欖錢含片對(duì)東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用研究

姜舒 易湘茜 沈關(guān)媛 李瓊 杜正彩 高程海

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）01-0036-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.08

摘 要 目的：研究欖錢含片對(duì)東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用。方法：將小鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性組（鹽酸多奈哌齊片，1.52 mg/kg）和欖錢含片高、中、低劑量組（800、400、200 mg/kg），每組14只。每天1次，連續(xù)灌胃給藥30 d后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿3 mg/kg制備記憶障礙模型。造模后，采用避暗實(shí)驗(yàn)（觀察指標(biāo)為潛伏期、進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)）和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)（觀察指標(biāo)為登臺(tái)時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間）評(píng)價(jià)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，然后檢測(cè)各組小鼠腦組織中乙酰膽堿（Ach）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠潛伏期、穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間及ChAT、Ach、SOD水平顯著縮短或降低（P<0.05或P<0.01），進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)、登臺(tái)時(shí)間及AchE、MDA水平顯著延長(zhǎng)或升高（P<0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性組和欖錢含片各劑量組小鼠潛伏期（除欖錢含片低劑量組）、穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間及ChAT、Ach、SOD水平顯著延長(zhǎng)或升高（P<0.05或P<0.01），進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)（除欖錢含片低劑量組）、登臺(tái)時(shí)間（除欖錢含片低劑量組）及AchE、MDA（除欖錢含片中、低劑量組）水平顯著縮短或降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：欖錢含片可能通過(guò)增加ChAT、Ach、SOD水平及降低AchE、MDA水平改善東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

關(guān)鍵詞 欖錢含片；東莨菪堿；學(xué)習(xí)記憶障礙；小鼠；改善作用

Study on the Improvement Effects of Lanqian Buccal Tablet on Scopolamine-induced Learning and Memory Impairment of Mice

JIANG Shu，YI Xiangxi，SHEN Guanyuan，LI Qiong，DU Zhengcai，GAO Chenghai（School of Pharmacy/Institute of Marine Drugs， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Lanqian buccal tablets on scopolamine-induced learning and memory impairment of mice. METHODS： The mice were randomly divided into blank group （normal saline）， model group （normal saline）， positive group （Donepezil hydrochloride tablets， 1.52 mg/kg） and Lanqian buccal tablets high-dose， medium-dose and low-dose groups （800， 400， 200 mg/kg）， with 14 mice in each group. Once a day， 30 days after continuous intragastric administration， except for blank group， other groups were intraperitioneal injected scopolamine hydrobromide 3 mg/kg to induce learning and memory impairment model. After modeling， the learning and memory ability of mice were evaluated with step through test （latency， mistake times of entering darkroom as indexes） and Morris water maze （the time of going up on the platform， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant as indexes）. The levels of Ach， ChAT， AchE， SOD and MDA in cerebral tissue of mice were determined. RESULTS： Compared with blank group， latency， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant， the levels of ChAT， Ach and SOD were shortened or decreased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）， while mistake times of entering darkroom， the time of going up on the platform， the levels of AchE and MDA were extended or rised significantly （P<0.01）. Compared with model group， latency （except for Lanqian buccal tablet low-dose group）， the times of crossing the platform， swimming time in target quadrant， the levels of ChAT， Ach and SOD were extended or rised significantly in positive group and Lanqian buccal tablet groups （P<0.05 or P<0.01）. The mistake times of entering darkroom （except for Lanqian buccal tablet low-dose group）， the time of going up on the platform （except for Lanqian buccal tablet low-dose group） and the levels of AchE and MDA （except for Lanqian buccal tablet medium-dose and low-dose group） were shortened or decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Lanqian buccal tablet can improve scopolamine-induced learning and memory impairment of mice by increasing the levels of ChAT， Ach and SOD and decreasing the levels of AchE and MDA.

