山大顏根、莖、葉提取物的體外抑菌活性評(píng)價(jià)及其作用機(jī)制研究

羅曉東 魏麗芳 鐘昳 丘波 張超 鄒浩元 張聲源

中圖分類(lèi)號(hào) R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）01-0073-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.16

摘 要 目的：考察山大顏根、莖、葉3個(gè)部位提取物的體外抑菌活性，并探究其抑菌作用機(jī)制。方法：將山大顏根、莖、葉的95%醇提物均制備成質(zhì)量濃度為100 mg/mL（以提取物計(jì)）的藥液，并以青霉素鈉（0.5 μg/mL）和硫酸鏈霉素（128 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，采用平板打孔法測(cè)定不同藥用部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、糞腸球菌等的抑菌作用。采用系統(tǒng)溶劑萃取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取山大顏抑菌活性部位，得到相應(yīng)極性部位萃取物，制備成質(zhì)量濃度均為100 mg/mL（以提取物計(jì)）藥液后，考察其對(duì)上述6種菌的抑菌作用；并分別采用微量肉湯稀釋法和瓊脂培養(yǎng)基平板法測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），篩選出具有抑菌作用的極性部位及對(duì)藥物敏感的試驗(yàn)菌株。然后在0.5MIC和MIC藥物濃度下繪制敏感菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（作用36 h，每4 h測(cè)定1次），檢測(cè)菌懸液中堿性磷酸酶（AKP）和可溶性蛋白含量（作用10 h，每2 h測(cè)定1次），并以肉湯培養(yǎng)基代替提取物作為空白對(duì)照。結(jié)果：100 mg/mL山大顏根、莖和葉的醇提物對(duì)上述6種細(xì)菌均有較好的抑菌效果，其作用強(qiáng)弱為莖>葉>根；在山大顏莖的不同極性部位中，以乙酸乙酯部位的抑菌作用最強(qiáng)，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌，其抑菌圈直徑為（38.93±0.12） mm，MIC、MBC均為0.39 mg/mL。山大顏莖乙酸乙酯部位可顯著抑制金黃色葡萄球菌的增殖，菌懸液中堿性磷酸酶和蛋白質(zhì)含量較空白對(duì)照顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：山大顏莖為抗菌活效部位，對(duì)常見(jiàn)的6種病原菌有不同程度的抑制效果；其中以山大顏莖的乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最為顯著，能逐步破壞其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性。

關(guān)鍵詞 山大顏；不同部位；體外抗菌活性；作用機(jī)制；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

Evaluation of in vitro Antibacterial Activity of the Extracts from Root， Stem and Leaves of Psychotria rubra and Its Mechanism Study

LUO Xiaodong1，WEI Lifang1，ZHONG Yi1，QIU Bo1，ZHANG Chao1，ZOU Haoyuan1，ZHANG Shengyuan1 （1.Medical College of Jiaying University， Guangdong Meizhou 514031， China；2.Hospital Affiliated to Medical College of Jiaying University， Guangdong Meizhou 514031， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate in vitro antibacterial activity of the extracts from the root， stem and leaves of Psychotria rubra， and to investigate its mechanism of antibacterial effects. METHODS： 95% ethanol extracts from the root， stem and leaves of P. rubra were used to prepare solution with mass concentration of 100 mg/mL （calculated by extract）. Using as penicillin sodium （0.5 mg/mL） and streptomycin sulfate （128 mg/mL） as positive control， plat stiletto method was used to determine antibacterial effects of the extracts from different parts of Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Micrococcus luteus and Enterococcus faecalis. Using systematic solvent extraction method， the petroleum ether， ethyl acetate and n-butyl alcohol were used to extract antibacterial activity parts from P. rubra as ad to obtain the extracts of corresponding polar parts. After preparing 100 mg/mL drug solution （calculated by extract）， antibacterial effects of above 6 kinds of bacteria were investigated. The micro-broth dilution method and agar culture medium plate method were used to determine minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）， and screen polar parts with bacteriostasis and drug-sensitive strains. Under the concentration of 0.5MIC and MIC， the growth curves of sensitive bacteria were drawn （treated for 36 h， every 4 h）； the contents of alkaline phosphatase （AKP） and soluble protein were detected in suspension （treated for 10 h， every 2 h）； bouillon culture medium instead of the extract as blank control. RESULTS： 100 mg/mL ethanol extracts from the root， stem and leaves of P. rubra showed good antibacterial effect to above 6 kinds of bacteria， in descending order as stem>leaves>root. Among different polar parts from the stem of P. rubra， antibacterial effect of the ethyl acetate extract was best， especially for the S. aureus， the diameter of inhibition zone reached （38.93±0.12） mm， and both MIC and MBC were 0.39 mg/mL. The ethyl acetate extract could significantly inhibit the proliferation of S. aureus， and its alkaline phosphatase and protein content in suspension were increased significantly compared with blank control （P<0.05）. CONCLUSIONS： The stem from P. rubra is effective antibacterial parts， and exhibit good antibacterial activity to 6 kinds of common pathogens. The ethyl acetate extract from the stem of P. rubra shows strongest antibacterial effect on S. aureus， and could gradually destroy the integrity of cell wall and cell membrane.

