HPLCDAD法測定八味茵術顆粒劑中6,7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ的含量

陸麟 王卓君 戈大春 錢浩良

摘要目的：探討八味茵術顆粒劑中6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ的含量測定方法。方法：選取DIKMA Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，DAD檢測（200～400 nm）：6，7二甲氧基香豆素的檢測波長為340 nm，白術內(nèi)酯Ⅲ的檢測波長為220 nm，白術內(nèi)酯Ⅰ的檢測波長為275 nm。進樣量為5 μL，流動相為水（A）乙腈（B）梯度洗脫，流速為1 mL/min。結果：6，7二甲氧基香豆素在0.1～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好（R2=1.0000）、白術內(nèi)酯Ⅲ在0.1～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好（R2=1.0000）、白術內(nèi)酯Ⅰ在0.1～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好（R2=1.0000），其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合含量測定要求。結論：本方法簡單易行，準確可靠，可有效用于八味茵術顆粒劑的質(zhì)量控制。

關鍵詞八味茵術顆粒劑;6，7二甲氧基香豆素;白術內(nèi)酯Ⅲ;白術內(nèi)酯Ⅰ;高效液相色譜;含量測定

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.012

八味茵術顆粒劑為我院的自擬協(xié)定處方，經(jīng)過多年臨床使用，療效確切，由茵陳、生白術、茯苓、蒼術、黃芩、淡竹葉、澤瀉、梔子9味中藥組成。主要的功效是健脾利濕。臨床用于皮膚科濕瘡、濕疹，對于脾失健運的胃腸道癥狀，如胃納差、惡心腹脹、大便溏泄等也具有很好的效果。方中茵陳清利濕熱、利濕，白術健脾益氣、燥濕利尿，共為君藥，行健脾利濕之功，在我院皮膚科得到廣泛應用。為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，選用高效液相色譜法進行含量測定，選用方中君藥的有效成分6，7二甲氧基香豆素，白術內(nèi)酯Ⅲ和白術內(nèi)酯Ⅰ作為指標性成分。

1儀器與試藥

1.1儀器

Sartorius BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）;SHIMAZU LC2030C 3D高效液相色譜儀（日本SHIMAZU公司）;HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;DZF6050MBE型真空干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）;AC220240V超聲波清洗機（深圳深華泰超聲洗凈設備有限公司）。

1.2試劑

6，7二甲氧基香豆素（中國藥品生物制品檢定所，批號：111740200702）;白術內(nèi)酯Ⅲ（中國藥品生物制品檢定所，批號：111978201501）;白術內(nèi)酯Ⅰ（中國藥品生物制品檢定所，批號：111975201501）;乙腈[高效液相色譜法（HPLC），MERCK，德國];甲醇（HPLC，MERCK，美國）。

1.3分析樣品

八味茵術顆粒（自制，批號：171203、171225、180402）。本品為淺棕色或棕色顆粒狀，氣微，味苦。粒度、含水量、顆粒溶化性均符合《中華人民共和國藥典》2015年版的規(guī)定。

2方法與結果

2.1色譜條件

DIKMA Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，DAD檢測（200～400 nm），流速為1 mL/min，進樣量為5 μL，流動相為水（A）乙腈（B）梯度洗脫，0～10.0 min，55% MPB，10.0～25.0 min，55%～95%MPB，25.0～25.1 min，95%～55%MPB，25.1～30.0 min，55%MPB。理論板數(shù)按3種標準品6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ峰計算應不低于3 000。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

取6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3供試品溶液的制備

精密量取八味茵術顆粒20.0 g，置20 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，過濾，取續(xù)濾液5 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，即得含量測定的樣品溶液。

2.4專屬性試驗精密吸取6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯III、白術內(nèi)酯I對照品溶液，按2.2.2項下的色譜條件進行測定;精密量取八味茵術顆粒適量，按照2.2.1供試品溶液的制備項下制備樣品溶液，依照2.2.2項下的色譜條件進行測定，建立各樣品的特征圖譜，理論板數(shù)按3種標準品6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯III、白術內(nèi)酯I峰計算應不低于3 000。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.5線性關系考察

精密稱取6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ對照品適量，分別配成濃度為0.1 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、10.0 μg/mL、30.0 μg/mL、100.0 μg/mL的溶液，分別精密吸取上述各對照品溶液5 μL，按2.1項下的色譜條件測定，以6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。見表1。其標準曲線見圖2～4。

2.6中間精密度試驗

取按照2.2和2.3項下制備八味茵術顆粒的樣品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積A，計算6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ濃度的RSD值。測定結果表明6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ的進樣精密度良好。見表2。

2.7供試品溶液穩(wěn)定性試驗

按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒的樣品溶液，進樣分析。于4、8、12、24 h后分別再次進樣分析，記錄并比較6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ含量的變化，評價樣品溶液中6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ室溫放置不同時間的穩(wěn)定情況。測定結果表明6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ在室溫放置24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表3。

2.8重復性試驗

按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒的樣品溶液，進樣分析。平行測定6份，記錄峰面積A，計算6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ濃度的RSD值。測定結果表明重復性良好。見表4。

2.9回收率試驗

取八味茵術顆粒2.0 g，精密稱定，置20 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液進行HPLC測定，得到樣品中6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ的含量A mg。

