連翹酯苷A對(duì)嗜水氣單胞菌耐恩諾沙星的延緩效果及其外排作用

董亞萍 馮東岳 孫晶 張小明 胡鯤

摘要：【目的】明確連翹有效成分延緩嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）對(duì)恩諾沙星的耐藥性及其對(duì)藥物主動(dòng)外排作用中耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）相關(guān)基因表達(dá)的影響，為明確連翹延緩氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性的有效成分及揭示其延緩機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā坑^測(cè)連翹提取液及其與恩諾沙星聯(lián)合作用對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)的影響，測(cè)定連翹有效成分（連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B）作用于嗜水氣單胞菌前后的最小抑菌濃度（MIC），并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)連翹脂苷A作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株后RND相關(guān)基因（aheA、aheB和aheC）的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用下，連翹提取液對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC為3.12 μg/mL;在MIC和2MIC的條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株的生長(zhǎng)，24 h內(nèi)未見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)。連翹的3種有效成分對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株均表現(xiàn)出抑制作用，在1.00 μg/mL濃度條件下，連翹脂苷A的整體抑制效果較連翹苷和連翹脂苷B的效果更好。以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，其中aheA基因的相對(duì)表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降（P<0.05）?！窘Y(jié)論】連翹提取液與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合使用對(duì)嗜水氣單胞菌有明顯抑制效果，同時(shí)能延緩嗜水氣單胞菌的耐藥性，其中又以連翹脂苷A對(duì)RND主動(dòng)外排系統(tǒng)的抑制作用最明顯。

關(guān)鍵詞： 連翹酯苷A;嗜水氣單胞菌;恩諾沙星;耐藥性;耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）

中圖分類(lèi)號(hào)： S948? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）01-0187-07

0 引言

【研究意義】隨著氟喹諾酮類(lèi)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛使用，其耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，且該類(lèi)藥物在細(xì)菌體內(nèi)的主動(dòng)外排作用極易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥（明德松和鄧勇，2013;李帆等，2018）。與細(xì)菌主動(dòng)外排作用相關(guān)的超家族共有5個(gè)（Kerr，2002;Piddock，2006;Murakami et al.，2006），分別是ATP 結(jié)合盒超家族（ABC）、小多藥耐藥家族（SMR）、主要易化子超家族（MF）、多藥及毒性化合物外排家族（NATE）和耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）。AcrB是RND家族外排泵中的一個(gè)主要耐藥蛋白，位于細(xì)胞內(nèi)膜上。在膜融合蛋白（AcrA）和外膜通道蛋白（TolC）的協(xié)助下，AcrB蛋白通過(guò)自身提供的能量選擇性將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)排出到細(xì)胞質(zhì)周?chē)?，同時(shí)在AcrA 蛋白的協(xié)助下傳遞給TolC，進(jìn)而將藥物分子徹底排出細(xì)胞外（Murakami et al.，2006）。這種外排泵方式即為大腸桿菌（Escherichia coli）多重耐藥性的主要耐藥機(jī)制，其作用底物大多為四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物（田亞凱，2018）。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要致病菌之一，能引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物急性出血性敗血癥而大批量死亡，且耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，但至今有關(guān)外排泵RND耐藥機(jī)制在嗜水氣單胞菌中的報(bào)道很少，因此，亟待加強(qiáng)嗜水氣單胞菌外排泵RND耐藥機(jī)制研究，有效解決因嗜水氣單胞菌耐藥造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC796的全基因組中檢測(cè)到10個(gè)RND系統(tǒng)（Seshadri et al.，2006;Takahashi et al.，2014），其中7個(gè)屬于疏水/兩親外排-1家族系統(tǒng)（Saier and Paulsen，2001;Seshadri et al.，2006）。AheB是嗜水氣單胞菌中與大腸桿菌AcrB系統(tǒng)最密切相關(guān)的外排泵，且與銅綠假單胞菌（Pseudomas aeruginosa）中mexB的作用性質(zhì)相似（Evans and Poole，1999;Hernould et al.，2008;Kiratisin et al.，2012;Sader et al.，2017）。與其他外排泵相比，AheABC關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化對(duì)耐藥菌的敏感性影響更明顯（Morita et al.，2001;Hernould et al.，2008），且該外排泵具有底物特異性。Hernould等（2008）發(fā)現(xiàn)的嗜水氣單胞菌AheABC外排泵是人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)的氣單胞菌屬細(xì)菌存在外排泵多重耐藥系統(tǒng)，其至少能泵出13種物質(zhì)，包括9種抗生素;同時(shí)通過(guò)苯丙氨酸—精氨酸-β-萘酰胺（PAβN）抑制試驗(yàn)證實(shí)，除AheABC外排系統(tǒng)外還有其他的RND家族藥物外排系統(tǒng)參與嗜水氣單胞菌的自身耐藥過(guò)程。因此，以恩諾沙星作為模式藥物對(duì)病原菌RND系統(tǒng)進(jìn)行研究，對(duì)揭示嗜水氣單胞菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】連翹具有抗菌、抗病毒和抗氧化等作用，且成分復(fù)雜、作用靶位多、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，主要有效成分為苯乙醇苷類(lèi)、木脂素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)和三萜類(lèi)（曲歡歡，2008;孟祥樂(lè)等，2010），其中苯乙醇苷類(lèi)主要包括連翹苷和連翹脂苷，二者的作用效果迥異，即使同一有效成分對(duì)不同菌株耐藥性的抑制作用也有所差別，但至今鮮見(jiàn)有關(guān)連翹有效成分對(duì)菌株耐藥性影響的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)探究連翹3種有效成分（連翹苷、連翹脂苷A和連翹脂苷B）抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株的效果，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)連翹對(duì)藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)中RND相關(guān)基因表達(dá)的影響，為明確連翹延緩氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性的有效成分及揭示其延緩機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

