基于p38 MAPK信號(hào)通路研究養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療 干眼兔的作用機(jī)制

李玲 李點(diǎn) 李玲 袁娉 黃家望

〔摘要〕 目的 探討基于p38 MAPK信號(hào)通路研究養(yǎng)陰潤(rùn)目丸治療干眼兔的作用機(jī)制。方法 采用氫溴酸東莨菪堿皮下注射途徑制備干眼兔模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、p38抑制劑組、陽性藥物（杞菊地黃丸）組和低、中、高劑量養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組，同步設(shè)不造模的正常組，6只/組。各組按相應(yīng)處理方式連續(xù)干預(yù)2周后，檢測(cè)各組兔淚液分泌量、淚腺病理形態(tài)、淚腺組織凋亡細(xì)胞的表達(dá)及淚腺組織中p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組和陽性藥物組能增加干眼兔模型淚液分泌量，抑制淚腺細(xì)胞的凋亡，下調(diào)p38 MAPK、Bax的蛋白和mRNA表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸能夠通過糾正Bax/Bcl-2失衡，改善干眼淚腺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕淚腺細(xì)胞損傷，恢復(fù)淚腺細(xì)胞的代謝功能，與調(diào)控p38 MAPK的關(guān)系極為密切，這可能是其治療干眼的重要機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 干眼;養(yǎng)陰潤(rùn)目丸;淚腺;細(xì)胞凋亡;p38 MAPK

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R777? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.004

Study on the Mechanism of Yangyin Runmu Pills in the Treatment of Rabbit with

Dry Eye Based on p38 MAPK Signaling Pathway

LI Ling1， LI Dian2*， LI Ling3， YUAN Ping1， HUANG Jiawang1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Jiangmen Wuyi Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiangmen， Guangdong 529000， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Yangyin Runmu Pills in the treatment of rabbit model with dry eye based on p38 MAPK signaling pathway. Methods Dry eye rabbit models were established by subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide. According to random number table method， they were divided into model group， p38 inhibitor group， positive medicine （Qiju Dihuang Pills） group， low， medium and high dose Yangyin Runmu Pills groups， and normal group without modeling， 6 rabbits/group. After 2 weeks of continuous intervention， lacrimal secretion volume， pathological morphology of lacrimal gland， expression of apoptotic cells in lacrimal gland tissue， as well as expressions of p38 MAPK， Bax and Bcl-2 protein and mRNA in lacrimal gland tissue were detected. Results In the Yangyin Runmu Pills groups and the positive medicine group， the lacrimal secretion volume was increased， the apoptosis of lacrimal gland cells was inhibited， the expressions of p38 MAPK， Bax protein and mRNA were down-regulated， and the expression levels of Bcl-2 protein and mRNA were up-regulated， which were significantly different from those in the model group （P<0.05）. Conclusion Yangyin Runmu Pills can improve the apoptosis of dry eye lacrimal gland cells by correcting the imbalance of Bax/Bcl-2， thereby alleviating the damage of lacrimal gland cells and restoring the metabolic function of lacrimal gland cells， and it is closely related to the regulation of p38 MAPK， which may be one of the important mechanisms in the treatment of dry eye.

〔Keywords〕 dry eye; Yangyin Runmu Pills; lacrimal gland; cell apoptosis; p38 MAPK

干眼是指任何原因造成的一種淚液（質(zhì)或量異常）和眼表疾病，包括眼表不適癥狀，視力變化和淚膜不穩(wěn)定，并伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應(yīng)為特征的多種疾病的總稱[1]，這種損傷日久則可造成角結(jié)膜病變，并會(huì)影響視力，嚴(yán)重干眼可引起視力明顯下降從而影響患者正常的工作和生活，甚至導(dǎo)致失明。隨著現(xiàn)代生活使用電腦、電視、游戲機(jī)等終端屏幕的普及，環(huán)境中煙塵等顆粒物的污染，年齡、激素水平的影響，眼部創(chuàng)傷史、用藥史及手術(shù)史，以及因年齡、性激素水平和自身免疫性疾病等因素引起的眼局部病變，使干眼的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[2]。

