基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡龍骨牡蠣湯 治療癲癇的作用機制

朱勇 李亮 吳華英 夏帥帥 李豐 黃惠勇 楊萍

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)等方法研究神經(jīng)遞質(zhì)參與柴胡龍骨牡蠣湯（CLMD）抗癲癇潛在機制。方法 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）預(yù)測、篩選CLMD可能的生物活性成分，并預(yù)測其靶點。利用藥物靶點數(shù)據(jù)庫挖掘癲癇相關(guān)靶點，構(gòu)建CLMD藥效分子-靶點網(wǎng)絡(luò)及CLMD藥效分子-癲癇靶點網(wǎng)絡(luò)，采用ClueGo 分析CLMD治療癲癇可能的分子機制，使用鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型進行相關(guān)機制驗證。結(jié)果 從TCMSP中獲得CLMD中活性成分42個及110個藥效分子靶點基因。利用數(shù)據(jù)庫獲得213個癲癇靶點。CLMD生物活性成分-癲癇靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析，最終得到CLMD治療癲癇的169個關(guān)鍵基因，包括共同靶點11個，分別為：CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4等。通路富集分析顯示，這些重要靶點能夠富集到在癲癇發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的通路上，如GABA-A受體、多巴胺能、谷氨酸能、神經(jīng)遞質(zhì)受體等信號通路。動物實驗驗證，CLMD能提高鋰-匹羅卡品癲癇大鼠GABA水平，降低DA水平，保護海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞。結(jié)論 CLMD治療癲癇具有多系統(tǒng)、多成分、多靶點的特點，特別是調(diào)整神經(jīng)遞質(zhì)代謝水平。

〔關(guān)鍵詞〕 癲癇;柴胡龍骨牡蠣湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子機制;信號通路

〔中圖分類號〕R277.7? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.009

Study on the Mechanism of Chaihu Longgu Muli Decoction in the Treatment of Epilepsy

Based on Network Pharmacology

ZHU Yong1， LI Liang2， WU Huaying2， XIA Shuaishuai2， LI Feng2， HUANG Huiyong2， YANG Ping1*

（1. Neurosurgery Department of Brain Hospital of Hunan Province， Clinical Medical College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study potential mechanism of Chaihu Longgu Muli Decoction （CLMD） in the treatment of epilepsy based on network pharmacology， bioinformatics and other methods. Methods Potential bioactive components of CLMD were screened and predicted through Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and their targets were predicted. By using Therapeutic Target Database （TTD）， epilepsy-related targets were mined. CLMD pharmacodynamic molecule-target network and CLMD pharmacodynamic molecule-epileptic target network were constructed. Possible molecular mechanism of CLMD in the treatment of epilepsy was analyzed through ClueGo. Lithium-pilocarpine epilepsy rat model was used to verify the mechanism. Results A total of 42 bioactive components of CLMD and 110 pharmacodynamic molecular target genes were obtained from TCMSP. A total of 213 epileptic targets were screened out through the database. Through CLMD bioactive component-epileptic target network construction analysis， finally， 169 key genes for CLMD treatment of epilepsy were obtained， including 11 common targets： CHRNA2， CYP1A2， CYP3A4， etc. Pathway enrichment analysis showed that these important targets could be enriched in pathways that played an important role in the development of epilepsy， such as GABA-A receptor， dopaminergic， glutamatergic， neurotransmitter receptor and other signaling pathways. Animal experiments showed that CLMD could increase the level of GABA， decrease the level of DA， and protect neurons in hippocampal CA1 area in rats with epilepsy induced by lithium-pilocarpine. Conclusion CLMD has characteristics of multi-system， multi-component， and multi-target in the treatment of epilepsy， and it can especially regulate neurotransmitter metabolic level.