對(duì)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)保存的嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC7966）進(jìn)行誘導(dǎo)以獲得耐藥菌株;連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B（純度≥98%）購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;TRIzol Reagent（15596-026）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;氯仿（批號(hào)10006818）、異丙醇（批號(hào)40064360）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RRO47A）購(gòu)自TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備有制冰機(jī)（XUEKE，IMS-100）、熒光定量?jī)x（Roche，480II Real Time PCR System）、PCR儀（BioRad，C1000）、核酸定量?jī)x（Thermo，NanoDrop 2000c）和離心機(jī)（Eppendrof，5810R）等。

1. 2 連翹有效成分溶液配制

精確稱(chēng)取18.0 mg連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B粉末（純度≥98%），充分溶解于900.0 μL二甲基亞砜（DMSO）中，配制成20 mg/mL的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾5次后4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们耙訫H液體培養(yǎng)基稀釋成200 μg/mL，確保DMSO濃度低于1%（黃智生，2016）。

1. 3 連翹及其與恩諾沙星聯(lián)合作用最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

參考董亞萍等（2016）的方法提取連翹有效成分，再以MH液體培養(yǎng)基分別稀釋連翹提取物（1.0 g/L）和恩諾沙星（1280 μg/mL），配制成9個(gè)濃度梯度連翹提取液（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56和0.78 μg/mL），每個(gè)濃度梯度中的恩諾沙星濃度均為64 μg/mL;以只含64 μg/mL恩諾沙星的培養(yǎng)基為對(duì)照?；罨氖人畾鈫伟退幘暧脺缇睇}水稀釋制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?.0 μL菌懸液加入到96孔板中，且每孔添加200.0 μL藥液，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)20 h后觀察并記錄結(jié)果，以肉眼觀察培養(yǎng)基中無(wú)渾濁液所對(duì)應(yīng)的連翹提取液濃度即為MIC。

1. 4 嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

根據(jù)連翹提取物對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC，取一定量的連翹提取物（1.0 g/mL）置于3只無(wú)菌錐形瓶中，以含64 μg/mL恩諾沙星的MH液體培養(yǎng)基補(bǔ)足至100.0 mL，分別制成含連翹提取物1/2MIC、MIC和2MIC的MH液體培養(yǎng)基;另取2只無(wú)菌錐形瓶，其中，只含64 μg/mL恩諾沙星MH液體培養(yǎng)基的無(wú)菌錐形瓶為陰性對(duì)照，不加任何藥物、只含MH液體培養(yǎng)基的無(wú)菌錐形瓶為陽(yáng)性對(duì)照。5只錐形瓶均接種嗜水氣單胞菌耐藥菌株的對(duì)數(shù)菌懸液，28 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)，每隔1 h取適量菌液在600 nm下測(cè)定吸光值，然后以取菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制耐藥菌株的生長(zhǎng)曲線。

