扶正抗癌方對Lewis肺癌荷瘤小鼠肺癌基因Bcl2、抑癌基因Bax及血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子受體、金屬蛋白酶表達(dá)的影響

周婷婷 茆俊卿 張傳名 陳永昶 張蕾 陳靜

摘要目的：觀察扶正抗癌方對小鼠Lewis肺癌抗轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響。方法：選取C57BL/6小鼠50只，雌雄各半，每只小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞0.2 mL造模，24 h后，完全隨機(jī)分為對照組、順鉑組、扶正抗癌方低、中、高劑量組，每組10只。分別給藥21 d后取出完整腫瘤組織稱重計算抑瘤率，同時用實時熒光定量PCR檢測Lewis肺癌組織Bcl2和Bax mRNA的表達(dá)，免疫組化檢測Lewis肺癌組織基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）蛋白的表達(dá)，用蛋白質(zhì)印跡法（WB法）檢測Lewis肺癌組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子受體（EGFR）的表達(dá)。結(jié)果：與模型組小鼠比較，扶正抗癌方藥可以呈劑量依賴性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長，顯著升高Lewis肺癌組織中Bax mRNA表達(dá)，降低Bcl2 mRNA、MMP9蛋白表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中高劑量組在升高Lewis肺癌組織中Bax mRNA表達(dá)、降低Bcl2 mRNA表達(dá)方面與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。同時模型組Lewis肺癌組織中VEGF、EGFR表達(dá)顯著升高，扶正抗癌方藥可顯著降低Lewis肺癌組織中VEGF、EGFR表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與順鉑組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：雖然扶正抗癌方總體上較順鉑作用偏弱，但依然能有效抑制肺癌細(xì)胞增殖，抑制肺癌細(xì)胞Bcl2基因的表達(dá)，激活Bax的高表達(dá)，下調(diào)肺癌細(xì)胞中VEGF、EGFR、MMP的表達(dá)。

關(guān)鍵詞扶正抗癌方;肺癌;抗轉(zhuǎn)移機(jī)制;Bcl2;Bax;基質(zhì)金屬蛋白酶;表皮生長因子受體;血管內(nèi)皮生長因子

中圖分類號：R289.5;R734文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.016

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）屬于肺癌的一種，世界衛(wèi)生組織根據(jù)肺癌的生物學(xué)、治療及預(yù)后將其分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC占所有肺癌的80%以上[1]。近年來肺癌的發(fā)病率不斷增高，已成為全球癌癥死亡的主要原因之一，每年有超過100萬的人口死于該病[2]，而大部分患者在確診時已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，總體預(yù)后差。針對晚期NSCLC，中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識（2016年版）[3]指出其治療原則應(yīng)以全身治療為主，局部治療為輔，首先獲取腫瘤組織，明確病理分型和分子遺傳學(xué)特征，根據(jù)檢測結(jié)果確定治療方案，以期改善癥狀、提高患者生命質(zhì)量。目前推薦采用化療聯(lián)合靶向藥物維持治療，但化療藥物具有毒性累積的不良反應(yīng)，而耐受性較好的分子靶向藥物卻有費(fèi)用昂貴的缺點，且僅針對特定基因表型或臨床特征的患者[4]，因而仍處于探索階段。而通過多年的研究摸索，中醫(yī)藥具有明確的腫瘤病灶穩(wěn)定率高，癥狀改善率高，不良反應(yīng)輕微，帶瘤生存期延長，能提高患者生命質(zhì)量的特點[5]。故本研究使用C57BL/6小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞造模，觀察扶正抗癌方對小鼠Lewis肺癌的抗轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取C57BL/6小鼠，50只，SPF級，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，實驗動物使用許可證號：SCXK（蘇）20170001。給藥前后，小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，喂以全價顆粒鼠飼料（南京協(xié)同生物工程有限公司），自由飲水飲食，室溫20～25 ℃，每天人工光照射12 h，室內(nèi)通風(fēng)良好，實驗室相對濕度：65%～70%。

1.1.2藥物扶正抗癌方（黨參10 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、山藥10 g、陳皮6 g、木香10 g、砂仁6 g、生地黃10 g、黃精15 g、丹參10 g、野葡萄根10 g、靈芝10 g、藤梨根10 g、白花蛇舌草30 g、甘草6 g。）由揚(yáng)州市中醫(yī)院提供。順鉑（齊魯制藥有限公司，批號：6A002A88）。