〔Keywords〕 epilepsy; Chaihu Longgu Muli Decoction; network pharmacology; molecular mechanism; signaling pathway

癲癇是一種常見的、持續(xù)存在的威脅生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球約8 000萬人罹患該病，其特征是持久自發(fā)性癲癇發(fā)作的傾向[1]。研究發(fā)現(xiàn)約30%的患者癲癇發(fā)作仍未得到控制[2]。因此，開發(fā)具有療效好、副作用少的抗癲癇藥物已成研究重點[3]。

現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)中藥柴胡龍骨牡蠣湯（CLMD）治療癲癇具有良好的效果[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CLMD可通過增加SOD，降低MDA，明顯改善顳葉癲癇患者癥狀[5]。但CLMD為復(fù)方制劑，各味中藥中所含成分龐雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制依然不十分明確。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及生物信息學(xué)方法，擬篩選和預(yù)測CLMD治療癲癇的重要活性成分和作用靶點，以及相關(guān)的通路，并建立動物模型進行驗證，探討其抗癲癇的作用機制。

1 材料和方法

1.1? CLMD活性成分篩選

將CLMD所有藥物成分通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺[6]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP）挖掘CLMD所有成分數(shù)據(jù)，根據(jù)成分藥動學(xué)吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)[7]行初步篩選，篩選條件為藥物口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18[8]。

1.2? CLMD作用靶點預(yù)測及生物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

預(yù)測篩選后的CLMD主要生物活性成分的作用靶點，預(yù)測使用TCMSP提供的靶點預(yù)測模型。利用網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件Cytoscape 3.4.0[9]構(gòu)建CLMD主要生物活性成分-靶點之間的作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3? 癲癇疾病相關(guān)靶點檢索

通過TCMSP、DrugBank[10]、TTD[11]、PharmGKB[12]、 GAD[13]等與疾病靶點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，以“Epilepsy”作為關(guān)鍵詞對癲癇相關(guān)靶點進行檢索及挑選，獲得癲癇發(fā)病過程中已知的靶點。

1.4? CLMD抗癲癇的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建藥物直接靶點與其他蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，用于發(fā)掘藥物可能靶點之間的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系。對藥物靶點以及疾病靶點通過蛋白-蛋白相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫String[14]進行互作分析，篩選條件為互作分數(shù)大于700的較強互作關(guān)系。對獲得的兩個互作網(wǎng)絡(luò)抽取交集的靶點網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建CLMD治療癲癇的直接和間接靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5? 基因通路富集分析

通過基因富集分析插件ClueGO[15]對獲得的藥物/疾病直接互作的關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，研究CLMD抗癲癇可能的作用機制（同種類型的信號通路使用同種顏色的節(jié)點，信號通路的顯著程度通過節(jié)點的大小表示）。并對上述靶點進行GO通路富集分析，對P<0.05且排名前十的通路構(gòu)圖并對比分析。

1.6? 動物實驗驗證

30只健康雄性SPF級SD大鼠（許可證編號：SYXK〔湘〕2016-0005）隨機分為對照組，模型組，CLMD低、中、高劑量組，每組6只。除對照組以外均采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型[16]。對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。CLMD低、中、高劑量給予CLMD12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg，ig，1次/d，連續(xù)28 d。將大鼠麻醉（10%水合氯醛500 mg/kg，ip）后，左心室抽取動脈血5 mL進行ELISA檢測血漿γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）（上海哈靈）水平[17];灌注后取腦采用HE染色檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)[18]。ELISA檢測數(shù)據(jù)以“x±s”表示，利用SPSS 24.0軟件，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較用LSD-T 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? CLMD生物活性成分篩選與ADME 分析

本研究在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索到CLMD成分637個，根據(jù)DL和OB參數(shù)從中挑選，獲得58個CLMD的主要生物活性成分。CLMD及其活性成分見圖1。利用TCMSP提供的藥物成分靶點數(shù)據(jù)挑選出42個有對應(yīng)靶點的活性成分。

