肝片吸蟲CatB4蛋白分子特征及其免疫原性分析

王熙鳳 孟慶玲 喬軍 張凱 張國武

摘要：【目的】明確肝片吸蟲組織蛋白酶B4（CatB4）的分子特征及其免疫原性，為研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及揭示其致病機理提供科學依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^RT-PCR擴增肝片吸蟲CatB4基因，利用在線分子生物信息學軟件對CatB4基因及其編碼蛋白進行分子特征分析;構(gòu)建原核表達載體pET-CatB4，經(jīng)IPTG誘導獲得融合蛋白后進行SDS-PAGE和Western blotting檢測分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制備多克隆抗體，利用免疫組化對融合蛋白在肝片吸蟲體內(nèi)的表達進行定位分析。【結(jié)果】肝片吸蟲CatB4基因片段為699 bp，其編碼蛋白等電點（pI）7.95，理論分子質(zhì)量25.89 kD，無信號肽和跨膜區(qū)，屬于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10個潛在的磷酸化位點、2個N-糖基化位點和 7個N-肉豆蔻?；稽c，有9個抗原決定簇，具有高度保守的CatB結(jié)構(gòu)域，是由無規(guī)則卷曲連接9個α-螺旋和8個β-折疊構(gòu)成其空間結(jié)構(gòu)。基于CatB4基因核苷酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，肝片吸蟲和大片吸蟲聚為一支，二者的同源性為83.98%。SDS-PAGE檢測和Western blotting分析結(jié)果均顯示在41.80 kD處能檢測到目的條帶。以純化融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫的小鼠均可產(chǎn)生特異性抗體，證實融合蛋白CatB4具有較強的免疫原性;免疫組化定位分析結(jié)果顯示，在肝片吸蟲的卵黃腺腺體細胞、排泄管上皮細胞、腸道上皮細胞和卵黃腺管上皮細胞均發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，呈深棕色。【結(jié)論】誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可特異性識別綿羊肝片吸蟲陽性血清，具有較強的免疫原性，且主要在肝片吸蟲分泌排泄組織器官中表達，說明CatB4蛋白具有作為肝片吸蟲候選抗原的潛力。

關(guān)鍵詞： 肝片吸蟲;組織蛋白酶B4（CatB4）;原核表達;免疫原性

中圖分類號： S852.735? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0158-07

0 引言

【研究意義】片形吸蟲病是一種在全球范圍內(nèi)廣泛分布的人獸共患寄生蟲?。∕as-Coma et al.，2009），主要由肝片吸蟲（Fasciola hepatica）、大片吸蟲（F. gigantica）及其中間型引起，不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失，還威脅人類健康（何山紅等，2010;Ashrafi et al.，2015）。其中，肝片吸蟲主要分布在溫帶地區(qū)，需要中間宿主淡水螺才能完成其生活史，家畜常因在放牧過程中吞食含囊蚴的牧草而被感染（王熙鳳等，2018）。肝片吸蟲病在我國四川、新疆、青海、黑龍江和云南等地區(qū)廣泛流行，草食動物（牛、羊）的感染率可高達80%，是對我國畜牧業(yè)危害最嚴重的寄生蟲?。ɡ枞f奎等，2003）。因此，加強肝片吸蟲致病機理研究及其疫苗開發(fā)，對有效防控肝片吸蟲病和促進畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】肝片吸蟲在宿主體內(nèi)移行過程中會產(chǎn)生大量排泄分泌產(chǎn)物（Excretory-srcretory pro-duct，ESP），ESP主要由肝片吸蟲的盲腸分泌，經(jīng)口或體表排出。按照其功能，ESP主要分為能量代謝相關(guān)蛋白、應(yīng)激相關(guān)蛋白和蛋白水解酶（田艾靈等，2017）。組織蛋白酶（Cathepsin，Cat）是蛋白水解酶中的一種，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，占ESP總量的80%，包含組織蛋白酶L（CatL）和組織蛋白酶B（CatB）兩個亞型（Robinson et al.，2008），且二者在肝片吸蟲感染過程中起協(xié)同作用。其中，CatL在肝片吸蟲各發(fā)育階段均可分泌，而CatB主要在童蟲階段表達分泌。肝片吸蟲囊蚴脫囊后高度表達的CatB有3種（CatB1、CatB2和CatB3），但也有部分蛋白可在成蟲階段大量表達，如CatB4、CatB6、CatB7、CatB8、CatB9和CatB10（Cancela et al.，2008;Cwiklinski et al.，2015）。CatB主要存在于肝片吸蟲的體表，可與宿主免疫系統(tǒng)直接接觸而破壞其免疫功能，實現(xiàn)免疫逃避，同時參與囊蚴的脫囊過程（Beckham et al.，2009）。因此，CatB在肝片吸蟲的成熟、入侵、移行和寄生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Robinson等（2009）對肝片吸蟲的蛋白組學進行研究，結(jié)果在新脫囊幼蟲期檢測到CatB4;Cwiklinski等（2015）對肝片吸蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)CatB家族只有1個亞型，但可表達7種不同的蛋白，其中CatB4蛋白在肝片吸蟲各生長階段均可表達，以成蟲階段的特異表達量最高。【本研究切入點】CatB4具有半胱氨酸肽酶活性位點，起到調(diào)節(jié)催化活性的作用，主要在肝片吸蟲成蟲期分泌表達（Meemon and Sobhon，2015），但目前未對CatB4進行任何分子及生物學方面的研究，其致病機理也尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆及原核表達，制備抗肝片吸蟲CatB4多克隆抗體，并利用免疫組化對CatB4蛋白在肝片吸蟲體內(nèi)的表達進行定位分析，為研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及揭示其致病機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