KEYWORDS Psychotria rubra； Different parts； Antibacterial activity in vitro； Mechanism of effect； Minimum inhibitory concentration； Minimum bactericidal concentration

隨著抗生素的過(guò)度和不合理使用，細(xì)菌對(duì)藥物的耐藥性不斷增加，人類(lèi)或即將面臨無(wú)藥可用的“后抗生素時(shí)代”。相對(duì)于化學(xué)藥，中草藥具有作用靶點(diǎn)多、抗菌譜廣、不易耐藥、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[1-2]。因此，從中草藥中尋找新的、毒副作用小的抗菌活性化合物已成為藥物研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。

山大顏[Psychotria rubra （Lour.） Poir.]又名山大刀、脂紅葉、九節(jié)木等，為茜草科九節(jié)屬植物，以根、葉入藥，是我國(guó)南方常用中草藥，也是國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)廣東涼茶的常用中藥之一[3-4]。山大顏對(duì)白喉、小兒夏季熱、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等均具有一定的療效，梅州客家地區(qū)常用其莖、葉水煎液治療白喉、口腔炎癥[5-6]。目前，對(duì)于山大顏的化學(xué)成分及藥理活性的研究較少。有文獻(xiàn)資料[7-8]顯示，九節(jié)屬植物中的化學(xué)成分主要以生物堿類(lèi)為主，此外還有萜類(lèi)、甾體類(lèi)、酚類(lèi)以及少量脂肪族化合物，具有一定的抗真菌、抗病毒活性。而本課題組在前期研究中亦發(fā)現(xiàn)，山大顏莖、葉水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌等人體常見(jiàn)致病菌有一定的抑菌活性。因此，為進(jìn)一步明確山大顏的藥理活性部位及作用機(jī)制，本研究擬對(duì)山大顏根、莖和葉3個(gè)部位的提取物分別進(jìn)行體外抑菌活性評(píng)價(jià)，并以抑菌活性部位及其敏感菌為對(duì)象，探究其抑菌作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；BSC-1100ⅡA2-X 超凈工作臺(tái)（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；WGZ-XT 細(xì)菌濁度儀（杭州齊威儀器有限公司）；FA7004B電子天平[（上海）天美天平儀器有限公司]；DH-9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BY-160C離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2 藥品、試劑與培養(yǎng)基

山大顏于2017年5月購(gòu)自廣東省梅州市興寧市羅崗鎮(zhèn)袁記草藥店，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥化教研室羅寶平副教授確認(rèn)為山大顏真品；青霉素鈉原料藥（批號(hào)：6121010150，純度：≥99%）、硫酸鏈霉素原料藥（批號(hào)：73210101100，美國(guó)藥典級(jí)）均購(gòu)自美國(guó)Genview公司；蛋白定量測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20171111）、堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20171117）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；乙醇（95%）、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為滅菌蒸餾水；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20170708）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：20170808）、血瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20170708）均購(gòu)自江門(mén)凱林貿(mào)易生物公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希菌ATCC- 25922、銅綠假單胞菌ATCC9027、枯草芽孢桿菌ATCC- 6633、藤黃微球菌ATCC49732、糞腸球菌ATCC29212等標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)自廣東省菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