1.1.3試劑與儀器試劑：DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司，批號：M2202];Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，批號：00306196）;PCR預(yù)混合MIX[天根生化科技（北京）有限公司，批號：N2728];SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（大連寶生物科技有限公司，批號：A650t1）;VEGF Rabbit Antibody（proteintech，批號：190031AP）。EGFR Rabbit Antibody（proteintech，批號：189861AP）。山羊抗兔二抗（proteintech，批號：SA000012）。儀器：分析天平[塞多利斯科儀器（北京）有限公司，型號：BSA124S];烘箱[巴姆（上海）測控技術(shù)有限公司，型號：1012AS];蒸餾水制水器（上海亞榮生化儀器廠，型號：SZ97A）;超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司，型號：MasterD UVF）;石蠟切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠，型號：YD1508A）;光學(xué)顯微鏡（蔡司公司，型號：Axioplan 2 imaging）;水浴鍋（鄭州博科儀器設(shè)備有限公司，型號：HW5L）;立式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司，型號：HX11L120）;PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，型號：A300）;RTPCR儀（杭州安杰思生物科技有限公司，型號：AFD9600）;微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司，型號：Nano100）;橫向電泳槽（上海天能科技有限公司，型號：HE120）;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：1600）;高速低溫離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，型號：MicroCL 17R）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備1）分組：C57BL/6小鼠接種24 h后，隨機(jī)分為5組，對照組，扶正抗癌方低、中、高劑量組，DDP組。每組10只。2）Lewis肺癌動物模型的建立：液氮冷凍的小鼠Lewis肺癌瘤株于37 ℃水浴中復(fù)蘇后，先接種于3只C57BL/6小鼠腹腔，10 d后，按無菌操作程序，取荷瘤小鼠腹水，經(jīng)生理鹽水洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個∕mL的瘤細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色觀察記錄活細(xì)胞數(shù)（>95%），取C57BL/6小鼠雌雄各半，6～8周齡，體重18～22 g共50只，在每只小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞0.2 mL。

1.2.2給藥方法對照組：生理鹽水0.4 mL灌胃，2次/d×21 d;扶正抗癌方低、中、高劑量組，給藥劑量：低劑量組15 g/kg、中劑量組30 g/kg、高劑量組60 g/kg（分別相當(dāng)于60 kg成人臨床用量的5倍、10倍、20倍），分別灌胃含生藥0.5、1.0、2.0 g/mL的藥液0.3 mL，2次/d×21 d;順鉑組：順鉑按2 mg/kg劑量給藥，用生理鹽水配成10%濃度，0.4 mL腹腔注射，隔日1次×14 d;接種后第21天，頸椎脫位法處死小鼠，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3檢測指標(biāo)與方法1）抑瘤率：頸椎脫位法處死小鼠，取出完整腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=（對照組平均瘤重-觀察組平均瘤重）∕對照組平均瘤重×100%。2）實時熒光定量PCR檢測Lewis肺癌組織Bcl2和Bax mRNA的表達(dá)。Trizol法提取Lewis肺癌組織RNA，參考Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗，引物序列PPLBax F：CGAGTGTCTCCGGCGAATTG，PPLBax R：ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG，PPLbcl2 F：GGTACCGGAGAGCGTTCAGT，PPLbcl2 R：CTGCTGCATTGTTCCCGTAG;參考SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行RTPCR實驗，相對定量結(jié)果儀器自帶軟件自動計算。3）免疫組化檢測Lewis肺癌組織基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）蛋白的表達(dá)：Lewis肺癌浸蠟與包埋、切片、抗原修復(fù)、蘇木精染色、脫水、透明和封片，普通光學(xué)顯微鏡下，觀察染色后的載玻片，拍照后，使用Image pro plus統(tǒng)計各個圖片中蛋白陽性表達(dá)的平均吸光度A值。4）蛋白質(zhì)印跡法檢測Lewis肺癌組織VEGF、EGFR的表達(dá)。冰上裂解Lewis肺癌組織，手持式勻漿器勻漿，勻漿后BCA法測定各樣本的蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計算各樣本電泳時的上樣量。使用10%預(yù)制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠，上樣本后以恒壓110 V進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后，以恒壓120 V進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉，之后孵育第一抗體，4 ℃過夜，清洗后孵育第二抗體2 h，凝膠成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像，保存數(shù)據(jù)為圖片，應(yīng)用Quantity One對各條帶進(jìn)行分析，計算出相對值后導(dǎo)出Excel表格做進(jìn)一步統(tǒng)計。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗;計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.15組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長比較與模型組小鼠比較，扶正抗癌方藥可以呈劑量依賴性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長，高、中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），低劑量組與高劑量組、順鉑組比較瘤重增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)抑瘤率可以看出，扶正抗癌方高劑量組抑瘤率最接近順鉑組，可以有效發(fā)揮抗腫瘤的替代作用。見表1。

