3種三七根腐病致病菌的抑菌植物篩選

李紀(jì)潮 楊天梅 楊紹兵 左應(yīng)梅 楊美權(quán) 章朦玥 許宗亮 張金渝

摘要：【目的】篩選出對3種三七根腐病致病菌具有強(qiáng)抑菌效果的拮抗植物，為制定三七根腐病綠色安全的防控措施提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā酷槍θ吒〉?種致病菌[假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.，菌株號B857）、無色桿菌（Achromobacter marplatensis，菌株號B562）和產(chǎn)堿菌屬（Candidimonas sp.，菌株號B2681）]，選用16種常見草本植物進(jìn)行乙醇超聲波提取，用二倍稀釋法稀釋成5個(gè)濃度梯度進(jìn)行平板打孔抑菌試驗(yàn)，測量抑菌直徑并計(jì)算毒力回歸方程及致死中濃度（LC50），采用刃天青微孔板法觀測16種植物提取液對3種病原菌的最小抑菌濃度（MIC），篩選出抑菌效果強(qiáng)的植物進(jìn)行田間三七苗覆蓋試驗(yàn)，觀測其對三七出苗及農(nóng)藝性狀的影響?！窘Y(jié)果】毒力測定結(jié)果顯示，大狼毒對3種病原菌均非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;紫莖澤蘭和黃花蒿對B857和B562非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;苦蒿、艾草和萬壽菊對B857非常敏感，鬼針草對B562非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL。MIC測定結(jié)果表明，萬壽菊、苦蒿和紫莖澤蘭對3種病原菌的抑菌效果較強(qiáng)，其中，萬壽菊對3種病原菌的綜合效果最強(qiáng)，對B562和B2681的MIC低至1.875 mg/mL，對B857的MIC為3.750 mg/mL;苦蒿對B857和B562的MIC為1.875 mg/mL;紫莖澤蘭對B2681的MIC為1.875 mg/mL，對B562和B857的MIC為3.750 mg/mL。田間化感作用試驗(yàn)結(jié)果表明，萬壽菊覆蓋方式的三七出苗率最高，為75.86%，苦蒿覆蓋方式的出苗率最低，為65.43%;3種植物覆蓋方式對三七莖粗、葉長和葉面積無顯著影響（P>0.05），對三七苗株高有顯著促進(jìn)作用（P<0.05，下同）。萬壽菊和苦蒿覆蓋方式致使三七苗葉寬變窄，且與對照差異顯著?！窘Y(jié)論】萬壽菊和紫莖澤蘭對3種三七根腐病致病菌的綜合抑菌效果較強(qiáng)，且對三七生長無顯著化感作用，萬壽菊可直接采收后作為覆蓋物返田利用，紫莖澤蘭需烘干打粉后施用。刃天青微孔板法可作為植物源提取物最小抑菌濃度的測定方法。

關(guān)鍵詞： 三七根腐病;致病菌;毒力測定;抑菌植物篩選;刃天青微孔板法

中圖分類號： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）10-2205-09

Antibacterial plant screening of three pathogenic bacteria

of notoginseng root rot

LI Ji-chao1， YANG Tian-mei1， YANG Shao-bing1， ZUO Ying-mei1， YANG Mei-quan1，ZHANG Meng-yue2， XU Zong-liang1， ZHANG Jin-yu1*

（1Institute of Medicinal Plant， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming? 650231， China; 2School of Life Science and Biopharmaceutics， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang? 110021， China）