1. 5 不同連翹有效成分對(duì)耐藥菌的延緩效果

連翹的3種有效成分溶液用MH培養(yǎng)基分別稀釋為0.05、0.10、0.25、0.50和1.00 μg/mL 5個(gè)濃度梯度，將6株嗜水氣單胞菌耐藥菌株分別接種到不同濃度梯度中，同時(shí)設(shè)不含連翹有效成分的MH培養(yǎng)基為對(duì)照。28 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)24 h后肉眼觀察結(jié)果，當(dāng)最低濃度的試管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)即為受試菌株對(duì)恩諾沙星的MIC，通過(guò)與原始MIC對(duì)比以判斷其延緩耐藥效果。

1. 6 菌株耐藥相關(guān)基因定量分析

1. 6. 1 引物設(shè)計(jì)與合成 選擇aheA、aheB和aheC 3個(gè)基因，根據(jù)基因位置在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）下載相關(guān)序列，然后采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 6. 2 菌液總RNA提取 取2.0 mL搖床培養(yǎng)16～20 h的菌懸液，4 ℃下12000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗脫2次，4 ℃下12000 r/min離心2 min。采用TRIzol Reagent提取菌液總RNA，并測(cè)定RNA濃度和質(zhì)量。5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，RNA 1 μg，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10.0 μL，充分混勻，42 ℃下反應(yīng)2 min以去除基因組DNA。

1. 6. 3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系20.0 μL：RNA模板10.0 μL，Primer Script RT Enzyme MIX 1.0 μL，RT Primer MIX 1.0 μL，5×Prime Script Buffer 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1. 6. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以β-action基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每組3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR Green Supermix 10.0 μL，Primer-F 1.0 μL，Primer-R 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-Free H2O 6.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GraphPad Prism 5.0制圖，并采用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

1. 6. 5 連翹酯苷A對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株的作用 選擇連翹酯苷A的高、中、低3個(gè)濃度即0.05、0.50和1.00 μg/mL作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株，然后對(duì)aheA、aheB和aheC 3個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 連翹與恩諾沙星聯(lián)合作用對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC

不同濃度連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用，隨連翹提取液濃度的升高，嗜水氣單胞菌耐藥菌株對(duì)聯(lián)合藥物的敏感性增強(qiáng)。由表2可知，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用下，連翹提取液對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC為3.12 μg/mL;連翹提取液濃度為1.56 μg/mL時(shí)，嗜水氣單胞菌耐藥菌株對(duì)恩諾沙星的敏感度呈中介。

2. 2 連翹與恩諾沙星聯(lián)合作用對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)曲線的影響

嗜水氣單胞菌耐藥菌株在陽(yáng)性對(duì)照組中，從第1 h開(kāi)始生長(zhǎng)，至第2 h呈現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)，其生長(zhǎng)過(guò)程可分為遲緩期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。在陰性對(duì)照中，嗜水氣單胞菌耐藥菌株具有3個(gè)明顯的生長(zhǎng)特征期，在前4 h生長(zhǎng)不明顯，但從第4 h開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度與陽(yáng)性對(duì)照組相近，說(shuō)明該耐藥菌株對(duì)64 μg/mL恩諾沙星已產(chǎn)生耐藥性。在64 μg/mL恩諾沙星與1/2MIC連翹提取液的共同作用下，嗜水氣單胞菌耐藥菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制，在前7 h無(wú)明顯生長(zhǎng)，之后進(jìn)入正常生長(zhǎng)狀態(tài)，即1/2MIC條件下恩諾沙星與連翹聯(lián)合作用并未完全抑制耐藥菌株生長(zhǎng)。在MIC和2MIC的條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合使用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)，24 h內(nèi)未見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)（圖1）。

2. 3 不同連翹有效成分的抑菌效果

由表3可知，連翹的3種有效成分對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株均表現(xiàn)出抑制作用，其中，連翹苷和連翹脂苷B的抑制效果均隨其濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，連翹脂苷A在0.25 μg/mL下即對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株生產(chǎn)明顯的抑制作用，但濃度繼續(xù)升高其抑制效果略有下降。在1.00 μg/mL濃度條件下，連翹脂苷A的整體抑制效果較連翹苷和連翹脂苷B的效果更好。

2. 4 連翹酯苷A作用前后耐藥相關(guān)基因表達(dá)量的變化

以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定與RND相關(guān)基因（aheA、aheB和aheC）的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)目的基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，且以aheA基因的變化最明顯（圖2），呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05，下同）。由圖3可看出，經(jīng)0.05、0.50和1.00 μg/mL連翹脂苷A作用后，aheA基因的相對(duì)表達(dá)量均呈不同程度的下調(diào)趨勢(shì)，0.05和0.50 μg/mL濃度條件下aheA基因表達(dá)差異不顯著（P>0.05），而在1.00 μg/mL濃度條件下，aheA基因的相對(duì)表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降。