2.2扶正抗癌方藥對小鼠Lewis肺癌組織Bcl2和Bax mRNA表達(dá)的影響模型組Lewis肺癌組織中Bax mRNA表達(dá)顯著降低，Bcl2mRNA表達(dá)顯著升高;扶正抗癌方藥可以顯著升高Lewis肺癌組織中Bax mRNA表達(dá)，降低Bcl2mRNA表達(dá)，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中中、低劑量組與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高劑量組與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.35組小鼠Lewis肺癌組織MMP9表達(dá)比較

模型組Lewis肺癌組織中MMP9蛋白表達(dá)顯著升高，扶正抗癌方藥可以顯著降低Lewis肺癌組織中MMP9蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。扶正抗癌方藥中、低劑量組與模型組、順鉑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高劑量組與順鉑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.45組小鼠Lewis肺癌組織VEGF、EGFR比較

模型組Lewis肺癌組織中VEGF、EGFR表達(dá)顯著升高，扶正抗癌方藥可以顯著降低Lewis肺癌組織中VEGF、EGFR表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3討論

肺癌歸屬于中醫(yī)“癌病”范疇，我們依據(jù)中醫(yī)理論并經(jīng)多年的臨床觀察認(rèn)為正氣虧虛、痰瘀毒相互影響是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的主要病機(jī)，本虛標(biāo)實，且有人對中醫(yī)藥治療晚期非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行臨床療效觀察顯示，在中醫(yī)辨證分型中氣陰兩虛證占辨證的多數(shù)，且氣陰兩虛證患者治療的有效率較高[6]。因而確立了以益氣扶正養(yǎng)陰為主，清熱化痰、活血化瘀、清熱解毒為輔的扶正抗癌方藥治療非小細(xì)胞肺癌。

通過實驗觀察，5組小鼠腫瘤組織均有所生長，扶正抗癌方藥高、中劑量組腫瘤均較模型組輕，其中高劑量組最為明顯，但較順鉑組抑瘤率略低，由此可見，雖然扶正抗癌方藥未及順鉑的抑瘤率，但也能有效抑制腫瘤組織的生長，因而當(dāng)順鉑等化療藥物出現(xiàn)不良反應(yīng)及耐藥時嘗試中醫(yī)藥抗腫瘤不失為一種有效途徑。

在肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移進(jìn)程中，涉及基因表達(dá)的異常、新生血管的形成，信號傳導(dǎo)異常等多環(huán)節(jié)的變化。而中醫(yī)藥抗腫瘤作用機(jī)制：1）抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡;2）改善癌基因表達(dá)，抑制腫瘤血管生成;3）改善血液流變學(xué)指標(biāo)，活血化瘀;4）提高免疫功能;5）逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥以利于化療藥物的增效減毒[3]。癌基因激活和抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要原因，其中Bcl2、Bax均為凋亡相關(guān)蛋白，Bcl2通過干擾細(xì)胞色素C自線粒體的釋放而阻斷Caspase蛋白酶的激活而使瘤細(xì)胞的凋亡減少，存活時間延長[7]，但其表達(dá)與NSCLC臨床病理因素?zé)o關(guān)，并不能作為判定預(yù)后的指標(biāo)[8]。而Bax在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，與Bcl2產(chǎn)生拮抗作用，與之呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性[9]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移癌的生長必須要有新生的血管提供血液供應(yīng)，而促血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）及其受體被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性最高的關(guān)鍵性調(diào)控因子。有實驗研究表明，VEGF在肺癌中高表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及分期有關(guān)，可以作為初步判斷NSCLC預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，較好地評判腫瘤的惡性程度、評估患者的臨床分期，反映腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1012]。隨著對EGFR基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在大多數(shù)NSCLC患者中高表達(dá)，在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是治療NSCLC的一個重要靶點[1314]。此外，MMP9水平在NSCLC顯著升高，有利于協(xié)助預(yù)測轉(zhuǎn)移傾向及評價預(yù)后[15]。因此，在晚期NSCLC維持治療中觀察Bcl2、Bax、VEGF、EGFR、MMP的表達(dá)是有意義的。

本研究顯示扶正抗癌方能抑制肺癌細(xì)胞增殖，抑制肺癌細(xì)胞Bcl2基因的表達(dá)，激活Bax的高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)肺癌細(xì)胞中VEGF、EGFR、MMP的表達(dá)，阻斷血管形成，阻斷相關(guān)信號傳導(dǎo)，繼而阻斷腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，且有劑量依賴關(guān)系，雖然總體抗腫瘤水平與順鉑相比效果欠佳，但依舊能起到一定條件下的替代作用，為臨床中醫(yī)藥維持治療晚期NSCLC提供了可靠的實驗依據(jù)。

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（2018-02-09收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）