Abstract：【Objective】Screening antagonistic plants with strong antiseptic effects on the three pathogenic bacteria of notoginseng root rot， and providing a scientific basis for the development of safe control and control practices for notoginseng root rot. 【Method】For notoginseng root rot three pathogenic bacteria[Pseudomonas sp.（strain No.B857）， Achromobacter marplatensis（strain No.B562）， Candidimonas sp. （strain No.B2681）]， 16 common herbs were selected for ethanol ultrasonic extraction. The anti-bacterial diameter was measured and the virulence regression equation and median lethal concentration（LC50） were calculated by diluting the five concentration gradients with twice dilution method for plate perforation bacteriostatic experiment. The minimum bacteriostatic concentration（MIC） of 16 plants on pathogenic bacteria was observed by Resazurin microporous plate method microporous plate method. The plants with strong bacteriostatic effect were screened for field mulch experiments to observe the effects on notoginseng seedlings and agronomic traits. 【Result】The toxicity results showed that Euphorbia jolkinii Boiss. was very sensitive to all three pathogenic bacteria， and the LC50 was less than 0.100 g/mL. Eupatorium coelestinum L. and Artemisia annua L. were very sensitive to B857 and B562， and the LC50 was less than 0.100 g/mL. In addition， Artemisia lavandulaefolia DC.， Artemisia argyi H. Levl. et Vant. and Tagetes erecta L. were very sensitive to B857， and Bidens pilosa L. was very sensitive to B562， with LC50 less than 0.100 g/mL. The MIC showed that T. erecta， A. lavandulaefolia? and E. coelestinum? had the strongest bacteriostatic effects against three pathogenic bacteria. T. erecta had the strongest comprehensive bacteriostatic effect on three pathogenic bacteria， the MIC to B562 and B2681 was as low as 1.875 mg/mL， and the MIC to B857 was 3.750 mg/mL.MIC of A. lavandulaefolia to B857 and B562 was 1.875 mg/mL. MIC of E. coelestinum to B2681 was 1.875 mg/mL， and the MIC to B562 and B857 was 3.750 mg/mL. The results of the field-based effect test showed that T. erecta? had the highest emergence rate at 75.86% and A. lavandulaefolia had the lowest emergence rate at 65.43%. The three treatments had no significant effect on the stem diameter， leaf length and leaf area（P>0.05） and the plant height was significantly promoted（P<0.05， the same below）. T. erecta and A. lavandulaefolia treatment made the leaf width smaller but was not significantly different from the control. 【Conclusion】T. erecta and E. coelestinum have the strongest antibacterial effect on the three pathogenic bacteria of notoginseng root rot， and have no significant allelopathy effect on notoginseng growth. T. erecta can be directly harvested as mulch return field utilization， E. coelestinum need to be made into dry powder before application. The Resazurin microporous plate method microporous plate method can be used as a method for the determination of the minimum bacteriostatic concentration of plant source extracts.

Key words： root rot of notoginseng; pathogenic bacteria; virulence determination; bacteriostatic plant screening; Resazurin microporous plate method

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen]為五加科人參屬植物，《本草綱目拾遺》中記載，人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者（Guo et al.，2010）。近年來，因其治療范圍廣泛且療效顯著，市場需求量增加，種植面積擴(kuò)大，隨之根腐病問題日益嚴(yán)重，而三七的主要藥用部位為根系，根腐病對三七而言為毀滅性病害，嚴(yán)重者可損失70%以上，甚至絕收，造成三七產(chǎn)量和品質(zhì)降低（繆作清等，2006）。目前三七根腐病防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用易導(dǎo)致“3R”問題（Pang et al.，2012）。植物源殺菌劑來自天然植物資源寶庫，具有選擇性高、環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、低毒、低殘留、促進(jìn)作物生長及提高作物抗病性等特點(diǎn)，滿足綠色防控及安全可持續(xù)理念的要求（Xiong et al.，2016）。因此，篩選對三七根腐病病原菌的抑菌拮抗植物，對三七根腐病植物源殺菌劑的開發(fā)及推廣綠色防控栽培技術(shù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，三七根腐病中假單胞桿菌屬細(xì)菌的致病性最強(qiáng)，較真菌屬常見致病源腐皮廉孢（Fusarium solani）和細(xì)鏈格孢（Alternaria tenuissima）的致病力更強(qiáng)（羅文富等，1997）;假單胞桿菌屬細(xì)菌發(fā)病后期與土壤習(xí)居菌如鐮刀菌、絲核菌等復(fù)合侵染，導(dǎo)致根腐病傳播加重（Lei et al.，2017），因此，抑制病原微生物的生長在緩解三七根腐病的暴發(fā)中起著關(guān)鍵作用。目前關(guān)于植物源抑菌作用的研究已有較多報(bào)道，萬壽菊提取液（王憲青等，2008）、紫莖澤蘭提取物（池水晶等，2013）和黃花蒿殘膏揮發(fā)油（江曉波等，2015）對大腸桿菌均有抑制作用，可造成細(xì)胞膜破裂，或空腔化;鐵莧菜葉和樹皮提取物對沙門氏菌具有抗菌活性（Bahiense et al.，2017）;肉桂提取物對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的形成具有抑制作用（綦國紅等，2018）;香合歡（Banothu et al.，2017）和蕁麻葉（Mzid et al.，2017）活性物質(zhì)可抑制銅綠假單胞菌的生長;牡丹花蕾提取物對銅綠假單胞菌有顯著抑制作用，可改變膜脂肪酸組成和膜蛋白構(gòu)象并破壞膜完整性（周云冬等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】變形菌門（Proteobacteria）是三七連作過程中的優(yōu)勢細(xì)菌門（Dong et al.，2016;Fan et al.，2016），假單胞桿菌、無色桿菌和產(chǎn)堿菌為三七根腐病的主要病原細(xì)菌，目前針對這3種病原菌的抑菌研究及拮抗植物篩選尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取云南常見的16種雜草，通過乙醇超聲法提取粗提物，以假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）、無色桿菌（Achromobacter marplatensis）和產(chǎn)堿菌屬（Candidimonas sp.）3種病原細(xì)菌為目標(biāo)菌，采用平板打孔法和刃天青微孔板法研究植物提取物對3種病原菌的抑菌效果，并通過田間覆蓋試驗(yàn)觀測植物干粉對三七苗生長及化感作用的影響，篩選出對三七根腐病具有強(qiáng)抑菌作用的拮抗植物，為三七根腐病的植物源殺菌劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的3種三七根腐病病原細(xì)菌[假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.，菌株號B857）、無色桿菌（A. marplatensis，菌株號B562）和產(chǎn)堿菌屬（Candidimonas sp.，菌株號B2681）]均由沈陽藥科大學(xué)鑒定提供。供試16種草本植物目錄見表1。NA培養(yǎng)基配方：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2。刃天青染色劑：將刃天青鈉鹽在無菌條件下用無菌水配制成 0.1 g/L的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。主要儀器設(shè)備：BJ-800A粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）、GR60DA電熱壓力蒸汽滅菌鍋[致微（廈門）儀器有限公司]、SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、DHP-9051微生物培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）、LANYI-1000CT超聲波提取機(jī)（上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司）、HGPF-9162（GPX-9162）電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、THZ-052D雙層恒溫?fù)u床（上海博彩生物科技有限公司）、UGTY-1200冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）、UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）和HM-G10葉面積指數(shù)測定儀（山東恒美電子科技有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 提取液制備 將采集的植物材料進(jìn)行清理，去除泥土、壞死的老葉、纏繞物及其他異物，置避光通風(fēng)處自然陰干，于電熱恒溫干燥箱中50 ℃烘干。植物樣品提取參考姬妍茹等（2014）的方法：用粉碎機(jī)將植物粉碎，過40目篩，稱取300 g樣品粉末，倒入500 mL三角瓶內(nèi)，加入500 mL 95%乙醇溶液，靜置7 d，超聲波提取30 min，重復(fù)3次;用乙醇沖洗濾渣3次，合并濾液，70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積不再變化，得到提取物浸膏，浸膏用50%丙酮和5%吐溫-80混合液溶解，稀釋至濃度為0.6 g/mL的母液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 菌懸液制備 將細(xì)菌在培養(yǎng)基上活化，于抑菌活性試驗(yàn)前12 h繼代培養(yǎng)一次，保證細(xì)菌的生長能力達(dá)最強(qiáng)狀態(tài)。無菌條件下吸取1 mL含有細(xì)菌菌株的NA培養(yǎng)基于離心管中，6000 r/min下離心5 min，棄上清液，吸取適量的NaCl（0.9%）生理鹽水于離心管中，輕輕振蕩，制備菌懸液。使用分光光度計(jì)測定菌懸液的OD，設(shè)定分光光度計(jì)的紫外波長為600，選擇OD600為0.08～0.10的菌液，此時(shí)菌懸液濃度約為108 CFU/mL。

