烏梅丸對胃腸感染模型小鼠血漿Th1、Th2淋巴細(xì)胞因子和胃腸傳輸功能的影響

陳志彪 葛俊辰

摘要目的：觀察烏梅丸對胃腸感染模型小鼠的療效，同時探討其對小鼠血漿輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞2（Th2）淋巴細(xì)胞因子和胃腸傳輸功能的影響。方法：選取昆明小鼠30只并隨機(jī)分為空白組、模型組及實(shí)驗組，各10只。其中模型組及實(shí)驗組小鼠接受致病性大腸桿菌（EPEC）灌胃制作感染性腹瀉模型，空白組用同等劑量生理鹽水灌胃。模型制備成功后實(shí)驗組每日用烏梅丸水溶性生物堿灌胃，劑量按照按人/鼠公斤體重的等效劑量換算，空白組及模型組用同等劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)10 d。比較3組胃排空率、小腸推進(jìn)率、外周血Th1、Th2淋巴細(xì)胞因子表達(dá)的變化。結(jié)果：模型組及實(shí)驗組小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比較空白組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中實(shí)驗組較模型組降低（P<0.05）。3組淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型組及實(shí)驗組小鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯增強(qiáng)，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中實(shí)驗組小鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯較模型組快慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組及實(shí)驗組小鼠外周血Th2比例、白細(xì)胞介素（IL4）、IL6、IL10明顯增高，但實(shí)驗組水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），模型組及實(shí)驗組Th1比例、IL2、腫瘤壞死因子ɑ（TNFɑ）、干擾素γ（IFNγ）表達(dá)較空白組明顯升高，但模型組及實(shí)驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：烏梅丸可有效改善胃腸感染模型小鼠的胃腸傳輸功能，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫為主。

關(guān)鍵詞胃腸感染模型;胃腸傳輸功能;烏梅丸;輔助性T細(xì)胞1;輔助性T細(xì)胞2

中圖分類號：R289.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.018

感染性疾病在胃腸道疾病占首要位置，其中大腸桿菌發(fā)病率較高。輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞2（Th2）是淋巴細(xì)胞CD4+T的主要亞群，有研究顯示發(fā)生胃腸感染時機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能受到明顯破壞[12]，其中Th1及Th2的水平變化貫穿疾病的發(fā)生發(fā)展過程。烏梅丸是《傷寒論》中治療蛔厥的經(jīng)典方，其君藥烏梅性平味酸澀，入肺腸兩經(jīng)，有顯著的收斂效應(yīng)，并可澀腸道生津，臨床不乏其有效治療胃腸道疾病的記載[36]，但其作用機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論。基于此，我們利用胃腸感染模型小鼠，探析烏梅丸的部分藥用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取昆明小鼠30只，雌雄各半，購買自濟(jì)南金豐實(shí)驗動物有限公司（許可證號：SCXX（滬）201100241），本研究方案經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，所有動物飼養(yǎng)于本院動物實(shí)驗中心，飼養(yǎng)條件：溫度（23.5±0.5）℃濕度（52±1.5）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2藥物烏梅丸粉由本院中藥研究院提供，組成：烏梅300枚，細(xì)辛84 g、干姜140 g、黃連224 g、當(dāng)歸56 g、附子84 g（去皮，炮）、??????? 蜀椒56 g（出汗）、桂枝84 g（去皮）、人參84 g、黃柏84 g，以上10味，各搗篩，混合和勻;以苦酒漬烏梅12 h，去核，蒸熟搗成泥，與蜜組成丸。

1.1.3試劑與儀器致病性大腸桿菌（EPECE2348/69）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，烏梅丸粉由本院中藥研究院提供，小鼠T淋巴細(xì)胞因子CBA試劑盒購自北京西美杰科技有限公司，CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司，血細(xì)胞分析儀購自北京寶靈曼陽光科技有限公司。白細(xì)胞介素2（IL2）、IL6、IL10、IL4、腫瘤壞死因子ɑ（TNFɑ）、干擾素γ（IFNγ）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備

選取昆明小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組及實(shí)驗組，各10只。3組小鼠在體重、鼠齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。參考文獻(xiàn)[7]中EPEC致胃腸感染模型制備方法，使用0.3 mL的3%碳酸氫鈉溶液對模型組及實(shí)驗組小鼠進(jìn)行灌胃，30 min后將事先配制好的濃度為5×108cfu/mL的致病性EPEC混懸液再次灌胃，每只小鼠灌胃0.5 mL致病性EPEC混懸液，隨后回籠飼養(yǎng)，觀察小鼠的大便變化情況。空白組小鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃后回籠飼養(yǎng)。灌胃6 h后小鼠出現(xiàn)精神疲乏、活動減少、大便性狀改變提示造模成功。