2.2? CLMD作用靶點預(yù)測及生物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

預(yù)測上述得到的42個生物活性成分的作用靶點，排除重復(fù)靶點后獲得110個成分作用靶點。利用Cytoscape 3.4.0繪制CLMD主要生物活性成分-靶點之間的作用網(wǎng)絡(luò)。共獲得619對生物活性成分與對應(yīng)作用靶點，其中基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2），絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinases14，MAPK14），TP53等靶點也能與多個成分形成作用關(guān)系。見圖2。

2.3? 癲癇相關(guān)靶點檢索

通過檢索疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，獲得與癲癇發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的靶點基因共213個，其中TCMSP、PharmGK、TTD、DrugBank、GAD數(shù)據(jù)庫分別檢索到11、34、23、88、122個靶點。

2.4? CLMD治療癲癇的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

利用數(shù)據(jù)庫String對癲癇相關(guān)的靶點基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，213個靶點基因中有184個與12 536個靶點之間有相互作用，這些靶點基因與其他靶點之間的相互作用關(guān)系多達115 864個。從中篩選了互作分數(shù)大于700的PPI。最終獲得183個疾病相關(guān)靶點與其他2 374個靶點之間的相互作用關(guān)系9 736個。

對CLMD活性成分的作用靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可知，在110個藥物靶點基因中有97個與12 841個靶點之間有相互作用，這種作用關(guān)系達135 163個。篩選互作分數(shù)大于700之后，獲得3 578個互作靶點，相互作用關(guān)系達11 623個。

將癲癇靶點網(wǎng)絡(luò)和CLMD活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，作用靶點取交集后構(gòu)建CLMD活性成分-癲癇相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中有1601個節(jié)點，相互作用關(guān)系13 919個。我們從中篩選出CLMD活性成分靶點和癲癇靶點基因之間有直接相互作用的網(wǎng)絡(luò)，得到169個靶點（包括110個癲癇相關(guān)靶點，70個藥物作用靶點，共同靶點11個，即CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4、GABRA1、GRIA2、GSTM1、IL1B、MAOA、MAOB、OPRM1、SLC6A4）之間的相互作用關(guān)系410個。篩選策略圖見圖3。

2.5? CLMD治療癲癇的機制分析

利用ClueGO對上一步篩選得到的169個關(guān)鍵靶點基因做KEGG以及GO通路富集分析，KEGG通路富集結(jié)果顯示，CLMD治療癲癇的關(guān)鍵靶點主要與尼古丁成癮、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥、藥物代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等53條相關(guān)信號通路（圖4）。GO分子功能通路富集分析顯示這些重要靶點主要分布在一些神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道相關(guān)的通路，而細胞組分通路富集結(jié)果顯示它們主要分布在與膜、突觸、通道復(fù)合物等相關(guān)的通路中（圖5）。

2.6? 各組大鼠血漿GABA、DA測定

與對照組相比，模型組血漿中GABA顯著降低、DA顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，CLMD低、中、高劑量組GABA升高，CLMD高劑量組DA降低（P<0.05或P<0.01）;與CLMD高劑量組相比，CLMD低、中劑量組GABA水平顯著升高，DA降低（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.7? 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)情況比較

對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整;模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列疏松，出現(xiàn)細胞腫脹，伴有不同程度的細胞固縮;CLMD各劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)明顯改善，尤其是CLMD高劑量組（圖6）。

3 討論

癲癇屬中醫(yī)學(xué)“癇病”范疇，病因主要責(zé)之于痰，明·樓英《醫(yī)學(xué)綱目·癲癇》云“癲癇者，痰邪逆上也”，痰邪貫穿疾病始終，故有“無痰不作癇”之說。治療上當(dāng)以滌痰開竅，鎮(zhèn)驚安神為主。柴胡加龍骨牡蠣湯（CLMD）出自漢·張仲景《傷寒論》第107條，是柴胡證中和解法的代表方劑之一，具有和解痰瘀，泄熱安神之功。本方柴胡、黃芩主入肝膽清其胸脅之熱，半夏、生姜、茯苓降逆氣化痰濁，桂枝、人參、大棗升中土歸化萬物，龍骨、牡蠣、鉛丹鎮(zhèn)驚安神，大黃下其瘀熱。故清·徐靈胎《傷寒論類方》言：“本方能下肝膽之驚痰，以之治癲癇必效。”