本課題組多年臨床實(shí)踐治療干眼的經(jīng)驗(yàn)方養(yǎng)陰潤(rùn)目丸已成為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑[3-5]。本項(xiàng)目在前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過養(yǎng)陰潤(rùn)目丸干預(yù)氫溴酸東莨菪堿皮下注射途徑建立的淚液缺乏性干眼兔模型，檢測(cè)p38 MAPK蛋白和基因的表達(dá)特點(diǎn)及與淚腺細(xì)胞凋亡的規(guī)律，從新的視角闡釋干眼發(fā)病、發(fā)展的可能機(jī)制以及養(yǎng)陰潤(rùn)目丸的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 主要儀器

Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek）;IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀，Western blot系統(tǒng)，ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.2? 藥品及主要試劑

養(yǎng)陰潤(rùn)目丸是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科治療干眼的院內(nèi)制劑，規(guī)格為1 g丸劑相當(dāng)于 8.4 g生藥;杞菊地黃丸（九芝堂股份有限公司，201505001）;氫溴酸東莨菪堿注射液（成都第一藥業(yè)，H51022122，

10 mg/支）;p38 MAPK抑制劑SB203580（selleck，S1076）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500）、qPCR mix（A6001），均來自美國promega;p38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin引物（生工）;Trizon Reagent（CW0580）、RIPA蛋白裂解液（CW2334S）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（CW0014S）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（CW0022）、彩色預(yù)染蛋白marker（CW2307M）、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒（CW0048M），均來自江蘇康為世紀(jì)公司;Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（bs-8004-10）、p38 MAPK（bs-5476R）、Bax（bs-20386R）、Bcl-2（bs-4563R）、β-actin（bs-0061R），均來自北京BIOSS公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（SA00001-1）、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（SA00001-2）均來自美國Proteintech。

1.3? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康普通級(jí)新西蘭兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由湖南景萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供飼養(yǎng)條件，在自由飲食、光/暗周期為 12 h/12 h（光照時(shí)間為6：00-18：00）、背景噪音為（40±10） db、溫度（20±3） ℃的條件下飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 動(dòng)物分組和藥物干預(yù)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將70只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成7組，10只/組，分別為正常組，模型組、p38抑制劑組、陽性藥物組和養(yǎng)陰潤(rùn)目低、中、高劑量組（簡(jiǎn)稱養(yǎng)潤(rùn)低、中、高劑組）。除正常對(duì)照組外，各實(shí)驗(yàn)兔均參照劉雪[6]的水液缺乏型干眼模型制作，通過氫溴酸東莨菪堿皮下注射4次/d，劑量2.0 mg/kg，持續(xù)28 d。干眼模型建立后，p38抑制劑組給予p38通路抑制劑SB203580皮下注射0.1 mg/（kg·d），陽性藥物組給予杞菊地黃丸0.782 g/（kg·d）灌胃，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸低、中、高劑量組分別給予0.782、0.869、1.738 g/（kg·d）灌胃，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥2周后，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.2? 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1? Schirmer試驗(yàn)檢測(cè)淚液分泌量? 根據(jù)Tsutomu Fujihara報(bào)道[7]采用改良的Schirmer試驗(yàn)，將試紙前段5 mm反折于兔下眼瞼顳側(cè)結(jié)膜囊，其余部分懸垂于皮膚表面，檢測(cè)記錄5 min后試紙淚液浸濕長(zhǎng)度（不包括反折部分的長(zhǎng)度），記為基礎(chǔ)淚腺分泌試驗(yàn)（Schirmer i test，SIT）長(zhǎng)度。

2.2.2? HE法檢測(cè)淚腺組織病理變化? 分離淚腺組織，4%多聚甲醛中固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察淚腺的病理學(xué)改變并拍照。

2.2.3? Tunel法檢測(cè)淚腺組織細(xì)胞凋亡情況? 取病理形態(tài)檢測(cè)用蠟塊切片，常規(guī)脫蠟，Tunel法檢測(cè)淚腺組織細(xì)胞凋亡情況，Motic B5顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行攝像。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)各組5～7個(gè)高倍視野（×400倍）中的凋亡細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算每高倍視野下的平均凋亡細(xì)胞數(shù)。