1. 2. 3 抑菌圈直徑測定 以平板打孔法進(jìn)行抑菌直徑測定。在無菌條件下每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL培養(yǎng)基，厚度5 mm，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌金屬打孔器（d=6 mm）打成直徑6 mm、深5 mm的4個(gè)小孔，除去孔內(nèi)瓊脂，并用微量移液槍在小孔內(nèi)打入50 μL瓊脂進(jìn)行封底。采用涂布法將細(xì)菌菌懸液涂布于培養(yǎng)基平面。用二倍稀釋法將0.6 g/mL母液提取液稀釋成0.6000、0.3000、0.1500、0.0750和0.0375 g/mL 5個(gè)濃度梯度，各濃度吸取200 μL提取液分別加入到培養(yǎng)基的4個(gè)小孔中，將培養(yǎng)皿置于（25±2）℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果，每處理3次重復(fù)，測量抑菌圈的直徑并記錄，取平均值。

1. 2. 4 最低抑菌濃度（MIC）測定 參考袁高慶等（2011）采用刃天青法測定MIC。取24孔板，每個(gè)小孔中加入400 μL的NA液體培養(yǎng)基，分別加入濃度為0.3000、0.1500、0.0750、0.0375、0.0188和0.0094 g/mL的提取液100 μL，最終配制為30.000、15.000、7.500、3.750、1.875和0.938 mg/mL共6個(gè)梯度的含藥培養(yǎng)基。待凝固后加入100 μL菌懸液，分別用不含藥培養(yǎng)基加入無菌水、菌懸液作為對照，在（25±2）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，向所有孔內(nèi)加入0.1 g/L的刃天青溶液100 μL，（25±2）℃恒溫孵育4 h，每處理3次重復(fù)，顯色后觀察結(jié)果，變?yōu)榧t紫色和紅色判斷為無抑菌效果，不變色的最小濃度為MIC。