本研究通過初步篩選獲得了62個CLMD的主要生物活性成分，并在此基礎(chǔ)上利用最終得到的42個生物活性成分，繼而挖掘出110個靶點基因以及相互作用關(guān)系619個。生物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析顯示，CLMD能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點， MMP2、MAPK14、TP53等靶點也能與多個成分形成作用關(guān)系。然后通過CLMD生物活性成分-癲癇靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析，得到CLMD治療癲癇的169個關(guān)鍵基因（共同靶點11個，即CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4、GABRA1、GRIA2、GSTM1、IL1B、MAOA、MAOB、OPRM1、SLC6A4）。因此，CLMD有效成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關(guān)系，而且其作用的靶點也在癲癇疾病進程中發(fā)揮著重要作用。

通路富集結(jié)果顯示，CLMD主要通過影響尼古丁成癮、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥、藥物代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)通路而發(fā)揮治療癲癇作用。GO分析發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸（GABA）-A受體活性、電壓門控鈣通道、多巴胺能、谷氨酸能等。（1）GABA是一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，GABA-A受體與癲癇關(guān)系最密切，多項實驗證實興奮GABA-A受體能抑制癲癇發(fā)作，抑制GABA-A受體則會誘發(fā)癲癇[20]。（2）電壓門控鈣通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其中L型鈣通道可能與癲癇的發(fā)生有密切的關(guān)系，其阻斷劑維拉帕米通過提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣聯(lián)結(jié)蛋白的轉(zhuǎn)運和組裝能力來大幅增強GABA-A受體的α亞基的表達[21]。（3）多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之一， 其中D1類受體可增強興奮性氨基酸神經(jīng)毒性，降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)濃度。同時，可能通過增加Ca2+，從而動作電位后出現(xiàn)持續(xù)性去極化狀態(tài)，加強癲癇活動[22]。（4）谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，其中NMDA受體可直接與離子通道相耦聯(lián)，與興奮性氨基酸結(jié)合后，引起Ca2+和Na+內(nèi)流，誘發(fā)腦內(nèi)的異常電活動[22]。目前研究證實，癲癇患者的重要病理學(xué)改變?yōu)楹ｑR硬化，主要表現(xiàn)為海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失和膠質(zhì)增生并伴有齒狀回顆粒細胞軸突的出芽、神經(jīng)發(fā)生以及炎癥反應(yīng)[23]。本研究動物實驗發(fā)現(xiàn)鋰-匹羅卡品癲癇大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞固縮，而CLMD可改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)、增加GABA、降低DA，從而保護海馬區(qū)神經(jīng)元細胞。

綜上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)分析及實驗驗證揭示出CLMD可能通過神經(jīng)遞質(zhì)與離子通道發(fā)揮抗癲癇機制，為后續(xù)研究及實驗提供重要的理論依據(jù)，也為藥物作用機制研究和藥物研發(fā)提供了新思路和新方法。

參考文獻

[1] HWANG G， DABBS K， CONANT L， et al. Cognitive slowing and its underlying neurobiology in temporal lobe epilepsy[J]. Cortex，2019，117：41-52.

[2] GUR-OZMEN S， MULA M， AGRAWAL N， et al. The effect of depression and side effects of antiepileptic drugs on injuries in patients with epilepsy[J]. European Journal of Neurology， 2017， 24（9）：1135-1139.

[3] ADAMS J， ALIPIO-JOCSON V， INOYAMA K， et al. Methylphenidate， cognition， and epilepsy： A 1-month open-label trial[J]. Epilepsia，2017，58（12）：2124-2132.

[4] 盧化平.柴胡加龍骨牡蠣湯治療癲癇50例[J].四川中醫(yī)，1998，16（7）：36.