取八味茵術顆粒2.0 g和相應對照品B mg，精密稱定，置20 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液進行HPLC測定，得到樣品中6，7二甲氧基香豆素、白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ的含量C mg。平行3份。見表5。

2.10樣品測定結果

分別稱取制備的3批八味茵術顆粒，按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒樣品溶液，進樣分析。見表6。

3討論

八味茵術顆粒劑為基于中醫(yī)藥理論而成的純中藥制劑，由茵陳、生白術、茯苓、蒼術、黃芩、淡竹葉、澤瀉、梔子等8味中藥組成。白術和茵陳為方中君藥。白術對消化體統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)有多種藥理作用[110]，比較明確的是白術有健脾益氣、調(diào)節(jié)胃腸運動的功能的特點，能夠使唾液淀粉酶活性增強、對腸管功能進行調(diào)節(jié)、對腸管吸收具有促進作用，有實驗證明白術內(nèi)酯Ⅰ為健脾的有效成分[11]。茵陳利濕退黃，同樣具有多種的藥理作用[1217]，主要體現(xiàn)在保肝利膽、調(diào)節(jié)免疫、抗病原微生物等方面，其中6，7二甲氧基香豆素有利尿、降低膽固醇和三酰甘油之功效[1819];由于中藥復方成分復雜，干擾因素多，因此需要一個簡單可行的含量測定方法來監(jiān)測八味茵術顆粒的質(zhì)量，雖然有時中藥復方中有效成分往往不是含量最高的，有的甚至很難檢測到，為含量測定帶來難度，如白術內(nèi)酯Ⅰ，預實驗選用RIGOL的HPLC基本檢測不到，但是白術的內(nèi)酯類成分是活性成分，最后選用SHIMAZU LC2030C 3D的HPLC進行含量測定，以君藥茵陳、白術中的有效活性成分作為含量測定的指標性成分。

查閱有關白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素含量測定的文獻[2024]，并且結合預實驗的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)白術內(nèi)酯Ⅲ在220 nm波長處有最大紫外吸收，白術內(nèi)酯Ⅰ在220 nm波長處的紫外響應卻很低，但是在275 nm處有最大吸收;而6，7二甲氧基香豆素在275 nm波長處幾乎沒有紫外吸收，在340 nm波長處有最大紫外吸收，首先選擇了檢測波長切換的方法對其進行含量測定：0～5.0 min檢測波長為340 nm，5.01～12.0 min檢測波長為220 nm，12.01～30.0 min檢測波長為275 nm，但是最終得到的液相圖譜基線不穩(wěn)定，于是最終確定HPLCDAD全波長掃描法對其進行含量測定。

預實驗同樣對提取溶劑和提取時間的選擇進行了考察。提取溶劑選擇了甲醇：水（1∶1）、甲醇和水3種，提取方式選擇超聲，分別考察了顆粒劑在15 min，30 min和45 min的3種有效成分的提取率，指標性成分對于提取溶劑的敏感度各不相同：6，7二甲氧基香豆素在純甲醇中幾乎沒有被提取，白術內(nèi)酯Ⅲ在水中提取率最高，但白術內(nèi)酯Ⅰ在水中提取率最低。指標性成分對于提取時間的敏感度也各不相同：白術內(nèi)酯Ⅲ在水中提取率隨時間延長而增加，但是在甲醇中卻隨時間延長而降低;6，7二甲氧基香豆素不管在何種溶劑中其提取率均隨時間的延長而降低;白術內(nèi)酯Ⅰ在水中提取率不隨時間變化，但在甲醇中提取率隨時間延長而增加，卻在甲醇：水（1∶1）中隨時間延長而降低。故綜合考慮，最終選擇甲醇：水（1∶1）作為提取溶劑，提取時間為15 min。

預實驗對含量測定的流動相和色譜柱進行了簡單的考察。流動相選擇了乙腈和不同濃度的磷酸水溶液（0.05%，0.1%，1.0%）梯度洗脫，基本無差異，故最后選擇比較簡單的乙腈水作為流動相。色譜柱首先選擇Phenomenx Luna C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），白術內(nèi)酯Ⅲ和白術內(nèi)酯Ⅰ能得到有效分離，峰形良好，但是6，7二甲氧基香豆素無論何種流動相，峰形都不理想，后來改為DIKMA Diamonsil C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，3種指標性成分的峰形和分離情況都良好，故色譜柱選擇DIKMA Diamonsil C18（2）。

通過對八味茵術顆粒的性狀、粒度、含水量、溶化性、含量測定等研究，建立了其質(zhì)量標準的方法，通過控制方中活性成分的白術內(nèi)酯Ⅲ、白術內(nèi)酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素的含量，為八味茵術顆粒的藥效指標及臨床療效的重復性和穩(wěn)定性提供了保障，也為中試產(chǎn)品的質(zhì)量標準建立奠定了方法學基礎。利用DAD檢測器建立多波長高效液相色譜法，可在同一色譜條件下利用不同檢測窗口實現(xiàn)多類組分、多個成分的同時定性、定量測定，提高了效率。該方法簡單易行，準確可靠，可有效用于八味茵術顆粒劑的質(zhì)量控制。

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（2018-06-06收稿責任編輯：楊覺雄）