黃連堿改善脂肪肝SD大鼠模型的效應(yīng)及機(jī)制研究

王妮華 王瓊熠 范輝

摘要目的：觀察黃連堿對脂肪肝SD大鼠模型脂代謝指標(biāo)的影響，探討作用機(jī)制。方法：采用高脂飼養(yǎng)構(gòu)建SD大鼠脂肪肝模型，隨機(jī)分組為正常對照組、高脂模型組、黃連堿低、高劑量組（10 mg/kg、50 mg/kg），給藥30 d，分析大鼠體重、肝指數(shù)、三酰甘油（TG）、肝功能（ALT，AST）及肝臟病理等指標(biāo);采用人肝癌HepG2細(xì)胞系，蛋白免疫印跡法（WB）觀察黃連堿對AMP活化蛋白激酶（AMPK）蛋白的表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（RTPCR）方法分析肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）mRNA、羥甲基戊二酰輔酶A（HMGCoa）mRNA的表達(dá)，高效液相色譜（HPLC）測定細(xì)胞內(nèi)AMP的含量。結(jié)果：與高脂飲食組比較，黃連堿低、高劑量組均降低了TG水平、改善AST以及肝臟組織學(xué)形態(tài)，且黃連堿高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。在HepG2細(xì)胞中，黃連堿顯著提高AMP的濃度，激活A(yù)MPK蛋白磷酸化表達(dá)，上調(diào)CPT1 mRNA的表達(dá)，抑制HMGCoa mRNA的表達(dá)。結(jié)論：黃連堿具有顯著改善大鼠脂肪肝的效應(yīng)，作用機(jī)制可能與提高AMP的濃度，激活A(yù)MPK信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞黃連堿;脂肪肝;AMP;AMPK

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.010

黃連堿（Coptisine，COP）是毛茛科植物黃連中含季銨基團(tuán)的異喹啉類生物堿，有抗菌、抗炎[12]等多種生物活性[34]。黃連生物活性堿的調(diào)脂研究主要集中于小檗堿，其調(diào)脂效應(yīng)和機(jī)制是目前中藥單體成分中最深入的，小檗堿已被證明是通過線粒體呼吸鏈途徑間接上調(diào)AMP和ADP含量，激活A(yù)MPK[5]，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)氧化利用[67]。我們研究發(fā)現(xiàn)COP和小檗堿是黃連生物堿中的肝細(xì)胞高親和成分，且COP細(xì)胞親和性優(yōu)于小檗堿[8]。COP是否與小檗堿具有相同的降脂活性和作用機(jī)制有待探討。本課題研究以AMPK信號通路為主軸，在體內(nèi)模型上研究COP降脂活性的效應(yīng)，在體外層面探討其可能的降脂分子機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與細(xì)胞SD大鼠，雄性，平均體重（170±20）g，廣東省實驗動物中心供應(yīng);實驗期間飼養(yǎng)室溫度為（20±2）℃，濕度為（60±5）%。

人肝癌HepG2細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)：高糖DMEM完全培養(yǎng)液含有10%FBS、1%的雙抗（100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）。將細(xì)胞置于5%（φ）CO2的37 ℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次;待細(xì)胞生長至約80%，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

1.1.2藥物COP，純度≥95%，四川中藥標(biāo)準(zhǔn)中心供應(yīng)，批號：130220;高脂飼料（膽固醇2%，豬油10%，膽鹽0.3%，蔗糖20%，基礎(chǔ)飼料67.7%）廣東省實驗動物中心供應(yīng)。