[5] 肖慧瓊，楊? 萍，彭紅莉.柴胡加龍骨牡蠣湯對顳葉癲癇患者SOD、MDA的影響[J].中國醫(yī)師雜志，2018，20（3）：357-359，363.

[6] LI Y， ZHANG J， ZHANG L， et al. Systems pharmacology to decipher the combinational anti-migraine effects of Tianshu formula[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2015， 174：45-56.

[7] LIU H， WANG J， ZHOU W， et al. Systems approaches and polypharmacology for drug discovery from herbal medicines： An example using licorice[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2013，146（3）：773-793.

[8] LI J， ZHAO P， LI Y， et al. Systems pharmacology-based dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chronic obstructive pulmonary disease[J]. Scientific Reports， 2015， 5：15290.

[9] SHANNON P， MARKIEL A， OZIER O， et al. Cytoscape： A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Research， 2003， 13（11）：2498-2504.

[10] WISHART D S， KNOX C， GUO A C， et al. DrugBank： a knowledgebase for drugs， drug actions and drug targets[J]. Nucleic Acids Research， 2008， 36（DI）： D901-906.

[11] LIU X， ZHU F， MA X， et al.The Therapeutic Target Database： an Internet resource for the primary targets of approved， clinical trial and experimental drugs[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets， 2011，15（8）：903-912.

[12] MA Q， LU A Y. Pharmacogenetics， Pharmacogenomics， and Individualized Medicine[J]. Pharmacol Reviews， 2011， 63（2）：437-459.

[13] BECKER K G， BARNES K C， BRIGHT T J， et al. The Genetic Association Database[J]. Nature Genetics， 2004，36（5）：431-432.

[14] SZKLARCZYK D， FRANCESCHINI A， WYDER S， et al. STRING v10： protein-protein interaction networks， integrated over the tree of life[J]. Nucleic Acids Research，2015，43（DI）：D447-452.

[15] BINDEA G， MLECNIK B， HACKL H， et al. ClueGO： a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks[J]. Bioinformatics， 2009， 25（8）：1091-1093.

[16] BRANDT C， BANKSTAHL M， T？魻LLNER K， et al. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy： Marked intrastrain differences in female Sprague-Dawley rats and the effect of estrous cycle[J]. Epilepsy Behavior，2016，61：141-152.

[17] HOLTMAN L， VAN VLIET EA， ARONICA E， et al. Blood plasma inflammation markers during epileptogenesis in post-status epilepticus rat model for temporal lobe epilepsy[J]. Epilepsia， 2013， 54（4）：589-595.

[18] XIE H， ZHAO Y， ZHOU Y， et al. MiR-9 Regulates the Expression of BACE1 in Dementia Induced by Chronic Brain Hypoperfusion in Rats[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2017，42（3）：1213-1226.

[19] BHAT M A， GURU S A， MIR R， et al. Association of GABAA Receptor Gene with Epilepsy Syndromes[J]. Journal of Molecular Neuroscience，2018，65（2）：141-153.

[20] HAN D Y， GUAN B J， WANG Y J， et al. L-type Calcium Channel Blockers Enhance Trafficking and Function of Epilepsy-associated α1（D219N） Subunits of GABA（A） Receptors[J]. ACS Chemical Biology， 2015， 10（9）：2135-2148.

[21] LOUCKS C M， PARK K， WALKER D S， et al. EFHC1， implicated in juvenile myoclonic epilepsy， functions at the cilium and synapse to modulate dopamine signaling[J]. Elife， 2019， 8： e37271.

[22] MARWICK K F M， HANSEN K B， SKEHEL P A， et al. Functional assessment of triheteromeric NMDA receptors containing a human variant associated with epilepsy[J]. Journal of Physiology， 2019， 597（6）：1691-1704.

[23] MENG X F， TAN L， TAN M S， et al. Inhibition of the NLRP3 inflammasome provides neuroprotection in rats following amygdala kindling-induced status epilepticus[J]. Journal of Neuroinflammation， 2014， 11（1）： 212.