重慶自育水稻骨干親本稻瘟病抗性評價(jià)及其抗病基因分布分析

黃乾龍 管玉圣 歐陽杰 郭爽

摘要：【目的】明確重慶自育水稻骨干親本的稻瘟病抗性及其抗病基因分布情況，為高效選育抗稻瘟病水稻品種提供優(yōu)質(zhì)親本?！痉椒ā坎捎貌∑宰匀徽T發(fā)和人工接種相結(jié)合的方法，對重慶地區(qū)自育的73份水稻骨干親本稻瘟病抗性進(jìn)行鑒定，并利用Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pi-km1 7個(gè)抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記對其基因型進(jìn)行檢測以分析抗病基因分布和聚合方式?！窘Y(jié)果】73份水稻親本中，田間稻瘟病抗性鑒定為高抗和抗病的親本（42份）占57.5%，攜帶抗病基因的水稻親本（49份）占67.1%，其中僅攜帶1個(gè)抗病基因的親本有18份，表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率44.4%;聚合2個(gè)抗病基因的親本有18份，表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率55.6%，聚合3個(gè)抗病基因的親本有9份，均表型抗病，抗病比率100.0%;聚合4個(gè)抗病基因的親本有4份，表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率100.0%;不攜帶檢測基因的親本（24份）占32.9%，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率45.8%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的水稻骨干親本中分布頻率不同，分別為13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未檢測出含抗病基因Pi9和Pi-km1的親本，也未檢測到同時(shí)攜帶抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita的親本。不同水稻親本攜帶抗病基因不同及聚合方式不同，抗病表現(xiàn)均存在差異?！窘Y(jié)論】基因聚合可有效提高親本的抗病性，但基因聚合后抗病比率并非簡單地疊加，應(yīng)從中篩選田間抗病較強(qiáng)的親本作為抗稻瘟病育種的候選親本。