肝片吸蟲陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈提供，肝片吸蟲成蟲采自新疆烏魯木齊市活畜屠宰場綿羊的肝臟;4～6周昆明系小鼠購自石河子大學實驗動物中心;pET-32a（+）質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細胞由石河子大學寄生蟲實驗室保存提供;限制性核酸內(nèi)切酶（BamH I和Xho I）、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、IPTG和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;PCR Mixture購自廣州東盛生物科技有限公司;DNA Marker、蛋白分子量標準和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;HRP標記的兔抗綿羊IgG和NC膜購自北京康為世紀生物科技有限公司;枸櫞酸緩沖液和蘇木素購自上海索萊寶生物科技有限公司;綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒購自上海北諾生物科技有限公司。

1. 2 肝片吸蟲CatB4基因RT-PCR擴增

根據(jù)GenBank中的肝片吸蟲CatB4基因序列（登錄號KM099340.1，cDNA長1020 bp，編碼339個氨基酸），利用ABCpred和DNASTAR等在線軟件分析CatB4基因的優(yōu)勢抗原表位，選擇編碼親水性較強、優(yōu)勢抗原表位集中的區(qū)域（255～954 bp）設(shè)計一對特異性引物用于擴增CatB4基因，引物由華大基因生物科技有限公司合成，預(yù)期擴增長度699 bp。上游引物：5'-CGGGATCCATGCCGGAGTCTTTTGAT-3'（下劃線部分為BamH I酶切位點），下游引物：5'-CCCT

CGAGTCAAAAGTATCCATTCTCACC-3'（下劃線部分為Xho I酶切位點）。參照TRIzol法提取肝片吸蟲總RNA（李曉娟，2009），采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用上、下游引物擴增CatB4基因。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板2.0 μL，PCR Mixture 9.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸l0 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收目的片段連接至pMD19-T載體，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定篩選出陽性質(zhì)粒，并送至新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-CatB4。

1. 3 肝片吸蟲CatB4基因及其編碼蛋白分子特征分析

采用DNAMAN和DNASTAR對CatB4基因測序結(jié)果進行分析;利用ProtPram預(yù)測CatB4蛋白的理化性質(zhì)、ProtScal分析蛋白的親/疏水性、SignalP分析有無信號肽、TMHMM-2.0預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)、Motif Scan預(yù)測蛋白潛在的糖基化位點、Antigen Prediction Tool預(yù)測其抗原決定簇、CDS分析其結(jié)構(gòu)域、SOPMA和Swiss-model預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu);并以MEGA 5.0對肝片吸蟲CatB4基因進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析。

1. 4 原核表達載體pET-CatB4構(gòu)建

將pMD-CatB4質(zhì)粒和pET-32a（+）載體分別用BamH I/Xho I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的片段并與T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR和BamH I/Xho I雙酶切鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-CatB4。