1.1.3試劑與儀器高糖DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司，生產(chǎn)批號：1290007）;血清（美國賽默飛世爾公司）;胰酶（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：89010440）;三酰甘油（TG）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號分別為：2013010038、20130608、20130608）;BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號：110808）;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Advansta，貨號：11083115）;蛋白marker：（Thermo，生產(chǎn)批號：00113439）;引物序列由Invitrogen公司合成。色譜純甲醇（美國Honeywell公司&德國Merck公司）;實驗用水為超純水;其余試劑為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。UC6型超薄切片機(jī)（奧地利，Leica儀器有限公司）;H600型透射電鏡（日本日立電子有限公司）。SWCF1FD超凈臺（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo Scientific公司）;倒置顯微鏡（日本，Olympus公司）;Mithras LB 940酶聯(lián)免疫檢測儀（德國，Berthold Technologies公司）;5180R低溫高速離心機(jī)（德國，Eppendorf公司）HAL100熒光倒置顯微鏡（德國，Zeiss公司），實時PCR擴(kuò)增儀（ABI，Stepone Plus），熱循環(huán)PCR儀（Aplied Biosystems），Ultimate 3000 HPLC儀（美國，Dionex公司），配備DAD檢測器;Dionex Acclaim 120 C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）;PURELAB Ultra GE MK2純水儀（ELGA，High Wycombe，UK）;BT224s型萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備動物實驗：將SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（正常組）（n=6）和觀察組（n=18），分別用普通飼料及高脂飼料飼養(yǎng)。42 d造模成功后，觀察組隨機(jī)分成高脂模型組（模型組）、COP低劑量組（10 mg/kg）和COP高劑量組（50 mg/kg），每組6只。體外細(xì)胞實驗：HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)液中，將實驗細(xì)胞隨機(jī)分成空白對照組及COP低劑量組（5.0 mg/kg）、高劑量組（25.0 mg/kg）。

1.2.2給藥方法動物實驗：COP低、高劑量組分別給予濃度為10 mg/kg、50 mg/kg的COP，1次/d，正常組給予等容量的0.5%CMCNa，連續(xù)灌胃給藥30 d。細(xì)胞實驗：當(dāng)HepG2細(xì)胞長到80%～90%，以每孔2×105的細(xì)胞個數(shù)接種于6孔板，正常培養(yǎng)48 h，細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時分組給藥，空白對照組給予含10%FBS的完全培養(yǎng)基，觀察組中COP低、高劑量組分別予含COP 5.0 μg/mL、25.0 μg/mL的培養(yǎng)液，每組做6個平行孔。

1.2.3檢測指標(biāo)與方法

1）體重及肝指數(shù)測定：實驗期間稱量大鼠體重1次/周。實驗結(jié)束前，采血后快速摘取肝臟并稱取其質(zhì)量，計算肝指數(shù)（肝濕重/體重×100%）。

2）部分血清指標(biāo)測定：按試劑盒提供的方法測定：磷酸甘油氧化酶PAP法測定血清TG含量，用賴氏法測定ALT含量，比色法測定血清AST含量。

3）肝臟三酰甘油測定：稱取肝組織500 mg，加三氯甲烷：甲醇（1∶1）混合液后勻漿，待試劑揮發(fā)后用磷酸甘油氧化酶PAP法測定肝臟中TG含量。

4）肝臟病理結(jié)構(gòu)檢查：肝組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。對肝臟脂肪變性程度及炎性反應(yīng)程度進(jìn)行分級、評分，非酒精性脂肪性肝病的病理組織學(xué)診斷參考2010年中國肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》。

5）HPLC法測定細(xì)胞ATP、ADP、AMP含量：HepG2細(xì)胞提?。喝∨囵B(yǎng)皿的細(xì)胞首先用冰PBS洗滌兩次，立刻轉(zhuǎn)移到一個1.5 mLEP管中。加入冰預(yù)冷的1 mL 0.4 mol/L高氯酸，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中粉碎、勻漿;離心，取上清液，用5 mol/L的KOH調(diào)pH值至6.0～7.0，取上清，用0.22 μm濾膜過濾，待測。色譜條件：流動相：100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含12 mmol/L磷酸氫二鈉和88 mmol/L磷酸二氫鈉，PH=6.5）：甲醇（99.9∶0.1），柱子：C18;柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：30 μL;檢測波長：254 nm。