3 討論

中藥不僅具有明顯的抗菌作用，還能延緩或抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生（胡梅等，2016）。王習(xí)達(dá)等（2011）研究表明，恩諾沙星與中藥蒲甘散聯(lián)合作用的抑菌效果明顯高于單一使用恩諾沙星，且以1∶6的配比效果最佳，對(duì)異育銀鯽敗血癥的治愈率最高。盧靜等（2013）對(duì)6種中藥和喹諾酮類(lèi)藥物單體及兩兩聯(lián)合使用抑制嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的效果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示抑菌效果排序?yàn)槁?lián)合配比>喹諾酮類(lèi)單體>中草藥單體。胡梅等（2016）研究表明，淫羊藿水提取物與頭孢類(lèi)抗菌藥聯(lián)用是通過(guò)協(xié)同或相加作用而提高抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)聯(lián)合用藥。本研究將不同濃度的連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株，并檢測(cè)24 h內(nèi)耐藥菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果顯示在MIC和2MIC條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)，24 h內(nèi)未見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)，與朱健銘等（2017）的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步證實(shí)連翹具有延緩嗜水氣單胞菌耐藥性的作用，且與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合作用其效果更明顯。

細(xì)菌在逆境脅迫下，其表面會(huì)形成一種生物被膜以抵御外界環(huán)境，如抗生素在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)部分細(xì)菌形成生物膜。Qu等（2008）研究表明，黃連素等提取物可有效抑制耐藥菌生物膜形成;官妍等（2010）研究表明，黃芩對(duì)葡萄球菌生物膜的形成無(wú)抑制作用，而連翹苷可有效抑制葡萄球菌表皮生物膜形成，且隨連翹苷濃度的增加其抑制作用逐漸增強(qiáng);張穎娟等（2014）通過(guò)測(cè)定連翹有效成分對(duì)大腸桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等3種致病菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連翹苷對(duì)這3種致病菌無(wú)抑菌活性，而連翹酯苷A的抑菌效果排序?yàn)榇竽c桿菌>金黃色葡萄球菌>肺炎鏈球菌。本研究結(jié)果顯示，連翹的3種有效成分對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥菌株均有不同程度的抑制作用，與孟祥樂(lè)等（2015）、Yan等（2017）的研究結(jié)果相似。相對(duì)于連翹的其他兩種有效成分（連翹苷和連翹脂苷B），連翹酯苷A的抑菌作用和延緩耐藥性效果更明顯。但鐘海琴（2013）在研究連翹苷、連翹脂苷A和連翹酯苷B對(duì)肺炎克雷伯氏菌外排泵的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)連翹脂苷B對(duì)肺炎克雷伯氏菌耐藥菌株的抑制作用最強(qiáng)，可能是由于連翹的作用靶位較多，且對(duì)不同致病菌的作用機(jī)制不同，即要求進(jìn)一步探究連翹對(duì)耐藥菌的抑制機(jī)制。

中藥對(duì)細(xì)菌及其耐藥性抑制的作用機(jī)制較復(fù)雜，主要是通過(guò)抑制細(xì)菌生物被膜的形成而延緩細(xì)菌對(duì)抗菌藥的耐藥性（官妍等，2010;黃干榮等，2013）。任玲玲和關(guān)立增（2008）通過(guò)對(duì)比連翹作用大腸桿菌耐藥菌株前后的基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹可改變與藥物外排作用相關(guān)的基因。AcrABC外排系統(tǒng)是大腸桿菌的主要多重耐藥機(jī)制，而嗜水氣單胞菌aheB基因與大腸桿菌主要外排系統(tǒng)的acrB基因功能極其相似。本研究結(jié)果表明，以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，且以aheA基因的變化最明顯;此外，經(jīng)0.05、0.50和1.00 μg/mL連翹脂苷A作用后，aheA基因相對(duì)表達(dá)量也呈不同程度的下調(diào)趨勢(shì)，其中在1.00 μg/mL濃度條件下，aheA基因的相對(duì)表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降。連翹酯苷A延緩嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星耐藥性的同時(shí)，一定程度上降低了與RND外排作用相關(guān)基因的表達(dá)，其作用機(jī)制是否與其他機(jī)制相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

連翹提取液與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合使用對(duì)嗜水氣單胞菌有明顯抑制效果，同時(shí)能延緩嗜水氣單胞菌的耐藥性，其中又以連翹脂苷A對(duì)RND主動(dòng)外排系統(tǒng)的抑制作用最明顯。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）