2.2.4? Western-blot法檢測(cè)淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 取兔淚腺組織于勻漿器中，剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）進(jìn)行勻漿，冰上30 min后4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度;取50 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉處理1 h，加入一抗p38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000），孵育過夜，二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，暗室加ECL化學(xué)發(fā)光劑于化學(xué)發(fā)光儀成像，用圖像分析軟件Image Lab 5.0對(duì)圖像進(jìn)行信號(hào)分析，并計(jì)算目的蛋白/β-actin蛋白的比值。

2.2.5? Real-time PCR法檢測(cè)淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2基因的表達(dá)? 取兔淚腺組織Trizol法提取各組淚腺組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)操作均按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，首先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)性者，不同組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并用LSD法進(jìn)行組間的多重比較;不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。先用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較總的差異，再用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼癥兔模型淚液分泌量的影響

Schirmer試驗(yàn)結(jié)果顯示：干眼癥兔模型的淚眼分泌明顯減少，與正常組比較，模型組SIT值降低至正常組的50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），符合干眼癥造模標(biāo)準(zhǔn)。各干預(yù)組兔的淚眼分泌均有不同程度的增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）。其中養(yǎng)陰潤(rùn)目丸呈正相關(guān)量效關(guān)系趨勢(shì)，各干預(yù)組組間無差異，見圖1。

3.2? 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼癥兔模型淚腺組織病理變化的影響

HE病理結(jié)果顯示：正常淚腺腺泡大小均勻，結(jié)構(gòu)清楚，腺泡內(nèi)層為柱狀上皮細(xì)胞，可見微絨毛排列有序，胞漿豐富，細(xì)胞排列緊密，腺體間質(zhì)偶見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組中所示淚腺腺泡內(nèi)柱狀上皮細(xì)胞萎縮，排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)減少，微絨毛稀疏，腺細(xì)胞代謝功能減弱。各干預(yù)組兔淚腺形態(tài)結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善。見圖2。

3.3? 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼癥兔模型淚腺組織細(xì)胞凋亡的影響

Tunel檢測(cè)結(jié)果顯示：正常兔淚腺細(xì)胞存在局灶性、程度輕的凋亡。模型組淚腺腺泡上皮細(xì)胞中均可見大量散在的陽性凋亡細(xì)胞，呈棕黃色。各干預(yù)組兔淚腺細(xì)胞凋亡情況均有不同程度的改善。見圖3。

3.4? 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼癥兔模型淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：正常兔淚腺p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)呈低表達(dá)，Bcl-2蛋白呈高表達(dá)，模型組淚腺組織中p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡，與空白組比較，差異顯著（P<0.01）。藥物干預(yù)后各組兔淚腺組織中p38 MAPK和Bax蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)不同程度上調(diào)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中養(yǎng)陰潤(rùn)目丸呈正相關(guān)量效關(guān)系趨勢(shì)，各干預(yù)組間無差異。見圖4、圖5。

3.5? 養(yǎng)陰潤(rùn)目丸對(duì)干眼癥兔模型淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：正常兔淚腺p38 MAPK和Bax mRNA表達(dá)呈低表達(dá)，Bcl-2蛋白呈高表達(dá)，模型組淚腺組織中p38 MAPK和Bax mRNA表達(dá)顯著升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡，與空白組比較，差異顯著（P<0.01）。藥物干預(yù)后各組兔淚腺組織中p38 MAPK和Bax mRNA表達(dá)不同程度下調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)不同程度上調(diào)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中養(yǎng)陰潤(rùn)目丸呈正相關(guān)量效關(guān)系趨勢(shì)，各干預(yù)組間無差異。見圖6-8。