6）蛋白印跡分析：提取細(xì)胞總蛋白，按BCA試劑盒用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定蛋白濃度。進(jìn)行定量及樣品前處理后，根據(jù)碧云天BCA試劑盒說明書配制膠體（4%的積層膠，12%分離膠），將事先計算好的上樣量加入膠體中，以80 V電壓電泳30 min左右，再加至120 v電泳90 min后，將膠體上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜中，染色觀察蛋白是否順利轉(zhuǎn)印至PVDF膜中。用TBST將脫脂奶粉配制成5%濃度，將轉(zhuǎn)印后目的蛋白的PVDF膜進(jìn)行封閉2 h，隨后用TBST進(jìn)行洗滌3次，5 min/次。將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀上，滴入ECL發(fā)光液顯影，隨后進(jìn)行圖像采集。

7）PCR法檢測分析：細(xì)胞中加入1 mLTrizol充分反應(yīng)后按照說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，用Primer5.0軟件設(shè)計引物，由Invitrogen公司合成，以20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。樣品在PikoReal上運行96實時qPCR檢測系（ThermoFisher）引物序列CPT1上游：5′GCCGCTCGTTCACTCCA3′;下游：5′AGCCGCAGATGTCAATCCC3′;HMGCOA：上游：5′TAACTCAGAGGGTTAAGAT3′;下游：5′ACTGCCAGAGGGAAAC3′。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對分組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用多重比較檢驗和χ2分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1高脂飼料建立脂肪肝的SD大鼠模型實驗過程中各組大鼠均無死亡發(fā)生。與正常對照組大鼠比較，高脂飲食組大鼠性情溫順，不喜動，毛發(fā)蓬亂無光澤，大便稀軟，且次數(shù)較正常對照組少。造模六周后，進(jìn)行分組給藥，給藥約第二周，COP組的大鼠較模型組活躍，飼料攝入量與模型組相當(dāng)。

2.2COP對脂肪肝大鼠模型體重、肝功能的影響與正常對照組比較，高脂飲食組大鼠體重增長均較快，各給藥組的體重增長速度在給藥第二周后緩慢，慢于模型組的體重增加速度，但最終體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與高脂飲食組比較，COP低、高劑量組的肝重、肝指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。與正常對照組比，高脂飲食組血清TG、ALT和AST水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表現(xiàn)為高三酰甘油血癥和典型脂肪肝特點;與模型組比較，各給藥組血清TG水平降低，COP改善了肝酶ALT、AST水平（P<0.05）。見圖2。

2.3COP對脂肪肝大鼠模型的肝臟病理影響肝臟組織TG含量的變化與正常對照組比較，高脂飲食組肝臟組織TG含量較高，與模型組比較，各給藥組有顯著改善（P<0.05）。見圖3。肝臟組織學(xué)形態(tài)及HE染色病理的變化與正常對照組比較，高脂飲食組肝臟腫大，重量增加，邊緣鈍而厚，表面色澤蒼白，肝臟形態(tài)呈顯著脂肪變性征狀，切片出現(xiàn)大量脂肪空泡，表現(xiàn)為大泡性空泡，模型組表現(xiàn)為中重度的肝脂肪變性特點。與模型組比較，各給藥組組織形態(tài)仍呈一定的肝脂肪變性特征，且仍然存在脂肪空泡，但具有明顯恢復(fù)跡象，脂肪空泡轉(zhuǎn)變?yōu)樾∨菪灾荆抑究张轀p少。見圖4。

2.4COP對HepG2細(xì)胞ATP、ADP、AMP的影響采用高效液相色譜技術(shù)建立了測定HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量的方法，用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，蛋白測定校正分析，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，給藥組的AMP含量有明顯升高趨勢;COP高劑量組的細(xì)胞EC值較空白對照組顯著降低（P<0.05）。見表1、圖5。

圖6低、高劑量COP對高脂飲食大鼠AMPK蛋白磷酸化水平、CPT1 mRNA、HMGCoa mRNA水平的影響注：（A、B）各組HepG2細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平;（C）各組HepG2細(xì)胞CPT1 mRNA水平;（D）各組HepG2細(xì)胞HMGCoa mRNA水平，與正常對照組比較，*P<0.05