1. 2. 5 拮抗植物對田間三七出苗及農(nóng)藝性狀的影響 篩選出抑菌效果強(qiáng)的拮抗植物，烘干打粉后覆蓋于三七苗床表面，設(shè)置面積相等的3個(gè)小區(qū)，播種量一致，以不加拮抗植物的小區(qū)為對照，觀測其化感作用對三七出苗及農(nóng)藝性狀的影響。隨機(jī)劃線30 cm×30 cm的樣方進(jìn)行出苗株數(shù)統(tǒng)計(jì)，換算成出苗率;每小區(qū)統(tǒng)計(jì)30株三七小苗的株高、莖粗、葉長和葉寬，用游標(biāo)卡尺測量;使用葉面積指數(shù)測定儀進(jìn)行葉面積測定。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)以<d：＼飛飛翔＼plugins＼v12pluginwordtranslator＼wordimage＼NF19-0968《三七根腐病3種致病細(xì)菌的抑菌植物篩選研究》_修改稿-60B＼image1.pdf>表示，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.01），用PROBIT回歸分析進(jìn)行毒力回歸方程、致死中濃度（LC50）和決定系數(shù)（R2）計(jì)算，用Excel 2017制表。

2 結(jié)果與分析

2. 1 16種植物提取液對三七根腐病病原菌的毒力測定結(jié)果

2. 1. 1 16種植物提取液對假單胞桿菌B857的毒力測定結(jié)果 由表2可知，黃花蒿、大狼毒、紫莖澤蘭、苦蒿、艾草和曼陀羅對B857非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;土荊芥、大薊和金蕎麥對B857的敏感性較差，其LC50均大于1.000 g/mL;紫蘇對B857無抑菌作用。表2結(jié)果顯示黃花蒿R2為0.990，表明抑菌濃度與抑菌作用間呈顯著線性關(guān)系，隨提取液濃度增加抑菌作用增強(qiáng)。

2. 1. 2 16種植物提取液對無色桿菌B562的毒力測定結(jié)果 由表3可知，大狼毒、紫莖澤蘭、鬼針草、黃花蒿和萬壽菊對B562非常敏感，LC50均小于0.120 g/mL;曼陀羅、金蕎麥、波斯菊和土荊芥對B562不敏感，其LC50均大于0.400 g/mL;土大黃、蓖麻和三分三對B562無抑制作用。表3結(jié)果顯示萬壽菊R2為0.996，表明抑菌濃度與抑菌作用間呈顯著線性關(guān)系，隨提取液濃度增加抑菌作用增強(qiáng)。

2. 1. 3 16種植物提取液對產(chǎn)堿菌B2681的毒力測定結(jié)果 由表4可知，大狼毒對B2681非常敏感，LC50為0.089 g/mL，小于0.100 g/mL;黃花蒿、萬壽菊和紫莖澤蘭抑菌效果次之，LC50均小于0.200 g/mL;土大黃、紫蘇和金蕎麥對B2681無抑制作用。表4結(jié)果顯示黃花蒿R2為0.994，表明抑菌濃度與抑菌作用間呈顯著線性關(guān)系，隨提取液濃度增加抑菌作用增強(qiáng)。

2. 2 16種植物提取液對3種病原菌的MIC

2. 2. 1 16種植物提取液對假單胞桿菌B857的MIC

表5結(jié)果顯示，苦蒿對B857的MIC為1.875 mg/mL，抑菌效果最強(qiáng);紫莖澤蘭、土大黃、大狼毒、萬壽菊和黃花蒿對B857的抑菌效果次之，MIC為3.750 mg/mL;鬼針草、艾草、金蕎麥和波斯菊對B857的抑菌效果較弱，MIC為15.000 mg/mL。

2. 2. 2 16種植物提取液對無色桿菌B562的MIC

表6結(jié)果顯示，苦蒿、艾草和萬壽菊對B562的抑菌作用最強(qiáng)，MIC為1.875 mg/mL;紫莖澤蘭的抑菌效果次之，MIC為3.750 mg/mL;土大黃、蓖麻、鬼針草、紫蘇、三分三和大薊對B562的抑菌效果最弱，MIC均大于30.000 mg/mL。

2. 2. 3 16種植物提取液對產(chǎn)堿菌B2681的MIC

表7結(jié)果顯示，紫莖澤蘭和萬壽菊對B2681的抑菌效果最強(qiáng)，MIC為1.875 mg/mL;蓖麻、苦蒿和大薊對B2681的抑菌效果次之，MIC為7.500 mg/mL;土大黃、鬼針草、紫蘇、金蕎麥和波斯菊對B2681的抑菌效果較弱，MIC均大于30.000 mg/mL。