無(wú)菌操作條件下，將安瓿瓶保存的各標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基上復(fù)蘇，其中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，血瓊脂培養(yǎng)基用于藤黃微球菌、糞腸球菌的培養(yǎng)，37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h轉(zhuǎn)接1次，用滅菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)（菌濃度約為1.5×108 CFU/mL），再取少量菌懸液用滅菌生理鹽水稀釋100倍（菌濃度約為1.5×106 CFU/mL），備用。

2.2 山大顏不同部位提取物及對(duì)照液的制備

2.2.1 山大顏不同部位提取物 稱(chēng)取山大顏干燥根100 g，粉碎，加2倍量的95%乙醇浸泡過(guò)夜，45 ℃條件下超聲（頻率：45 kHz，功率：250 W）提取30 min，過(guò)濾，藥渣重復(fù)上述操作2次，合并3次濾液。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到山大顏根（10.23 g）的醇提物浸膏。同法分別制得山大顏莖（11.58 g）、葉（12.62 g）的醇提物浸膏。將各提取物浸膏用2%DMSO溶解，制成質(zhì)量濃度均為100 mg/mL（以提取物計(jì)）的藥液。

2.2.2 陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照液的制備 將青霉素鈉、硫酸鏈霉素原料藥分別用2%DMSO溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.5 μg/mL、128 mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照液（青霉素鈉為革蘭氏陽(yáng)性菌的陽(yáng)性對(duì)照藥，硫酸鏈霉素為革蘭氏陰性菌的陽(yáng)性對(duì)照藥）；以2%DMSO作為陰性對(duì)照液。試驗(yàn)前藥液均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

2.3 山大顏不同部位提取物的體外抑菌作用檢測(cè)

采用平板打孔法[9]。按無(wú)菌操作要求，分別吸取100 μL各菌懸液至相應(yīng)培養(yǎng)基表面，無(wú)菌棉簽涂布均勻，室溫靜置2 min；用打孔器等距打孔3個(gè)，每孔大小均為5 mm，向每個(gè)小孔中分別加入配制好的藥液、陽(yáng)性對(duì)照液（青霉素鈉或者硫酸鏈霉素）和陰性對(duì)照液各30 μL，放置30 min讓藥液充分?jǐn)U散，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，取出并測(cè)量抑菌圈直徑。每種菌株平行操作3次。結(jié)果判定按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)[10]：抑菌圈直徑<10 mm為抗藥，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感。山大顏不同部位對(duì)6種細(xì)菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，在相同質(zhì)量濃度下，山大顏根、莖、葉對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌均具有不同程度的抑菌作用，但對(duì)大腸埃希菌無(wú)明顯抗菌作用。各部位提取物對(duì)上述5種敏感菌的抗菌活性大小均表現(xiàn)為莖>葉>根。因此，本研究對(duì)山大顏莖的醇提物進(jìn)行系統(tǒng)溶劑萃取，進(jìn)一步考察其不同極性部位萃取物的體外抗菌活性。

2.4 山大顏莖不同極性部位的體外抑菌活性測(cè)定

2.4.1 山大顏莖不同極性部位的制備 稱(chēng)取山大顏莖1 kg，按“2.2”項(xiàng)下方法制得山大顏莖的醇提物總浸膏（117.02 g）。將得到的浸膏用水分散后，采用系統(tǒng)溶劑萃取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮，回收溶劑后分別得到石油醚部位萃取物（7.01 g）、乙酸乙酯部位萃取物（42.61 g）、正丁醇部位萃取物（38.64 g）和剩余的水部位萃取物（28.78 g ），所有樣品均置于干燥玻璃器中保存，備用。待用時(shí)，將各部位萃取物用2%DMSO溶解，制成質(zhì)量濃度均為100 mg/mL的藥液（以提取物計(jì)），置于4 ℃冰箱中保存，使用前所有藥液均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

2.4.2 山大顏莖不同極性部位的抑菌活性測(cè)定 以“2.4.1”項(xiàng)制備的質(zhì)量濃度均為100 mg/mL的4份藥液為試驗(yàn)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下試驗(yàn)方法測(cè)定其對(duì)上述6種細(xì)菌的抑菌圈大小。山大顏莖不同極性部位對(duì)6種細(xì)菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，山大顏莖乙酸乙酯部位的抑菌活性較另外3個(gè)極性部位明顯要強(qiáng)，其對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑均大于山大顏莖醇提物總浸膏，且對(duì)大腸埃希菌表現(xiàn)出一定的抗菌作用。其中，山大顏莖正丁醇部位的抑菌譜和乙酸乙酯部位相似，但抗菌活性次之；石油醚部位和水部位的抗菌譜和抑菌活性相似。為確定山大顏莖的最佳活性部位，進(jìn)一步對(duì)其不同極性部位進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定。