1.2.2干預(yù)方法

實(shí)驗組小鼠造模成功后每日灌胃烏梅丸水溶液，劑量按人/鼠公斤體重的等效劑量計算，1次/d，連續(xù)干預(yù)10 d。模型組及空白與等體積蒸餾水灌胃。

1.2.3檢測指標(biāo)

1）胃排空率、小腸推進(jìn)率：將3組小鼠禁食12 h，按照0.1 mL/10 mg的比例計算活性炭劑量，將計算好的活性炭進(jìn)行灌胃，隨后處死小鼠取胃稱重。將胃置于冰上后從胃大彎處剪開胃體，用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物后再次稱重，計算胃排空率。再剪取腸管測量小腸總長度，從幽門至活性炭前沿的距離視為腸管內(nèi)推進(jìn)距離，計算小腸推進(jìn)率。

2）Th1及Th2淋巴細(xì)胞因子的表達(dá)：干預(yù)結(jié)束取3組小鼠眼眶靜脈血，分離出單核細(xì)胞，將分離出的單核細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 h，培養(yǎng)過程中加入佛波醇乙酯（PMA）及離子霉素、莫能霉素混合而成的工作液體進(jìn)行刺激，隨后將細(xì)胞收集后加人5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD4（CD4FITC），操作按試劑盒說明書進(jìn)行，采用流式細(xì)胞儀檢測Th1及Th2細(xì)胞。

3）IL4、IL2、IL6、IL10、TNFɑ、IFNγ檢測：在4 ℃條件下進(jìn)行3 000×g離心5 min后用高壓槍頭吸取離心后的上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進(jìn)行檢測，利用抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合原理進(jìn)行相關(guān)因子濃度的檢測，具體步驟如下：用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL緩沖液，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，3 min/次。將一定稀釋的待檢樣品0.1 mL加入反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。隨后在各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。再于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，顯色后采用492 nm波長，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均值的比值（P/N）表示。以空白對照孔調(diào)零后測各孔A值，若大于規(guī)定的陰性對照A值的2.1倍，即為陽性。操作過程全部按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行研究數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用秩和檢驗;組內(nèi)比較采用配對秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.13組血細(xì)胞比較

模型組及實(shí)驗組小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比較空白組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中實(shí)驗組較模型組降低（P<0.05）。3組淋巴細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.23組胃排空率及小腸推進(jìn)率比較

模型組及實(shí)驗組小鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯增強(qiáng)，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中實(shí)驗組小鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯較模型組慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.23組Th1及Th2比例比較

模型組及實(shí)驗組小鼠外周血Th2比例、IL6、IL10、IL4與空白組比較明顯增高，但實(shí)驗組水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），模型組及實(shí)驗組Th1比例、IL2、TNFɑ、IFNγ表達(dá)較空白組明顯升高，但模型組及實(shí)驗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3～4。

3討論

目前關(guān)于胃腸感染動物模型制備方法的報道不多，主要以大腸桿菌誘導(dǎo)為主，主要以腹腔注射誘導(dǎo)動物腹瀉，但此類模型與人類感染大腸桿菌實(shí)際情況不符，故本研究采用經(jīng)口灌胃途徑建立胃腸道感染動物模型，與人類經(jīng)口感染方式更為貼近。在本研究中我們對20只昆明小鼠進(jìn)行模型制備，結(jié)果顯示在造模6 h后小鼠均出現(xiàn)精神疲乏、活動減少、大便性狀等表現(xiàn)，這提示本研究的造模是成功。我們認(rèn)為小鼠在感染大腸桿菌后腸道黏膜組織受破壞，腸道黏膜組織上皮細(xì)胞完整性受損，隨著細(xì)菌的侵入局部組織滲出增多，從而導(dǎo)致小鼠大便性狀改變（主要以出現(xiàn)黏液稀便為主）、精神萎靡等炎性反應(yīng)表現(xiàn)。

我們參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行造模，首先灌胃碳酸氫鈉溶液，旨在盡可能減少小鼠腸道活動能力，保持腸內(nèi)容物、營養(yǎng)物質(zhì)的存留，抑制胃酸分泌，降低胃腸道的屏障功能，促進(jìn)大腸桿菌定殖，并進(jìn)一步粘附于胃腸道內(nèi)，導(dǎo)致胃腸道組織的損傷，誘發(fā)其免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而出現(xiàn)腹瀉的癥狀。白細(xì)胞是機(jī)體抵御外界細(xì)菌感染的重要防線，本研究發(fā)現(xiàn)，接受大腸桿菌定植的模型組及實(shí)驗組小鼠血漿中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比均較空白組升高，這進(jìn)一步證實(shí)了小鼠成功受到細(xì)菌的感染，而在研究中我們發(fā)現(xiàn)3組小鼠淋巴細(xì)胞百分比數(shù)值相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這亦佐證小鼠并未受到病毒感染。

