黃瓜植株進行N、K元素分析。缺N植株、缺K植株、對照組植株最低3節(jié)點(第1～3節(jié)點)、中間節(jié)點(第4～6節(jié)點)、最高3節(jié)點(第7～9節(jié)點)的N、K元素含量(質(zhì)量比)分析結(jié)果如圖3所示。N元素含量檢測結(jié)果顯示植株最低3節(jié)點處N元素含量差異明顯(圖3a)，其中缺N組、缺K組和對照組對應的N素含量分別為6.91、12.53、13.55 mg/g，表明缺N組植株的最低3節(jié)點處葉片進入了N元素虧缺狀態(tài)。K元素含量檢測結(jié)果顯示植株最低3節(jié)點處K元素含量差異明顯(圖3b)，其中缺N組、缺K組和對照組老葉對應的K元素含量分別為0.53、0.81、0.85 mg/g，表明缺K組植株的最低3個節(jié)點處葉片進入了K元素虧缺狀態(tài)。

圖3 缺N、缺K以及對照組植株不同節(jié)點處葉片對應的N、K元素含量檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of N deficiency, K deficiency and control group corresponding N and K nutrient contents at different nodes

2.2 黃瓜葉片葉綠素分布檢測

2.2.1葉綠素含量校正模型構(gòu)建及驗證

如圖2所示，分別采集60片黃瓜葉片(缺N、缺K及對照組各20片)組成校正集和預測集，經(jīng)高光譜圖像采集和高效液相色譜法分析葉綠素含量后，分別利用IPLS、SIPLS、GA-IPLS結(jié)合提取的校正集/預測集光譜信息、葉綠素參考值建立IPLS、SIPLS、GA-IPLS葉綠素含量校正模型。其次，利用獨立于校正集樣本的30片黃瓜葉片構(gòu)成測試集，將測試集光譜數(shù)據(jù)代入已建立的IPLS、SIPLS、GA-IPLS葉綠素含量校正模型得到葉綠素含量預測值，并將葉綠素含量預測值與葉綠素含量參考值進行比較。IPLS、SIPLS、GA-IPLS葉綠素含量校正模型及其對應的驗證結(jié)果如表1所示，GA-IPLS模型效果最優(yōu)，對應的校正集相關系數(shù)為0.938 5、校正集均方根誤差為1.85 mg/g，對應的預測集相關系數(shù)為0.910 3、預測集均方根誤差為1.90 mg/g，對應的驗證集相關系數(shù)為0.903 9、驗證集均方根誤差為1.98 mg/g。

表1 基于葉片高光譜圖像信息構(gòu)建的葉綠素含量校正模型驗證結(jié)果Tab.1 Chlorophyll content correction model based on hyperspectral image information of leaves

圖4 不同組葉片對應的葉綠素含量分布圖Fig.4 Distribution maps of chlorophyll in different leaf groups

2.2.2葉綠素含量分布檢測

黃瓜葉片葉綠素含量分布圖檢測方法如圖2所示。通過逐點提取黃瓜葉片高光譜圖像數(shù)據(jù)塊中各像素點對應的光譜信息，將其代入驗證后的GA-IPLS葉綠素校正模型，借助葉綠素含量校正模型內(nèi)部定義的葉片高光譜信號與葉綠素含量的對應關系，計算出各個像素點對應的葉綠素含量值，并將各個像素點對應的葉綠素含量值根據(jù)其坐標位置進行二維顯示，從而實現(xiàn)黃瓜葉片葉綠素分布圖的檢測。據(jù)此分別采集缺N組、缺K組及對照組黃瓜葉片進行葉面葉綠素分布檢測，結(jié)果如圖4所示。

與對照組葉片的葉綠素含量分布(圖4c)相比，缺N組葉片葉綠素分布(圖4a)的特征為葉片中心區(qū)域大部分像素點對應的葉綠素含量低于對照組葉片；而缺K組葉片葉綠素分布的特征為葉綠素含量在葉片邊緣的局部區(qū)域明顯下降(圖4b所示邊緣藍色區(qū)域)。圖4表明，葉綠素含量在葉片中心區(qū)域及邊緣區(qū)域的分布特征可作為診斷N、K元素虧缺的依據(jù)。