1. 5 融合蛋白CatB4誘導表達、純化及鑒定

以重組質(zhì)粒pET-CatB4轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，通過菌液PCR篩選出陽性菌接種至含氨芐青霉素（Amp+）的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至OD600 nm達0.6～0.8時，以IPTG（終濃度1.0 mmol/L）誘導2、4、6和8 h后，分別收集1.0 mL菌液，12000 r/min離心2 min，收集上清液和菌體;并以pET-32a（+）空載體IPTG誘導6 h為對照。SDS-PAGE檢測融合蛋白CatB4的表達形式，并采用鎳離子親和層析柱進行純化。純化融合蛋白CatB4在不同梯度尿素（8、6、4、2和1 mol/L）中分別透析7 h，用蔗糖濃縮至終濃度1.0 mg/mL。同時將純化融合蛋白CatB4印跡到NC膜上，以綿羊肝片吸蟲陽性血清（1∶1000稀釋）為一抗、HRP標記的兔抗綿羊IgG（1∶3000稀釋）為二抗，進行Western blotting分析。

1. 6 融合蛋白CatB4在肝片吸蟲體內(nèi)表達定位分析

純化的融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，制備抗肝片吸蟲CatB4多克隆抗體，用綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒檢測免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體。制備好的肝片吸蟲成蟲石蠟組織切片在枸櫞酸緩沖液中煮沸修復10 min，冷卻后置于3.0%的H2O2-PBS中孵育10 min，以小鼠抗肝片吸蟲多克隆抗體（1∶150稀釋）為一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶1000稀釋）為二抗，進行免疫組化定位分析，經(jīng)蘇木素染色后在顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對照組以未免疫的陰性小鼠血清為一抗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 肝片吸蟲CatB4基因克隆結(jié)果

采用RT-PCR擴增肝片吸蟲CatB4基因，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得一條約700 bp的目的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。切膠回收目的基因片段，克隆至pMD19-T載體上，經(jīng)雙酶切鑒定分別得到一條2692 bp的載體片段和一條699 bp的CatB4基因片段（圖2），表明肝片吸蟲CatB4基因已成功插入pMD19-T載體。

2. 2 肝片吸蟲CatB4基因及其編碼蛋白的分子特征分析結(jié)果

將測序得到的肝片吸蟲CatB4基因cDNA序列與GenBank中的肝片吸蟲CatB4基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列同源性為99.43%。在線分子生物信息學軟件分析結(jié)果顯示，CatB4蛋白等電點（pI）7.95，理論分子質(zhì)量25.89 kD;CatB4蛋白無信號肽和跨膜區(qū)，屬于非分泌性蛋白。Motif Scan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CatB4蛋白存在10個潛在的磷酸化位點、2個N-糖基化位點和7個N-肉豆蔻?；稽c;Antigen Prediction Tool預(yù)測結(jié)果顯示，CatB4蛋白有9個抗原決定簇。CatB4蛋白具有高度保守的CatB結(jié)構(gòu)域，是由無規(guī)則卷曲連接9個α-螺旋和8個β-折疊構(gòu)成其空間結(jié)構(gòu)?；贑atB4基因核苷酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）顯示，肝片吸蟲和大片吸蟲聚為一支，二者的親緣關(guān)系最近，同源性為83.98%;而與其他寄生蟲的親緣性相對較遠。

2. 3 原核表達載體pET-CatB4的雙酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET-CatB4用BamH I和Xho I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到一條699 bp的目的條帶和一條5900 bp的載體片段（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符，表明CatB4基因已成功插入pET-32a（+）表達載體。

2. 4 融合蛋白CatB4的誘導表達、純化及鑒定結(jié)果

SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，IPTG誘導獲得的融合蛋白在41.80 kD處有一條特異性條帶，與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量大小一致;而以IPTG誘導的pET-32a（+）空載體和重組菌上清液均未獲得特異性條帶（圖5），表明CatB4蛋白主要以包涵體的形式表達。經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后僅檢測到單一的目的條帶，與理論值大小相符。Western blotting分析結(jié)果也顯示，在41.80 kD處檢測到目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可與綿羊肝片吸蟲陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

2. 5 融合蛋白CatB4的免疫組化定位分析結(jié)果

綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，以純化融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫的小鼠均可產(chǎn)生特異性抗體，證實融合蛋白CatB4具有較強的免疫原性。免疫組化定位分析結(jié)果顯示，在肝片吸蟲的卵黃腺腺體細胞（圖6-A）、排泄管上皮細胞（圖6-B）、腸道上皮細胞（圖6-C）和卵黃腺管上皮細胞（圖6-D）均發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，呈深棕色;而陰性對照組未發(fā)生反應(yīng)（圖6-E和圖6-F），證實CatB4蛋白主要在肝片吸蟲的分泌組織細胞內(nèi)高度表達。