4 討論

目前我國干眼患者在3億以上，女性多于男性，年齡在30～40歲人群中干眼的患病率超過20%，70歲以上人群患病率則高達(dá)36.1%[8]。因此，加強(qiáng)對(duì)干眼的基礎(chǔ)研究和防治工作顯得尤為迫切和重要。淚膜和眼表組織構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，各種刺激如瞬目異常、應(yīng)激反應(yīng)、激素失衡和神經(jīng)機(jī)能障礙等均可損傷眼表正常的修復(fù)和/（或）防御機(jī)制，導(dǎo)致淚腺和眼表組織處于一種慢性炎癥狀態(tài)[9-11]。各類炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞炎性因子的釋放，可通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信息傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)淚腺細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、形態(tài)及功能產(chǎn)生影響，而p38 MAPK可由細(xì)胞外多種刺激包括炎性因子、應(yīng)激反應(yīng)、活性氧等活化，參與細(xì)胞的凋亡調(diào)控過程[12-14]。目前已有大量研究證實(shí)[15-16]，多數(shù)細(xì)胞炎性因子在干眼發(fā)病過程中表達(dá)明顯增強(qiáng)，這些炎性因子的表達(dá)與釋放與p38 MAPK通路的激活密切相關(guān)。我們的前期研究結(jié)果也表明p38 MAPK能上調(diào)細(xì)胞炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)，促進(jìn)淚腺細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致淚腺功能障礙，淚液分泌減少?；罨难仔砸蜃涌勺饔糜趐38 MAPK信號(hào)通路進(jìn)而進(jìn)一步使自身表達(dá)升高，從而加速眼表組織細(xì)胞凋亡進(jìn)程。上述研究結(jié)論和前期研究結(jié)果提示可通過干預(yù)以p38 MAPK為核心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制干眼狀態(tài)下的炎性信號(hào)向細(xì)胞凋亡進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。

干眼在中醫(yī)學(xué)中屬“白澀癥”范疇，又名“干澀昏花癥”“神水將枯癥”，其病機(jī)大多以肝腎不足，津液虧虛，目失潤(rùn)養(yǎng)為主[19]。故我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，提出從“肝主淚”學(xué)說來探討干眼的防治方法，而“肝主淚”理論認(rèn)為補(bǔ)養(yǎng)肝腎，則津液充沛，入目為淚，故臨床應(yīng)以“補(bǔ)養(yǎng)肝腎”為中醫(yī)藥治療干眼的基本策略。養(yǎng)陰潤(rùn)目丸正秉承“肝主淚”基本理論，是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科治療干眼的院內(nèi)制劑，已在臨床安全、有效地使用多年，臨床觀察表明養(yǎng)陰潤(rùn)目丸能有效改善眼表癥狀，消、減角膜染色，增加淚液分泌量。

本研究通過兔皮下注射氫溴酸東莨菪堿的途徑，建立淚液缺乏性干眼模型，在此模型上施加p38抑制劑、陽性藥物杞菊地黃丸和低、中、高劑量養(yǎng)陰潤(rùn)目丸干預(yù)因素，對(duì)各組淚液分泌量，淚腺病理形態(tài)，淚腺組織凋亡細(xì)胞的表達(dá)、淚腺組織中p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白和基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)和分析。研究結(jié)果表明：干眼兔模型淚液分泌量明顯減少，病理形態(tài)顯示上皮細(xì)胞萎縮，排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)減少，微絨毛稀疏，淚腺細(xì)胞的凋亡細(xì)胞顯著高于正常組，p38 MAPK和Bax的蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高，Bcl-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡。而各干預(yù)組能不同程度改善淚腺細(xì)胞損傷，其中養(yǎng)陰潤(rùn)目丸組的干預(yù)效果呈劑量相關(guān)性（正相關(guān)）趨勢(shì)。

綜上所述，養(yǎng)陰潤(rùn)目丸可能通過糾正Bax/Bcl-2失衡，改善干眼淚腺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕淚腺細(xì)胞損傷，恢復(fù)淚腺細(xì)胞的代謝功能，且與調(diào)控p38 MAPK的關(guān)系極為密切，這可能是其治療干眼的重要機(jī)制之一，并為中醫(yī)學(xué)“肝主淚”理論治療干眼的作用提供新的認(rèn)識(shí)。對(duì)于中醫(yī)藥探索干眼本質(zhì)特征，以及有效理、法、方劑的提出具有重要的意義。

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