小鼠受到大腸桿菌侵襲后腸道黏膜及全身免疫系統(tǒng)快速啟動應(yīng)答，募集大量的細(xì)胞因子參與反應(yīng)，其中包括Th1淋巴細(xì)胞及其代表細(xì)胞因子IL2、TNF、IFNγ，以及Th2淋巴細(xì)胞及其代表細(xì)胞因子IL6、IL10、IL4。Th1淋巴細(xì)胞及Th2淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中占據(jù)重要位置，有研究指出，機(jī)體發(fā)生胃腸感染后（細(xì)菌感染及病毒感染）炎性反應(yīng)遞質(zhì)產(chǎn)生明顯變化，其中IL6尤為突出[810]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組及實(shí)驗組小鼠血漿IL6的確較空白組升高，IL6有多種功能，其水平升高可抑制B淋巴細(xì)胞增殖及分泌相應(yīng)抗體，從而減弱抗體抗原結(jié)合反應(yīng)，阻礙病原體的清除。IL4亦可激活B淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)IgE及IgG進(jìn)一步分泌，同時還可促進(jìn)IgG向IgE轉(zhuǎn)換，從而破壞腸道微生物的生態(tài)平衡，進(jìn)而影響腸道免疫耐受功能，加重腹瀉癥狀[1112]。有數(shù)據(jù)證實(shí)IL2可通過促進(jìn)了各亞型T細(xì)胞活化而廣泛參與機(jī)體各種炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程。有研究通過動物模型研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌腸毒素感染后動物體內(nèi)IL10水平上調(diào)，這與本研究結(jié)果基本一致，IL10單抗可明顯提升葡萄球菌腸毒素注射小鼠的死亡率，IL10是腸道黏膜重要的免疫應(yīng)答因子，其水平的不斷提升可導(dǎo)致炎性反應(yīng)的不斷擴(kuò)大及延展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌制備的胃腸感染模型小鼠體內(nèi)Th1及Th2細(xì)胞及其代表性因子均產(chǎn)生了變化，這提示通過大腸桿菌制備的胃腸感染模型小鼠體內(nèi)并非單純促炎/抗炎表現(xiàn)，亦并非單純的Th1類細(xì)胞或Th2類細(xì)胞活化，而是產(chǎn)生了混合型的免疫應(yīng)答效應(yīng)，且以Th2為代表的體液免疫表現(xiàn)為主，這與國內(nèi)研究結(jié)果相似[7]。

中醫(yī)并無胃腸感染病名記載，其屬于“腹瀉、泄瀉”等范疇，外邪導(dǎo)致臟腑陰陽失調(diào)，痰瘀互結(jié)侵襲腸腑而成此病，以腹痛、大便稀溏、疲乏等為主要臨床表現(xiàn)，“脾虛邪戀、濕熱下注、腸道失固”是其主要病機(jī)，因此攻補(bǔ)兼顧、寒溫并行是治療本病的關(guān)鍵。烏梅丸是《傷寒論》中治療蛔厥的經(jīng)典方，由烏梅、干姜、細(xì)辛、當(dāng)歸、桂枝、人參、黃柏、黃連、附子、花椒等10味中藥組合而成[1314]。其中君藥烏梅性平味酸澀，入肺腸兩經(jīng)，有顯著的收斂效應(yīng)，并可澀腸道生津;花椒、細(xì)辛、桂枝、附子、干姜散寒溫中，黃連、黃柏清熱除煩、滋腎止渴，人參、當(dāng)歸益氣補(bǔ)血活血，調(diào)節(jié)脾胃之氣而生血和血。現(xiàn)代藥理研究顯示，烏梅丸有抗菌、消炎、抗變態(tài)反應(yīng)的作用[1520]，同時還有修復(fù)腸道黏膜以抑制有毒物質(zhì)破壞腸道組織的作用。整方寒熱并用、補(bǔ)瀉兼施、邪正兼顧。本研究結(jié)果顯示，加用烏梅丸的實(shí)驗組小鼠在改善血細(xì)胞分布、免疫應(yīng)答、抑制炎性反應(yīng)方面均有顯著提升，這提示烏梅丸確可效改善胃腸感染模型小鼠的胃腸傳輸功能，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫為主。

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（2018-08-31收稿責(zé)任編輯：芮莉莉）