KEYWORDS Lanqian buccal tablets； Scopolamine； Learning and memory impairment； Mice； Improvement effect

白骨壤（Avicennia marina）是馬鞭草科海欖雌屬植物，是世界上分布最廣的一種紅樹林植物[1]，其果實(shí)俗稱欖錢。欖錢味甘、微苦，性涼，具有清熱、利尿、涼血敗火的功效，是藥食兩用的佳品[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，欖錢不僅含有芳香酯和酚苷類化合物，還富含苯乙醇苷類化合物[2-7]。相關(guān)研究表明，苯乙醇苷具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，能改善氧化應(yīng)激后的記憶障礙[8-10]。阿爾茨海默病（AD）是老年人群中發(fā)病率和病死率較高的疾病之一[11]。目前，常采用東莨菪堿誘導(dǎo)失憶動(dòng)物模型進(jìn)行AD認(rèn)知損傷的潛在作用機(jī)制研究[12]。乙酰膽堿（Ach）是腦內(nèi)促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，在腦內(nèi)由乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）催化合成，通過(guò)乙酰膽堿酯酶（AchE）分解，形成Ach的代謝循環(huán)，當(dāng)ChAT活性下降或 AchE 活性增強(qiáng)時(shí)均會(huì)影響腦內(nèi)Ach的水平[13]。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶，其活性降低可提示腦部氧化應(yīng)激損傷，丙二醛（MDA）是一種重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其水平異常增加也與記憶損傷有關(guān)[14]。現(xiàn)階段治療AD的主要用藥為鹽酸多奈哌齊，其作用機(jī)制是可逆性地抑制AchE引起的Ach水解，從而增加Ach含量[15]。目前，市面上還沒有以欖錢為主要原料的輔助改善記憶的產(chǎn)品，因此，筆者以欖錢60%乙醇洗脫后濃縮成的浸膏制成的AD含片，通過(guò)避暗實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及對(duì)小鼠腦組織中膽堿能系統(tǒng)指標(biāo)Ach、ChAT、AchE和抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)SOD、MDA活性的影響，為欖錢改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BP211D萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；YKKYFM40制冰機(jī)（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司）；PGL-16冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Bio-Tek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；BW-MWM101大小鼠通用Morris水迷宮、BW-MPA105避暗儀均購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司。

1.2 藥品與試劑

欖錢藥材于2015年8月采自廣西北海合浦白沙鎮(zhèn)，由廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒定為真品；氫溴酸東莨菪堿注射劑（阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，批號(hào)：P1175427，純度：>99%，規(guī)格：1 mL ∶ 0.3 mg）；鹽酸多奈哌齊片（陜西方舟制藥有限公司，批號(hào)：170701，規(guī)格：5 mg/片）；SOD、MDA、ChAT、AchE、Ach試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：MU30590、MU30447、MU3091、MU30435、MU30372）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠84只，♂，體質(zhì)量（25±2） g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK- （湘）2016-0002。小鼠飼養(yǎng)溫度為25～26 ℃，期間自由進(jìn)食進(jìn)水。

2 方法

2.1 欖錢含片的制備

參考文獻(xiàn)[16]方法，以60%乙醇洗脫部位為有效成分，得到欖錢浸膏（苯乙醇苷的含量為38.22%）；然后以浸膏作為主藥，與預(yù)膠化淀粉等輔料混合制軟材，再經(jīng)干燥、整粒、壓片等工藝得規(guī)格為0.5 g/片的欖錢含片（每片中苯乙醇苷的含量為25%）。

2.2 分組、給藥與造模

將84只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組（鹽酸多奈哌齊片，1.52 mg/kg，根據(jù)成人臨床用量換算而得）和欖錢含片高、中、低劑量組（800、400、200 mg/kg，參考文獻(xiàn)[17]確定給藥劑量），每組14只?？瞻捉M和模型組給予等量的生理鹽水。每天1次，連續(xù)灌胃給藥30 d后，參考文獻(xiàn)[12]方法，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射氫溴酸東莨菪堿3 mg/kg制備學(xué)習(xí)記憶障礙模型，空白組腹腔注射同體積生理鹽水。

2.3 避暗實(shí)驗(yàn)

先將各組小鼠放入避暗箱的明室中，不通電，自由活動(dòng)3 min；再將小鼠趕入暗室，通電（50 V，0.6 mA，下同）刺激小鼠進(jìn)入明室，每只小鼠訓(xùn)練5 min；間隔24 h后將小鼠放入明室并通電，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，小鼠首次到達(dá)暗室的時(shí)間即為潛伏期；進(jìn)入暗室的次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)。記錄每只小鼠潛伏期和2 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)。