關(guān)鍵詞： 水稻;骨干親本;稻瘟病;表型;抗病基因;抗性

中圖分類號： S511.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0008-08

0 引言

【研究意義】由灰梨孢（Pyricularia grisea Sacc.）引起的稻瘟病是影響水稻（Oryza sativa L.）生產(chǎn)的主要病害之一，具有發(fā)生范圍廣、傳播快、流行頻率高、病原菌易變異等特點(diǎn)（孫國昌等，1998;陳利鋒和徐敬友，2005），嚴(yán)重威脅水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)（Skamnioti and Gurr，2009;Moyri et al.，2012）。近年來，隨著優(yōu)質(zhì)雜交稻在重慶地區(qū)的大面積推廣，感病品種隨之增多，加之菌源充足、氣候適宜稻瘟病發(fā)生等原因，稻瘟病已成為重慶地區(qū)水稻最主要的病害。生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育和種植抗稻瘟病水稻品種是防治水稻稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施（Dean et al.，2012;王麗麗等，2017），因此，開展重慶地區(qū)自育水稻骨干親本稻瘟病抗性評價(jià)及基因檢測對高效選育抗稻瘟病水稻品種及其安全、穩(wěn)定生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雜交水稻品種的稻瘟病抗性受其親本稻瘟病抗性影響（黃富等，2007）。傳統(tǒng)育種方法是通過主導(dǎo)優(yōu)良品種與抗性親本雜交，再將雜交后代在稻瘟病病圃經(jīng)多代壓力選擇篩選出抗性品系，以實(shí)現(xiàn)抗稻瘟病品種選育。由于缺乏對抗源資源所攜帶抗稻瘟病基因（Pi）的了解，故在抗性親本選擇上目的性不強(qiáng)，對雜交后代的選擇效率也較低。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記可快速確定水稻中的抗病基因類型，并利用與之緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種，可有效提高選擇效率。目前，已報(bào)道85個(gè)主效抗病基因主要分布在69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)（Deng et al.，2017），其中25個(gè)抗病基因已被克隆。此外，大量科研人員利用不同抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記和病圃對水稻資源的稻瘟病抗性進(jìn)行研究。冷禎陸（2011）、李建修（2012）利用稻瘟病病圃對四川水稻制恢資源的稻瘟病抗性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明，69.5%的制恢資源表現(xiàn)為高抗稻瘟病，14.1%的制恢資源表現(xiàn)為中抗或抗稻瘟病。李進(jìn)斌等（2012）利用Pita和Pib抗稻瘟病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記對云南地方稻種的抗稻瘟病基因型進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，Pita基因主要分布于玉溪、保山、臨滄、思茅等地區(qū)的稻種中，而Pib基因主要分布于滇西部的怒江和昭通地區(qū)的稻種中。宋廣樹等（2016）研究Piz-t、Pi-kh等10個(gè)抗稻瘟病基因在吉林主栽品種和優(yōu)良品系中的分布，結(jié)果表明，Pi2、Pi36、Pi37、Pi-kh、Piz-t和Pita基因在吉林省主要推廣水稻品種中分布較廣泛，而Pi9、Pib、Pi21和Pi-d2基因分布較少。張銀霞等（2016）利用Pita、Pi-kh等7個(gè)抗稻瘟病基因的SSR分子標(biāo)記分析寧夏水稻品種的抗稻瘟病基因類型及數(shù)量，結(jié)果表明，寧夏水稻品種主要含有Pib、Pi-km和Pi9基因，缺乏Pi2和Pita基因。管玉圣等（2017）利用Pi2、Pi5等4個(gè)抗稻瘟病基因的SSR分子標(biāo)記對重慶地區(qū)部分水稻親本材料的抗稻瘟病基因進(jìn)行檢測，明確了Pi2、Pi5等4個(gè)抗稻瘟病基因的SSR分子標(biāo)記對重慶部分親本材料篩選的有效性。【本研究切入點(diǎn)】不同地區(qū)稻瘟病病原菌致病類型不同，且易變異。目前，針對重慶地區(qū)特定的病原菌種群，本課題組前期研究已明確了Pi2、Pi5、Pi9和Pi-kh 4個(gè)抗稻瘟病基因的SSR分子標(biāo)記對重慶地區(qū)親本篩選的有效性和抗病基因在親本中的分布情況（管玉圣等，2017），但水稻攜帶抗病基因不同，則抗病性不同，且即使攜帶抗病基因也并不代表表型抗病。因此，有必要對重慶地區(qū)水稻親本的稻瘟病進(jìn)行田間表型鑒定，輔以分子標(biāo)記手段，根據(jù)抗病性和基因型制定育種策略，以保障水稻的安全、穩(wěn)定生產(chǎn)。【擬解決的關(guān)鍵問題】以重慶地區(qū)自育的水稻骨干親本為材料，采用自然誘發(fā)和人工接種相結(jié)合的方式對其稻瘟?。ㄋ腩i瘟）進(jìn)行田間抗病性評價(jià)，并利用抗性譜較廣的Pi2、Pi5等7個(gè)抗稻瘟病基因SSR分子標(biāo)記檢測水稻骨干親本材料中攜帶的抗病基因類型和數(shù)量，以明確親本的稻瘟病表型、基因型及其分布、抗病基因不同聚合方式的抗病比率等，為合理利用親本稻瘟病抗性、高效選育抗稻瘟病水稻品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為重慶地區(qū)自育的73份水稻骨干親本，其中，制保親本（品種編碼2018-B01～2018-B46）46份和制恢親本（品種編碼2018-R01～2018-R27）27份。病圃穗頸瘟鑒定對照水稻品種為麗江新團(tuán)黑谷。以上水稻材料均由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。稻瘟病病原菌單孢菌株ZA11和ZB11為近3年重慶地區(qū)流行且致病力強(qiáng)的致病菌，由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院分離、純化、鑒定及保存。主要試劑：DNA提取液、三氯甲烷（分析純）、冰乙醇（分析純）、70%（v/v）乙醇溶液、1×TE緩沖液、10 g/L瓊脂糖溶液和0.5×TBE緩沖液均由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供;引物和PCR反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa公司。主要設(shè)備儀器：PCR擴(kuò)增儀（SensQuest Labcycle）、Gel DOCTM XR+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）、電泳儀（PowerPacTM）、電泳槽、高通量組織研磨器（Scientz.50）和水平搖床（WD-9405B型）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 稻瘟病菌培養(yǎng)與孢子懸浮液配制 參照付崇允等（2006）的方法，分別采用PDA培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1000 mL蒸餾水）和大麥培養(yǎng)基（大麥∶高粱=3∶1）進(jìn)行稻瘟病菌孢子培養(yǎng)和孢子擴(kuò)大培養(yǎng)，供產(chǎn)孢備用。收集稻瘟病菌孢子時(shí)，先用滅菌水洗脫大麥高粱培養(yǎng)基上生長的稻瘟病菌孢子，再用3層滅菌紗布過濾洗脫液，濾去雜質(zhì)，最終將孢子懸浮液中的孢子濃度調(diào)整至2×105個(gè)/mL備用。孢子懸浮液現(xiàn)配現(xiàn)用。接種前等體積混合兩種病原菌孢子懸浮液，供田間噴霧接種。