2.5COP對HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化、CPT1 mRNA和HMGCoa mRNA水平的影響采用p

AMPK蛋白表達(dá)/AMPK蛋白表達(dá)率評價AMPK激活程度。與空白對照組比較，COP低、高劑量組均可促進(jìn)AMPK蛋白磷酸化水平（P<0.05）。見圖6A、6B。與空白對照組比較，低劑量COP組CPT1 mRNA表達(dá)水平有上升的趨勢，但不具有顯著性差異，而高劑量COP組CPT1 mRNA表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6C。AMPK的激活，可抑制下游HMGCoa的表達(dá)，減少膽固醇的生成[9]。與空白對照組比較，高、低劑量COP組均有降低HMGCoa mRNA表達(dá)水平的趨勢。見圖6D。

3討論

脂肪性肝病（Fitty Liver Disease，F(xiàn)LD）是一種病變主體在肝小葉，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變的臨床病理綜合征。其特點是脂肪堆積，本質(zhì)是機(jī)體能量過?；蛑|(zhì)異位蓄積于肝，主要表現(xiàn)為肝臟實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性。中醫(yī)藥研究集中在活性中藥單體化合物，如小檗堿[10]，人參皂甙[11]，和齊墩果酸[12]，試圖通過藥物激活提高肝臟細(xì)胞能量代謝車間的運作效率。最近COP的藥物活性也引起了關(guān)注，抗心肌缺血[13]，抗糖尿病[14]，抗菌[15]，治療肝癌和白血病[16]等活性先后被報道[1718]。COP與小檗堿的結(jié)構(gòu)相似，均具有季銨活性基團(tuán)[19]。COP是黃連中的降脂活性成分，前期的研究發(fā)現(xiàn)COP體外降脂活性優(yōu)于小檗堿。本實驗證明了COP對高脂飼養(yǎng)的大鼠脂肪肝具有較好的治療作用，且COP高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組。

研究發(fā)現(xiàn)，肝臟脂質(zhì)代謝是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，一些重要的轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)節(jié)因子是整個網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點，如：PPARα、SREBP1c、AMPK。調(diào)控這些關(guān)鍵靶點可以幫助肝臟加速分解代謝，從而治療脂肪肝[20]。AMPK處在調(diào)控脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的上游，當(dāng)感受到細(xì)胞能量物AMP/ATP變化時，AMPK的磷酸化增強(qiáng)，可引起脂代謝調(diào)節(jié)因素的級聯(lián)反應(yīng)[21]。并且AMPK在哺乳動物細(xì)胞能量平衡及細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，其活化后能影響很多脂質(zhì)代謝相關(guān)酶，如HMGCoA、CPT1[22]。本實驗中采用WB和RTPCR方法探索COP降脂的機(jī)制，結(jié)果證明COP改變了HepG2細(xì)胞內(nèi)的能量物質(zhì)ATP，ADP，AMP的比例關(guān)系，降低了細(xì)胞EC值，進(jìn)而誘導(dǎo)AMPK蛋白的磷酸化，以及上調(diào)下游β氧化關(guān)鍵酶CPT1的mRNA的表達(dá)和下調(diào)HMGCoAmRNA的表達(dá)。這些結(jié)果均提示我們：COP降脂的途徑可能與激活A(yù)MPK信號通路途徑有關(guān)。

綜上所述，通過體內(nèi)動物水平研究證實了COP的治療脂肪肝效果顯著，具有降脂的功效，COP在體外HepG2細(xì)胞中，既有激活A(yù)MPK磷酸化的直接證據(jù)，又有激活A(yù)MPK信號通路的間接證據(jù)，降低了膽固醇合成酶HMGCoa mRNA的表達(dá)，促進(jìn)了脂肪酸β氧化CPT1 mRNA的表達(dá)。我們的研究提示COP可能通過激活A(yù)MPK信號通路來改善大鼠脂肪肝。

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（2018-12-10收稿責(zé)任編輯：王楊）