2. 3 田間化感作用試驗(yàn)結(jié)果

綜合16種植物提取液對三七根腐病病原菌的MIC，紫莖澤蘭、苦蒿和萬壽菊對三七根腐病病原菌的綜合抑菌效果較強(qiáng)。采收紫莖澤蘭、苦蒿和萬壽菊烘干打粉后覆蓋于三七苗床表面，觀察3種植物處理對三七出苗及農(nóng)藝性狀的影響，結(jié)果（表8）表明，萬壽菊覆蓋方式的三七出苗率最高，為75.86%，而苦蒿覆蓋方式影響了三七出苗，出苗率最低，為65.43%，且與萬壽菊覆蓋方式差異顯著（P<0.05，下同）;3種植物覆蓋方式對三七莖粗、葉長和葉面積無顯著影響（P>0.05）;3種植物覆蓋方式對三七苗株高有顯著促進(jìn)作用，其中，萬壽菊覆蓋方式的三七株高顯著高于其他植物覆蓋方式;萬壽菊和苦蒿覆蓋方式致使三七苗葉寬變窄，且與對照差異顯著。綜上所述，萬壽菊和紫莖澤蘭對三七生長無抑制的化感作用，可作為三七田間覆蓋物施用，能促進(jìn)三七出苗且不影響其農(nóng)藝性狀，對三七根腐病病原菌也有較強(qiáng)的抑制作用。

3 討論

天然植物在漫長的進(jìn)化過程中合成了許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜新穎的次生代謝產(chǎn)物，在抗癌、抗菌等方面顯示出巨大潛力（王婧等，2018）。云南省植物資源豐富，就近選擇廉價(jià)、易得的常見草本植物在三七根腐病防控中加以利用，具有一定的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。本研究中，萬壽菊對3種三七根腐病致病菌的綜合抑菌效果最強(qiáng)，對無色桿菌B562和產(chǎn)堿菌B2681的MIC低至1.875 mg/mL，對B857的MIC為3.750 mg/mL，同時(shí)顯著提高三七的出苗率和株高，具有較高的應(yīng)用潛力。前人研究顯示，萬壽菊提取物具有廣譜殺滅病原菌的活性（Saani et al.，2018），對革蘭氏陰性菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用（王憲青等，2008）。目前，對萬壽菊的抑菌活性成分以葉黃素研究最多，主要是α-三連噻吩及其衍生物，對大腸桿菌和青霉菌的抑制效果明顯（李曼，2014）;另外，5種生物堿（劉佳斌等，2007）、7種黃酮類（劉佳斌等，2008）和精油類（范志宏等，2011）成分對西瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用，可使病菌的果膠酶活性降低，呼吸強(qiáng)度提高，細(xì)胞膜通透性增大。萬壽菊對三七根腐病也有較好的生防潛力，其根部提取物抑菌活性最強(qiáng)，可使鐮刀菌酸（FA）發(fā)生鈍化，體內(nèi)抗氧化保護(hù)酶提高（范志宏等，2010），其殺菌素水乳劑可產(chǎn)生降解尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁的酶類，使侵染活性下降，從而起到抑菌和保護(hù)植物的作用（孫芬變和王金勝，2012）。 因此，萬壽菊可作為三七根腐病綠色防治的植物源應(yīng)用推廣，可直接采收后作為田間覆蓋物使用，或制成提取液澆灌苗床用于根腐病防治，或加入連作土中作為降低病原菌的土壤調(diào)理劑使用。

苦蒿和黃花蒿屬于菊科蒿屬，本研究中苦蒿抑菌作用較強(qiáng)，對B857的毒力較高，對B857和B562的MIC低至1.875 mg/mL。前人研究表明，苦蒿對革蘭氏陽性菌有較好的抑制效果（王寅生等，2019），自然條件下蒿屬植物通過莖葉揮發(fā)和淋溶、土壤殘?bào)w腐解和根系分泌等方式向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)，進(jìn)而抑制微生物的生長繁殖（趙雅萌等，2018）。但本研究的田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦蒿降低了三七的出苗率，對三七的生長造成影響，可進(jìn)一步研究其抑菌成分，為植物源殺菌劑產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