1. 2. 2 稻瘟病抗性評價(jià) 試驗(yàn)于2015─2017年在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所南川區(qū)河圖鄉(xiāng)的稻瘟病抗性鑒定圃（東經(jīng)107°27′，北緯29°30′，海拔680 m）進(jìn)行，該地區(qū)為重慶市稻瘟病常發(fā)區(qū)，采用自然發(fā)病和人工接種誘發(fā)稻瘟病相結(jié)合的方法開展抗病性鑒定。試驗(yàn)以每份水稻骨干親本為一小區(qū)，種植株行距16 cm×26 cm，每份親本2行，每行10株，共20株，各骨干親本間比法排列，每10份骨干親本種植2行麗江新團(tuán)黑谷作為感病對照。病圃四周種植感病水稻3～6行，作為誘發(fā)行。于水稻孕穗期至破口期前數(shù)天，以背負(fù)式噴霧器對目標(biāo)小區(qū)進(jìn)行ZA11和ZB11菌株孢子懸浮液接種2～3次，每48 h接種1次。水稻整個(gè)生育期保持適量的水深，適當(dāng)增施氮肥，根據(jù)病圃害蟲、雜草種類和程度使用殺蟲劑和除草劑，不使用任何殺菌劑，其他田間管理措施參照常規(guī)辦法。當(dāng)感病對照品種麗江新團(tuán)黑穗頸瘟充分發(fā)病時(shí)，對目標(biāo)小區(qū)水稻骨干親本的穗頸瘟進(jìn)行表型調(diào)查。分級標(biāo)準(zhǔn)參照楊秀娟等（2008）的病情指數(shù)平均值評判法（表1）。最后，計(jì)算抗病比率（表型高抗和抗病親本的比例）。

1. 2. 3 抗稻瘟病基因檢測 取水稻骨干親本分蘗期的嫩綠葉片3～5片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。利用抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pik-m1的連鎖SSR分子標(biāo)記引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：DNA模板 1.0 μL、1.0 μL 10×PCR緩沖液（含MgCl2）、10 mmol/L引物1.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/mL Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物加入2.0 μL上樣緩沖液充分混勻后，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，取出后放入含溴化乙錠的0.5×TBE緩沖液染色3～5 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄結(jié)果。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水稻骨干親本的穗頸瘟抗性田間鑒定結(jié)果

穗頸瘟田間表型鑒定結(jié)果如表3所示。雖然供試水稻骨干親本穗頸瘟表型不同年度間存在一定差異，但整體表型基本一致，在感病～高抗水平間均有分布。其中，高抗和抗病親本有42份，占供試親本總數(shù)的57.5%;中抗和中感親本各12份，均占16.4%;感病親本有7份，占9.6%。

2. 2 水稻骨干親本的基因型檢測結(jié)果

從基因型檢測結(jié)果（表4）可看出，攜帶抗病基因的水稻親本有49份，占供試親本總數(shù)的67.1%;不攜帶檢測基因的水稻親本有24份，占32.9%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的水稻骨干親本中分布頻率各不相同（圖1），分別為13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未檢測出攜帶抗病基因Pi9和Pi-km1的親本。

將供試親本的穗頸瘟田間表現(xiàn)鑒定結(jié)果（表3）和基因型檢測結(jié)果（表4）進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，供試親本攜帶抗病基因不同及其聚合方式不同，抗病表現(xiàn)均存在差異。具體表現(xiàn)：僅攜帶Pi2基因的親本有1份，表型為抗病;僅攜帶Pi5基因的親本有4份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有2份，表型中抗的有1份;僅攜帶Pib基因的親本有4份，表型抗病的有2份，表型中抗和中感的各有1份，僅攜帶Pi-kh基因的親本有5份，表型抗病的有2份;表型中感的有1份，表型感病的有2份;僅攜帶Pita的親本有4份，表型中抗的有1份，表型中感的有2份，表型感病的有1份;攜帶Pi2+Pi-kh、Pi2+Pib、Pi-kh+Pita、Pi5+Pi-kh基因的親本各1份，其中前三者表型為抗病，后者表型為中感;攜帶Pi5+Pib基因的親本有7份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，表型中抗的有3份;攜帶Pi5+Pita基因的親本有3份，表型高抗、中抗和感病的親本各1份;攜帶Pi-kh+Pib基因的親本有2份，表型高抗和中感各1份;攜帶Pib+Pita基因的親本2份，表型抗病和中感各1份;攜帶Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的親本均有3份，均表型抗病;攜帶Pi-kh+Pib+Pita、Pi5+Pi-kh+Pita、Pi2+Pi5+Pi-kh基因的親本各1份，均表型抗病;攜帶Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因的有2份，均表型高抗;攜帶Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因的親本有1份，均表型抗病;攜帶Pi5+Pi-kh+Pib+Pita基因有1份，表型為抗病。