2.3 葉綠素分布特征提取及N、K缺素診斷

從培育的40株缺N植株、40株缺K植株以及50株對照組植株中分別選取缺N植株、缺K植株以及對照組植株各20株，從植株的前3個節(jié)點處采集缺N植株老葉50片、缺K植株老葉50片以及對照組植株老葉50片，按照3∶2的比例分為校正集和測試集，分別提取葉綠素在葉片中心區(qū)域和葉片邊緣區(qū)域分布特征。葉片中心區(qū)域和葉片邊緣區(qū)域的劃分如圖5所示，其中葉片中心區(qū)域被定義為葉面中心的矩形區(qū)域，葉片邊緣區(qū)域被定義為隨葉片輪廓變化的不規(guī)則環(huán)狀區(qū)域。

圖5 黃瓜葉片中心區(qū)域與邊緣區(qū)域劃分示意圖Fig.5 Diagram of dividing central region and marginal region of cucumber leaves

首先，檢測缺N組葉片和對照組葉片的葉綠素含量分布，并提取上述葉面葉綠素分布圖中心區(qū)域所有像素點對應的葉綠素含量均值，如圖6a所示。大部分對照組樣本中心區(qū)域?qū)娜~綠素含量均值高于12.00 mg/g，而大部分缺N組樣本中心區(qū)域?qū)娜~綠素含量均值低于11.00 mg/g。當設定N元素虧缺診斷閾值為11.50 mg/g，僅1個第3節(jié)點的缺N葉片誤診斷為對照組葉片(圖6a箭頭所指樣本)，該閾值對應的校正集正確診斷率為98.33%。利用該閾值對預測集的N元素虧缺樣本進行診斷，對應的正確診斷率為95.00%。

為了對K虧缺葉片及對照組葉片進行區(qū)分，統(tǒng)計缺K及對照組葉片葉綠素分布圖中邊緣區(qū)域葉綠素含量低于11.00 mg/g的特征像素點數(shù)量，結(jié)果如圖6b所示。大多數(shù)缺K葉片邊緣區(qū)域的特征像素點數(shù)量高于40個，而大多數(shù)對照組葉片邊緣區(qū)域的特征像素點數(shù)量低于30個。當設定K元素虧缺診斷閾值為35個特征像素時，僅有1個第1節(jié)點的對照組樣本和第3節(jié)點的缺K組樣本診斷錯誤(圖6b箭頭所指樣本)，對應的校正集正確診斷率為96.67%。利用該閾值對預測集的K元素虧缺樣本進行診斷，對應的正確診斷率為95.00%。

圖6 基于葉片葉綠素分布特征的N、K元素虧缺診斷結(jié)果Fig.6 Diagnosing result of nitrogen and potassium deficiencies based on chlorophyll distribution features of cucumber leaf

3 結(jié)論

(1)利用GA-IPLS建立了基于黃瓜葉片高光譜信號的葉綠素含量校正模型(Rt=0.903 9)，結(jié)合黃瓜高光譜圖像包含的單個像素點對應的光譜信號實現(xiàn)了葉綠素含量的快速、無損檢測。

(2)通過比較對照組、缺N組、缺K組葉片的葉綠素含量分布圖，從中提取了中心區(qū)域所有像素點的均值、邊緣區(qū)域葉綠素含量低于均值的像素點數(shù)量，并將其作為診斷作物N、K元素虧缺的特征，同時建立了基于葉綠素分布特征的N、K元素虧缺診斷方法，對N、K元素虧缺的正確診斷率均為95.00%。

(3)研究結(jié)果表明，葉面葉綠素分布特征可有效實現(xiàn)黃瓜葉片N、K元素的虧缺診斷。