本研究中，紫莖澤蘭對B857和B562的毒力最高，LC50均小于0.030 g/mL;對B2681的MIC為1.875 mg/mL，對B857和B562的MIC為3.750 mg/mL。Sachin等（2010）、Aditi等（2013）研究表明，紫莖澤蘭提取物具有廣譜殺滅病原菌的活性，但紫莖澤蘭作為入侵物種，其根、莖和種子皆可再生繁殖，不能直接返田使用，本研究將紫莖澤蘭烘干打粉后施用，對三七生長無顯著抑制作用，可作為三七根腐病的田間覆蓋物推廣應(yīng)用。紫莖澤蘭的倍半萜類是研究最多的抑菌物質(zhì)，杜松-3-烯-2，7-二酮等對立枯絲核菌有很強(qiáng)的抑菌效果（Kundu et al.，2013），9-羰基-10Hβ澤蘭酮和9-羰基-10，11去氫澤蘭酮加速了鏈格孢菌和腐皮鐮孢菌菌絲和分生孢子的衰老凋亡，破壞卵菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞器解體，DNA聚合酶的活性下降影響病原菌細(xì)胞內(nèi)部代謝和自我基因的復(fù)制（Liu et al.，2016）。因此，紫莖澤蘭的化學(xué)組分在抑菌作用上有巨大潛力，可開發(fā)為植物源殺菌劑進(jìn)行間接利用，兼顧對入侵雜草的科學(xué)防除，具有較高的生態(tài)效益。

刃天青（Resazurin）是非熒光染料，在活細(xì)胞的多種還原酶作用下可將藍(lán)色的刃天青還原成粉紅色的熒光染料——試鹵靈（Resorufin）。本研究在預(yù)試驗(yàn)中試用了標(biāo)準(zhǔn)MH液體稀釋法、平板劃線培養(yǎng)法和活菌計(jì)數(shù)法，由于植物源提取物顏色深，較多呈墨綠色，因而對需要觀測的液體稀釋法和活菌計(jì)數(shù)法使用受限。刃天青微孔板顯色法是利用活細(xì)胞線粒體酶可將藍(lán)色刃天青還原為粉紅色的原理，通過簡單的顏色區(qū)別來判定MIC終點(diǎn)，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）簡便節(jié)約，提取物用量僅需100 μL;（2）準(zhǔn)確，排除了人為計(jì)數(shù)主觀因素干擾;（3）快速，僅需4 h孵育得出結(jié)果;（4）靈敏，對低濃度菌液也能快速顯色。本研究顯示，刃天青微孔板法可清晰辨別最小抑菌濃度，避免了提取物顏色深難辨別的難題，可作為植物源提取物最小抑菌濃度的最佳測定方法。

4 結(jié)論

萬壽菊和紫莖澤蘭對3種三七根腐病致病菌的綜合抑菌效果較強(qiáng)，且對三七生長無顯著的化感作用，可作為三七根腐病綠色防治的植物源推廣應(yīng)用，其中，萬壽菊可直接采收后作為覆蓋物返田利用，紫莖澤蘭需烘干打粉后施用。刃天青微孔板法可作為植物源提取物最小抑菌濃度的測定方法。

參考文獻(xiàn)：

池水晶，寶珠鳴，王艷紅，羅夙醫(yī)，李玉鵬，寶福凱，柳愛華. 2013. 紫莖澤蘭提取物的體外抗菌活性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（18）：73-74. [Chi S J，Bao Z M，Wang Y H，Luo S Y，Li Y P，Bao F K，Liu A H. 2013. Antibacterial activity in vitro of Eupatorium adenophorum extracts[J].Guangdong Agricultural Sciences，40（18）：73-74.]

范志宏，郭春絨，王金勝. 2010. 萬壽菊根提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌活性成分及作用機(jī)理研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，40（2）：195-201. [Fan Z H，Guo C R，Wang J S. 2010. Active antifungal component of extracts from Tagetes patula root against Fusarium oxyspo-rum f. sp. niveum and its mechanism[J]. Acta Phytopathologica Sinica，40（2）：195-201.]

范志宏，郭春絨，王金勝. 2011. 萬壽菊精油殺菌素對西瓜枯萎病菌的抑菌作用及對西瓜幼苗的影響[J]. 北方園藝，（8）：9-14. [Fan Z H，Guo C R，Wang J S. 2011. Studies on antifungal activity of marigold essential oil fungicide against Fusarium oxysporum f. sp. niveum[J]. Northern Horticulture，（8）：9-14.]

姬妍茹，楊慶麗，王瑩瑩，石杰，董艷，劉玉，張正海，王月明，高媛，潘靜，劉宇峰. 2014. 龍葵等19種野生植物提取物的離體抑菌活性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（25）：303-307. [Ji Y R，Yang Q L，Wang Y Y，Shi J，Dong Y，Liu Y，Zhang Z H，Wang Y M，Gao Y，Pan J，Liu Y F. 2014. Studies on 19 plant extracts including Solanum nigrum for antifungal activity in vitro[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（25）：303-307.]

江曉波，王萌，張麗，劉利萍，張利. 2015. 黃花蒿殘膏的揮發(fā)性成分分析及其抑菌和抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，36（14）：103-106. [Jiang X B，Wang M，Zhang L，Liu L P，Zhang L. 2015. Study on the chemical. composition，antibacterial and antioxidant activity of volatile components in residues from Artemisia annua L.[J]. Science and Technology of Food Industry，36（14）：103-106.]