2. 3 抗稻瘟病基因數(shù)量及聚合親本的抗病性分析結(jié)果

由表5可看知，不攜帶抗病基因的水稻親本有24份，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率為45.8%;僅攜帶1個(gè)抗病基因的水稻親本有18份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率為44.4%;聚合2個(gè)抗病基因的水稻親本有18份，其中表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率為55.6%，聚合3個(gè)抗病基因的水稻親本有9份，均表型抗病，抗病比率為100.0%;聚合4個(gè)抗病基因的水稻親本有4份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率為100.0%。

從抗病比率分析結(jié)果（圖2）來看，僅攜帶一個(gè)抗病基因的供試親本中，攜帶Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita基因的親本分別有1、4、4、5和4份，抗病比率分別為100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%;聚合2個(gè)抗病基因的供試親本中，攜帶Pi5+Pib基因的親本最多（7份），抗病比率達(dá)57.1%;以攜帶Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的親本均有1份，抗病比率均為100.0%;在聚合3個(gè)抗病基因的供試親本中，攜帶Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的親本均有3份，抗病比率均為100.0%;聚合4個(gè)抗病基因的供試親本有4份，分別是攜帶Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因（2份）和Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因（2份），抗病比率均為100.0%;未檢測到同時(shí)攜帶5個(gè)抗病基因的親本。

3 討論

3. 1 抗稻瘟病基因在水稻親本中分布情況

選育與推廣種植抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施（Dean et al.，2012;王麗麗等，2017），篩選抗稻瘟病水稻親本是其重要基礎(chǔ)工作。本研究對7個(gè)抗稻瘟病基因的SSR分子標(biāo)記進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在攜帶抗病基因的親本中分布頻率不同，其中Pib基因的分布頻率最高（37.0%），其次是Pi5（31.5%）基因和Pi-kh（31.5%），Pi2的分布頻率最低（13.7%），未檢測出攜帶抗病基因Pi9和Pi-km1的親本，說明Pib基因可能廣泛存在于各類水稻材料中，與李進(jìn)斌等（2012）、王麗麗等（2017）的研究結(jié)果相似，但Pi9作為抗譜較廣的抗稻瘟病基因，且與Pi2、Pi-kh基因同時(shí)被確認(rèn)是西南稻區(qū)四川地區(qū)有效的抗稻瘟病基因（張雪梅，2011），在本研究供試水稻材料中尚未檢測出，推測是種質(zhì)的地域局限性所致，應(yīng)加強(qiáng)含該抗病基因親本的引、育、選種工作。

3. 2 不同抗稻瘟病基因的抗病效應(yīng)分析

已有研究證實(shí)，聚合多個(gè)抗稻瘟病基因有利于拓寬品種的抗譜，進(jìn)而提高抗病性，可作為培育稻瘟病持久抗性的有效方法（張銀霞等，2016）。本研究以從重慶地區(qū)分離得到的稻瘟病病原菌主要優(yōu)勢生理小種ZA11和ZB11為致病菌，利用7個(gè)抗稻瘟病基因分子標(biāo)記檢測73份水稻骨干親本的抗病基因型，并鑒定其田間穗頸瘟抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚合抗病基因Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的親本和聚合3個(gè)及以上抗病基因的親本抗病比率均為100.0%，表明基因聚合可有效提高親本的抗病性，與張銀霞等（2016）的研究結(jié)果相似。但王麗麗等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)水稻資源抗稻瘟病基因聚合與抗病性并非完全正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在僅攜帶單個(gè)抗病基因的親本中，攜帶Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita抗病基因的親本抗病比率分別為100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%，在聚合2個(gè)抗病基因的親本中，Pi5+Pib（57.1%）、Pi5+Pi-kh（0%）和Pi5+Pita（33.3%）的抗病比率小于或遠(yuǎn)小于攜帶單個(gè)抗病基因Pi5親本的抗病比率（75.0%），說明抗病基因Pi5聚合后抗病性反而減弱，推測基因聚合后抗病比率不是簡單地疊加。這與王麗麗等（2017）的研究推論相似。

稻瘟病是水稻上毀滅性真菌病害，符合經(jīng)典的基因?qū)蚣僬f（Jia et.al，2000）。本研究發(fā)現(xiàn)，在24份不攜帶抗病基因的親本中，有9個(gè)親本表現(xiàn)抗病，推測這些親本中含有本研究7個(gè)抗稻瘟病基因以外的其他抗稻瘟病基因，且環(huán)境因素對親本抗病性存在影響，具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

基因聚合可有效提高親本的抗病性，但基因聚合后抗病比率不是簡單地疊加，應(yīng)從中篩選出田間抗病性較強(qiáng)的親本作為抗稻瘟病育種的候選親本。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）