3 討論

肝片吸蟲病是人畜共患寄生蟲病，感染宿主范圍較廣，人類、家畜及嚙齒動物均可被感染（何山紅等，2010）。牛、羊等草食動物是肝片吸蟲感染的重要宿主，特別是在我國一些牧區(qū)肝片吸蟲病的感染率和發(fā)病率較高，其化學藥物治療效果不理想，因此加強家畜肝片吸蟲病疫苗研發(fā)至關(guān)重要。近年來，國內(nèi)外已開展大量肝片吸蟲亞單位疫苗候選抗原的相關(guān)研究，并分析了不同抗原對宿主的保護作用。研究證實，肝片吸蟲硫氧還蛋白—谷胱甘肽還原酶可使兔體內(nèi)肝片吸蟲量降低96.7%（Maggioli et al.，2011），CatL可對牛產(chǎn)生47%～63%的免疫保護（Weso?owska et al.，2018），而脂肪酸結(jié)合蛋白對犢牛和綿羊的免疫保護率分別為23.0%和43.0%（López-Abán et al.，2007;Kumar et al.，2012）。

目前，已有研究證實ESP對肝片吸蟲在宿主體內(nèi)的寄生具有多種調(diào)節(jié)作用。一方面，ESP可對宿主淋巴細胞產(chǎn)生免疫刺激和毒性作用，引起肝細胞凋亡，還可誘導單核細胞抑制抗蠕蟲過敏反應(yīng)（Cervi et al.，1996;B?ska et al.，2013）;另一方面，ESP能抑制宿主分泌NO和腹腔吞噬細胞對蟲體的黏附、吞噬作用，幫助蟲體實現(xiàn)免疫逃避（Flynn and Mulcahy，2008），增強宿主Th2反應(yīng)的同時抑制Th1反應(yīng)（Hillyer，2005）。CatB作為肝片吸蟲產(chǎn)生的一種重要ESP，其生物學特性和功能至今尚未得到深入研究。CatB在蟲體內(nèi)的表達具有時空性，可能是通過切割宿主抗體或阻止免疫效應(yīng)分子使肝片吸蟲逃避宿主免疫應(yīng)答（Creaney et al.，1996）。同時，CatB家族成員具有良好的免疫原性，可誘導感染宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。Jayaraj等（2009）以肝片吸蟲CatB和CatL5分別免疫大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CatB可獲得60.0%的減蟲率，當兩個蛋白聯(lián)合免疫時保護率可達83.0%，說明CatB和CatL單獨免疫或聯(lián)合免疫均可對大鼠產(chǎn)生免疫保護作用，但聯(lián)合免疫的保護效果更佳。Chantree等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，小鼠免疫大片吸蟲CatB2和CatB3蛋白2周后，其體內(nèi)總IgG含量顯著升高，且在感染囊蚴后IgG總量高水平保持4周。Weso?owska等（2018）以rFhCatL3-1和rFhCatL3-2分別免疫大鼠，結(jié)果使大鼠的肝片吸蟲量分別降低47.0%和63.0%，用rFhCatL3-1/CatL3-2/CatB3制成的三價疫苗與rFhCatL3-2相比，其保護作用未見明顯提高，但可有效降低肝片吸蟲對大鼠肝臟的損傷;同時證實通過滴鼻免疫CatL5和CatB2二價重組蛋白亞單位疫苗能降低綿羊體內(nèi)的載蟲量，即肝片吸蟲CatB具有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。本研究對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆表達后經(jīng)免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CatB4蛋白主要在肝片吸蟲成蟲分泌組織細胞內(nèi)大量表達，表明CatB4是肝片吸蟲成功入侵和寄生過程中的一種重要蛋白。

CatB家族的大部分成員主要在肝片吸蟲童蟲階段分泌表達，但也有部分CatB蛋白可在成蟲階段表達，與CatL在蟲體的寄生過程中起協(xié)同作用（李曉娟，2009），提示CatB蛋白可能在成蟲蟲體移行、寄生和免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用。為此，本研究對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆及原核表達，結(jié)果證實誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可與肝片吸蟲陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，即有較強的免疫原性，且CatB4蛋白主要在肝片吸蟲成蟲卵黃腺及腸管上皮細胞中表達，該結(jié)論為進一步研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及其致病機理打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可特異性識別綿羊肝片吸蟲陽性血清，具有較強的免疫原性，且主要在肝片吸蟲分泌排泄組織器官中表達，說明CatB4蛋白具有作為肝片吸蟲候選抗原的潛力。

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（責任編輯 蘭宗寶）