2.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[18]方法，將水池分為4個(gè)虛擬象限，并在目標(biāo)象限（第4象限）的中心放置圓形黑色平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)期間其位置保持不變，水迷宮上方安裝攝像機(jī)，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。實(shí)驗(yàn)前5 d進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，將小鼠放至平臺(tái)適應(yīng)環(huán)境20 s后放入水中，小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間即為登臺(tái)時(shí)間。第6 d去掉平臺(tái)，記錄各小鼠90 s內(nèi)經(jīng)過(guò)平臺(tái)的穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間。

2.6 腦組織中相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠禁水禁食，然后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，取腦并稱質(zhì)量，放置于勻漿器中，加入9倍量生理鹽水，勻漿；4 ℃下 3 000 r/min離心15 min，然后取上清液按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書的方法步驟檢測(cè)膽堿能系統(tǒng)指標(biāo)Ach、ChAT、AchE和抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)SOD、MDA的水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以x±s表示，采用單因素方差分析，組間差異比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P<0.05），潛伏期顯著縮短（P<0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性組和欖錢含片高、中劑量組小鼠進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P<0.05），潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.01），欖錢含片低劑量組小鼠進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期無(wú)顯著性差異（P>0.05）。各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.4 腦組織中SOD、MDA水平檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠腦組織中SOD水平顯著降低（P<0.01），MDA水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性組和欖錢含片高、中、低劑量組小鼠腦組織中SOD水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），陽(yáng)性組和欖錢含片高劑量組小鼠腦組織中MDA水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠腦組織中SOD、MDA水平檢測(cè)結(jié)果見表4。

4 討論

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)為經(jīng)典的行為學(xué)檢測(cè)方法，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種對(duì)嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行空間學(xué)習(xí)能力的測(cè)試方法，經(jīng)常被用于神經(jīng)認(rèn)知障礙的嚙齒動(dòng)物模型的驗(yàn)證和神經(jīng)認(rèn)知治療的評(píng)估；避暗實(shí)驗(yàn)是利用小鼠具有趨暗避明的習(xí)性而設(shè)計(jì)的一種實(shí)驗(yàn)方法[18]。本研究結(jié)果顯示，避暗實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加且潛伏期明顯縮短；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中模型組登臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間明顯降低；灌胃欖錢含片后能顯著增加小鼠的穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間，并縮短潛伏期，進(jìn)一步提示欖錢含片可以改善東莨菪堿致小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

膽堿能系統(tǒng)破壞被認(rèn)為是癡呆發(fā)生的重要因素，膽堿能神經(jīng)元的退化會(huì)損害記憶[19]，Ach可以促進(jìn)腦部結(jié)構(gòu)損傷后情景記憶功能的恢復(fù)，且Ach受體是影響神經(jīng)免疫系統(tǒng)功能的關(guān)鍵物質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，欖錢含片可能通過(guò)增加Ach、ChAT水平和降低AchE水平來(lái)改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

氧化應(yīng)激是AD發(fā)展的一個(gè)重要因素，由生物系統(tǒng)中活性氧（ROS）產(chǎn)生和消除之間的不平衡引起；過(guò)量生產(chǎn)ROS會(huì)加速生物大分子的分解，從而使機(jī)體受到氧化損傷；因此，為了保護(hù)細(xì)胞抗ROS引起的氧化損傷，機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶（例如SOD）被激活[21]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，由于氧化應(yīng)激和認(rèn)知功能障礙之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，調(diào)節(jié)ROS的藥物在提高學(xué)習(xí)能力和改善記憶缺陷方面具有顯著的作用[22]。本研究的結(jié)果表明，欖錢含片可降低模型小鼠腦組織中SOD的水平，提示欖錢含片能從氧化應(yīng)激的角度改善AD。

綜上所述，欖錢含片可以改善東莨菪堿致小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其作用機(jī)制可能與增加ChAT、Ach、SOD水平及降低AchE、MDA水平有關(guān)。

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（收稿日期：2018-08-13 修回日期：2018-10-24）

（編輯：唐曉蓮）