2.4.3 山大顏莖不同極性部位對(duì)6種細(xì)菌的MIC、MBC測(cè)定 （1）MIC的測(cè)定。采用微量肉湯稀釋法[11]，取96孔微量板，第1～11孔加入肉湯培養(yǎng)基100 μL，第1孔分別加入100 μL山大顏4種極性部位藥液，混合均勻，自第1孔吸取100 μL藥液加入后1孔中，依次作遞倍稀釋?zhuān)恋?0孔混合后棄去培養(yǎng)液100 μL。吸取100 μL菌懸液依次加入第1～11孔中，充分混勻，此時(shí)每孔菌濃度為7.5×105 CFU/mL，吸取200 μL肉湯培養(yǎng)基加入到第12孔中。最后將96孔微量板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后取出，在黑色背景光下觀(guān)察，培養(yǎng)基渾濁或孔底有沉淀的為有菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基澄清或底部無(wú)沉淀者即為MIC。每種菌株平行操作3次。（2）MBC的測(cè)定。分別從MIC測(cè)定中未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)吸取100 μL培養(yǎng)液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或血瓊脂培養(yǎng)基中，用無(wú)菌棉簽均勻涂布，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后取出，觀(guān)察結(jié)果并計(jì)數(shù)菌落，以平均菌落數(shù)小于5的藥物最低質(zhì)量濃度為MBC。每種菌株平行操作3次。山大顏莖不同極性部位對(duì)6種細(xì)菌的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，在山大顏莖4個(gè)極性部位中，乙酸乙酯部位的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)6種受試細(xì)菌均有抑菌作用（MIC、MBC分別在0.39～12.50、0.39～25.00 mg/mL之間），且以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，MIC、MBC均為0.39 mg/mL；其次是正丁醇部位，其MIC、MBC分別在0.78～25.00、1.56～50.00 mg/mL之間；再者是山大顏莖石油醚部位，其對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為6.25、100.00 mg/mL，但對(duì)其余4種細(xì)菌的抑菌活性較?。蛔詈笫撬课?，其對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為12.50、50.00 mg/mL，MBC分別為25.00、100.00 mg/mL，但對(duì)其余4種細(xì)菌的抑菌活性較小。因此，本研究將進(jìn)一步探究山大顏莖乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用機(jī)制。

2.5 山大顏莖乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用機(jī)制研究

2.5.1 細(xì)菌增殖測(cè)定 參考文獻(xiàn)中方法[12-13]略作修改。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的受試菌株（金黃色葡萄球菌）按照1%（V/V）接種至肉湯培養(yǎng)基中，加入適量的山大顏莖乙酸乙酯部位藥液，混勻，使藥液的終質(zhì)量濃度分別為0.5MIC、MIC，并以肉湯培養(yǎng)基代替提取物作為空白對(duì)照，然后將菌株置于搖床 （37 ℃、100 r/min）上振蕩培養(yǎng)。每間隔4 h取培養(yǎng)基測(cè)定其在630 nm波長(zhǎng)處的光密度，研究金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)變化趨勢(shì)。金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，金黃色葡萄球菌在空白對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后增殖明顯，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)20 h后細(xì)菌生長(zhǎng)趨于平緩。而在0.5MIC、MIC的藥物濃度下，細(xì)菌生長(zhǎng)明顯受到抑制；其中，又以MIC藥物濃度下細(xì)菌生長(zhǎng)抑制更為顯著，未出現(xiàn)明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線(xiàn)穩(wěn)定在較低水平。

2.5.2 菌懸液中AKP和可溶性蛋白含量測(cè)定 按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備藥液和培養(yǎng)細(xì)菌，每間隔2 h取細(xì)菌混懸液2 mL，以4 000 r/min離心10 min，收集培養(yǎng)基上清液。分別按照各自試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)上清液中AKP和可溶性蛋白含量。所有數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行整理，應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。菌懸液中AKP和可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2（1金氏單位/100 mL=7.14 U/L）。