李曼. 2014. 萬壽菊中葉黃素和α-三連噻吩的提取及α-三連噻吩抑菌研究[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué). [Li M. 2014. Research on the extraction of lutein and α-Triplethiophene from marigold and antibacterial activity of α-Triple-thiophene[D]. Daqing：Heilongjiang Bayi Agricultural Uni-versity.]

劉佳斌，宋翔，王金勝. 2008. 萬壽菊根部提取物黃酮對西瓜枯萎病菌抑制作用研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），28（1）：37-39. [Liu J B，Song X，Wang J S. 2008. Studies on bioactive flavone from Tagetes root against watermelon Fusarium Wilt[J]. Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science Edition），28（1）：37-39.]

劉佳斌，蘇煒，王金勝. 2007. 萬壽菊根部生物堿類提取物抑菌活性成分的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（3）：746-747.[Liu J B，Su W，Wang J S. 2007. Research on the bacteriostasis active constituent in alkaliod from Tagetes erecta root extraction[J]. Journal of Anhui Agricultural Scien-ces，35（3）：746-747.]

羅文富，喻盛甫，賀承福，李忠義，王朝梁，崔秀明. 1997. 三七根腐病病原及復(fù)合侵染的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，14（2）：86-92. [Luo W F，Yu S F，He C F，Li Z Y，Wang C L，Cui X M. 1997. On the combined infection of root rot pathogens on Panax notoginseng[J]. Acta Phytopathologica Sinica，14（2）：86-92

繆作清，李世東，劉杏忠，陳昱君，李云華，王勇，郭榮君，夏振遠(yuǎn)，張克勤. 2006. 三七根腐病病原研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（7）：1371-1378. [Miao Z Q，Li S D，Liu X Z，Chen Y J，Li Y H，Wang Y，Guo R J，Xia Z Y，Zhang K Q. 2006. The causal microorganisms of Panax notoginseng root rot disease[J]. Scientia Agricultura Sinica，39（7）：1371-1378.]

綦國紅，陳金輝，陳貴堂，楊志萍，王海翔，王歲樓. 2018. 肉桂提取物對銅綠假單胞菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，37（8）：807-811. [Qi G H，Chen J H，Chen G T，Yang Z P，Wang H X，Wang S L. 2018. Inhibition of biofilm formation in Pseudomonas aeruginosaby cinnamon extract[J]. Journal of Food Science and Biotechnology，37（8）：807-811.]

孫芬變，王金勝. 2012. 萬壽菊殺菌素水乳劑對尖孢鐮刀菌侵染活性的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（10）：1085-1087.[Sun F B，Wang J S. 2012. The influence of aqueous emulsion（AE） of tageteson Fusarium oxysporum infect activity[J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences，40（10）：1085-1087.]

王婧，刁小龍，陳曉蘭，王帥兵，陳海峰，張龍. 2018. 抗菌肽Indolicidin的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，34（4）：949-954.[Wang J，Diao X L，Chen X L，Wang S B，Chen H F，Zhang L. 2018. Research progress of antibacteial peptides Indolicidin[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，34（4）：949-954.]

王憲青，劉妍妍，王秋月. 2008. 萬壽菊提取物的抑菌作用研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），（10）：8-10. [Wang X Q，Liu Y Y，Wang Q Y. 2008. Study on anti-bacterial activity of extracts from marigold[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing，（10）：8-10.]

王寅生，聶亮，方亮，唐宇佳，雷雨，金偉瓊，唐自鐘，陳惠. 2019. 金龍膽草提取液體外抑菌活性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，38（5）：2200-2206. [Wang Y S，Nie L，F(xiàn)ang L，Tang Y J，Lei Y，Jin W Q，Tang Z Z，Chen H. 2019. In vitro analysis on antibacterial activity of extract from Conyza blinii H. Lév[J]. Genomics and Applied Bio-logy，38（5）：2200-2206.]

袁高慶，黎起秦，秦健，葉云峰，林緯. 2011. 噻唑藍(lán)法和刃天青法檢測植物成分對兩種病原細(xì)菌的抑菌活性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，38（4）：306-312. [Yuan G Q，Li Q Q，Qin J，Ye Y F，Lin W. 2011. Methythiazol tetrazolium and resazurin assays for detection of antibacterial activities of plant constituents against two bacterial pathogens[J]. Acta Phytophylacica，38（4）：306-312.]