由2A可知，加入0.5MIC及MIC山大顏莖乙酸乙酯部位藥液后，菌懸液中AKP的含量明顯高于空白對(duì)照（P<0.05），且加入MIC濃度藥液后菌懸液中AKP含量明顯高于加入0.5MIC濃度藥液（P<0.05）。0～4 h內(nèi)，在0.5MIC、MIC藥物濃度下，菌懸液中的AKP含量均持續(xù)升高，8 h達(dá)到峰值后趨于平穩(wěn)，而空白對(duì)照菌懸液中AKP含量則一直維持在較低水平。

如圖2B可知，加入0.5MIC、MIC山大顏莖乙酸乙酯部位藥液后，菌懸液中可溶性蛋白含量明顯高于空白對(duì)照（P<0.05）。0～4 h內(nèi)，0.5MIC、MIC藥物濃度下菌懸液中可溶性蛋白含量持續(xù)升高；6 h后，菌懸液中蛋白含量有所降低，并在培養(yǎng)8 h后趨于平穩(wěn)。而空白對(duì)照菌懸液中可溶性蛋白含量一直維持在較低水平。

3 討論

體外抗菌結(jié)果顯示，山大顏根、莖、葉3個(gè)部位均具有不同程度的抑菌活性，其中山大顏莖的抑菌活性作用優(yōu)于葉和根，這也佐證了梅州五華縣的民間用法。接著，通過(guò)考察山大顏莖不同極性部位對(duì)6種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)山大顏莖乙酸乙酯部位的抑菌活性?xún)?yōu)于其他3個(gè)極性部位，且其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道，山大顏莖的乙酸乙酯部位和正丁醇部位均含有一定的正丁基苷類(lèi)、糖類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)及核糖氮苷類(lèi)化合物，而萜類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物均具有潛在的抑菌活性[14-16]。因此，筆者推測(cè)山大顏莖的抑菌作用可能與其富含環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜類(lèi)及黃酮類(lèi)成分有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌菌懸液濃度與其光密度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照比較，在0.5MIC藥物濃度時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到了抑制，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)和平臺(tái)期的時(shí)間并沒(méi)有明顯改變；而在MIC藥物濃度時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)被顯著抑制，無(wú)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。說(shuō)明山大顏莖乙酸乙酯部位能夠明顯地抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，且藥物濃度越大，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)。

當(dāng)細(xì)胞壁受到破壞后其通透性升高，存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的AKP會(huì)大量滲透到細(xì)胞外[19]。在加入0.5MIC、MIC山大顏莖乙酸乙酯部位藥液后，菌懸液中AKP含量均明顯高于空白對(duì)照，說(shuō)明山大顏莖乙酸乙酯部位能夠破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的完整性，且其破壞作用與藥物濃度水平有一定的相關(guān)性。細(xì)菌細(xì)胞膜完整性受到破壞后，細(xì)胞膜通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致跨膜蛋白含量增多[20]。菌懸液中可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果顯示，加入0.5MIC、MIC山大顏莖乙酸乙酯部位藥液后，菌懸液中可溶性蛋白含量在0～4 h內(nèi)均持續(xù)增加，說(shuō)明山大顏莖乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生了破壞作用，且其破壞程度受藥物濃度大小的影響；培養(yǎng)8 h后，菌懸液中可溶性蛋白含量趨于平穩(wěn)，這可能是因?yàn)殡S著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，山大顏莖乙酸乙酯部位的有效抑菌成分逐漸消耗，對(duì)菌體細(xì)胞膜的破壞作用減弱，胞外蛋白的外滲與細(xì)菌的自我修復(fù)對(duì)蛋白的吸收再利用處于平衡狀態(tài)。

綜上所述，山大顏根、莖、葉3個(gè)部位均具有一定的抑菌活性，對(duì)常見(jiàn)的6種病原菌有不同程度的抑菌效果。山大顏莖的抑菌活性在3個(gè)部位中最強(qiáng)，特別是其乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌最為敏感，能逐步破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，抑制其生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抑菌活性。本研究為中草藥山大顏的開(kāi)發(fā)利用提供了研究依據(jù)，也為進(jìn)一步研究其體內(nèi)抑菌活性及明確其有效抑菌活性成分提供了方向，但其具體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及抑菌作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-08-10 修回日期：2018-11-11）

（編輯：林 靜）