趙雅萌，馬玉楠，陳傳嬌，程永現(xiàn)，董鮮，徐福榮. 2018. 黃花蒿葉水提物對三七根際尖孢鐮刀菌生長的抑制作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，30（3）：373-378. [Zhao Y M，Ma Y N，Chen C J，Cheng Y X，Dong X，Xu F R. 2018. Inhibitory effects of water soluble extract from Artemisia annual eaves on the growth of rhizosphere Fusarium oxysporum associated with Panax notoginseng[J]. Natural Product Research and Development，30（3）：373-378.]

周云冬，章漪玲，宗紅，陸信曜，諸葛斌，沈微. 2019. 牡丹花蕾提取物對銅綠假單胞菌的抑菌活性及其機(jī)理[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，45（13）：92-97. [Zhou Y D，Zhang Y L，Zong H，Lu X Y，Zhuge B，Shen W. 2019. Antibacterial activity and mechanism of Paeonia suffruticosa Andr. buds extract against Pseudomonas aeruginosa[J]. Food and Fermentation Industries，45（13）：92-97.]

Aditi K，Supradip S，Suresh W，Najam A S，Jitendra K，Kannepalli A. 2013. Cadinene sesquiterpenes from Eupato-rium adenophorum and their antifungal activity[J]. Journal of Environmental Science and Health（Part B），48（6）：516-522.

Bahiense B J，Marques F M，F(xiàn)igueira M M，Vargas T S，Kondratyuk T P. 2017. Potential anti-inflammatory，antioxidant and antimicrobial activities of Sambucus australis[J]. Pharmaceutical Biology，55（1）： 991-997.

Banothu V，Neelagiri C，Adepally U，Lingam J，Bommareddy K. 2017. Phytochemical screening and evaluation of in vitro antioxidant and antimicrobial activities of the indi-genous medicinal plant Albizia odoratissima[J]. Pharmaceutical Biology，55（1）： 1155-1161.

Dong L L，Xu J ，F(xiàn)eng G Q，Li X W，Chen S L. 2016. Soil bacterial and fungal community dynamics in relation to Panax notoginseng death rate in a continuous cropping system[J]. Scientific Reports，6： 31802.

Fan Z Y，Miao C P，Qiao X G，Zheng Y K，Chen H H，Chen Y W，Xu L H，Zhao L X，Guan H L. 2016. Diversity，distribution，and antagonistic activities of rhizobacteria of Panax notoginseng[J]. Journal of Ginseng Research，40（2）： 97-104.

Guo H B，Cui X M，An N，Cai G P. 2010.Sanchi ginseng （Panax notoginseng（Burkill） F.H. Chen） in China： Distribution，cultivation and variations[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，57 （3）： 453-460.

Kundu A，Saha S，Walia S，Ahluwalia V，Kaur C. 2013. Antioxidant potential of essential oil and cadinene sesquiterpenes of Eupatorium adenophorum[J]. Toxicological and Environmental Chemistry，95（1）： 127-137.

Lei F J，F(xiàn)u J F，Zhou R J，Wang D，Zhang A H，Ma W L，Zhang L X. 2017. Chemotactic response of ginseng bacterial soft-rot to ginseng root exudates[J]. Saudi Journal of Biological Sciences，24（7）： 1620-1625.

Liu X，Ouyang C，Wang Q，Li Y，Yan D，Yang D，Guo M，Cao A. 2016. Eval uation of antibacterial and antifungal properties of 9-oxo-10，11-dehydroageraphorone extracted from Eupatorium adenophorum[J]. Journal of Plant Disea-ses and Protection，123： 93-99.

Mzid M，Ben K S，Ben S M，Regaieg W，Rebai T. 2017. Antioxidant and antimicrobial activities of ethanol and aqueous

extracts from Urtica urens[J]. Pharmaceutical Biology，

55（1）： 775-781.

Pang Y P，Brimijoin S，Ragsdal D W，Zhu K Y，Suranyi R. 2012. Novel and viable acetylcholinesterase target site for developing effective and environmentally safe insecticides[J]. Curr Drug Targets，13（4）： 471-482.

Saani M，Lawrence R，Lawrence K. 2018. Eval uation of pigments from methanolic extract of Tagetes erecta and Beta vulgaris as antioxidant and antibacterial agent[J]. Natural Product Research，32（10）： 1208-1211.

Sachin C，Arvind N，Vinesh D. 2010. The study of in vitro antimicrobial activity and phytochemical anal ysis of some medicinal plants in Chamoli Garhwal Region[J]. Pharmacognosy Journal，2（12）：481-485.

Xiong X，Man Y，F(xiàn)u L L，Ma Z Q，Zhang X. 2016. The botanical pesticide derived from Sophora flavescens for controlling insect pests can also improve growth and deve-lopment of tomato plants[J]. Industrial Crops and Pro-ducts，92：13-18.

（責(zé)任編輯 麻小燕）