超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析紫薯中15種酚酸類組分

劉文靜 黃彪 林香信 方靈 吳建鴻 李巍 吳妙鴻

摘要：【目的】運(yùn)用超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Ms/Ms）分析不同品種紫薯中酚酸類組分及含量，為紫薯中酚酸類組分的提取、分析提供理論依據(jù)。【方法】建立超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)紫薯中15種酚酸類組分的方法，分析8種不同品種紫薯中酚酸類組分的含量。樣品經(jīng)甲醇冰溶液超聲提取后，使用WatersT3c18色譜柱（250mm×4.6mm，5um），以0.1%（v/v）甲酸-5mmol·L乙酸銨水溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，負(fù)離子掃描方式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式測(cè)定?！窘Y(jié)果】在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，15種酚酸類組分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9956～0.9997，方法檢出限和定量限分別為0.3～5.8ug·L（S/N≥3）和1.0～15.2ug·L（S/N≥10】;加標(biāo)試驗(yàn)平均回收率73.3%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.8%～8.9%?！窘Y(jié)論】在所分析的紫薯樣品中共檢出5種酚酸類組分，含量0.102～1698.490mg.kg，其中綠原酸含量最高，對(duì)香豆酸含量最低。該法靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于紫薯中酚酸類組分的定性定量分析。

關(guān)鍵詞：紫薯;酚酸類組分;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：TS 215文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）10-1203-08

0引言

【研究意義】紫薯（Purple sweetpotato）又名黑薯，是甘薯的一個(gè)優(yōu)良新品種，其肉質(zhì)部分呈紫色或者紫紅色。據(jù)報(bào)道，紫薯含有多種營(yíng)養(yǎng)功能成分：如淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、粗脂肪、多酚和花色苷等。紫薯花色苷和多酚經(jīng)研究表明具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血壓等生理功效，目前對(duì)紫薯功能性成分的研究主要集中在對(duì)紫薯花色苷成分分析，而對(duì)同樣具有良好生理活性的紫薯酚酸類組分的報(bào)道則相對(duì)較少?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前報(bào)道測(cè)定植物性農(nóng)產(chǎn)品中酚酸類組分的方法有毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（（high performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）。毛細(xì)管電泳法靈敏度較低，高效液相色譜法靈敏度比毛細(xì)管電泳法高，但是對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品分離效果不夠理想，且分析時(shí)間較長(zhǎng)。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法是近年興起的檢測(cè)技術(shù)手段，利用離子通過(guò)不同通道技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)相近物質(zhì)有效分離，分離時(shí)間短，靈敏度低，效果好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析紫薯功能性成分，所需樣品量少，時(shí)間短，可以同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)多種組分，而利用此技術(shù)分析紫薯功能性營(yíng)養(yǎng)功能成分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以福建地區(qū)采集的8份不同品種的紫薯樣品為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，運(yùn)用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立了15種酚酸類組分的檢測(cè)方法，分析了不同品種紫薯中酚酸類組分及含量，旨在為紫薯中酚酸類組分的提取、分析提供理論依據(jù)，為紫薯新品種的選育與開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器設(shè)備：UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）;Xevo TQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)Waters公司）;Millipore Direct-Q5超純水儀（美國(guó)Millipore公司）;SYG-2水浴恒溫振蕩器（常州朗越儀器有限公司）;樣品均質(zhì)器（德國(guó)IKA公司）;XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

供試紫薯樣品：龍紫4號(hào)、龍紫6號(hào)、莆紫薯18號(hào)、莆紫薯3號(hào)、福寧紫3號(hào)、福寧紫4號(hào)、福薯9號(hào)、福薯24號(hào)，所有紫薯樣品由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供，采自福建省龍巖市連城縣家庭農(nóng)場(chǎng)。

試驗(yàn)試劑：水楊酸（salicylic acid）、對(duì)羥基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid）、2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid）、3，5二羥基苯甲酸（3，5-Dihydroxybenzoic acid）、3，4，5-三羥基苯甲酸（3，4，5-Trihydroxybenzoic acid）、綠原酸（Chlorogenic acid）、異綠原酸A（Isochlorogenic acid A）、香草酸（Vanillicacid）、咖啡酸（caffeic acid）、丁香酸（syringate）、對(duì)香豆酸（Coumalic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、芥子酸（sinapic acid）、2-羥基肉桂酸（2-Hydrocycinnamic-acid）、3-羥基肉桂酸等標(biāo)準(zhǔn)品（2Hydrocycirmamicacidl（純度≥97%，南京道斯夫生物技術(shù)股份限公司）;甲醇（色譜純，美國(guó)Merck公司）、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）、乙酸銨（LC-MS級(jí)，美國(guó)Waters公司）、甲酸（LC-MS級(jí)，美國(guó)Waters公司）;試驗(yàn)用水為Millipore Direct-Q5超純水儀制備，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1超高效液相色譜條件Waters T3C18色譜柱（Ф1.8um，2.1mm//1×50mm），柱溫：30.0%;流速：0.2mL.min;進(jìn)樣量：4ul;流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序：0～4min，90%～10%A;4～6min，維持10%A;5～8min，10%～50%A;8～9min，50%～90%A;9～10min，維持10%A。

1.2.2質(zhì)譜條件電噴霧離子化負(fù)離子（ESI-）模式;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式;毛細(xì)管電壓：1.5kV;錐孔氣流：氮?dú)?，流?0L.h;脫溶劑溫度：150°C，流速800L.h;離子源溫度：150°C;霧化氣壓力：0.28MPa;碰撞氣：高純氬氣。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸等15種標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，分別用甲醇定容至10.00mL，得到各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000mg·L的單標(biāo)母液，標(biāo)準(zhǔn)品母液置于20～C冰箱中保存，試驗(yàn)時(shí)取母液配制成10mg·L的單標(biāo)中間液，根據(jù)需要用甲醇配成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作儲(chǔ)備溶液，于-20°C冰箱中保存。用于制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不同濃度的混標(biāo)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4樣品前處理

紫薯中活性成分的提取參考蔡湛等的方法稍加改進(jìn)，稱取0.500g磨碎的紫薯鮮樣加入5mL70%的甲醇溶液于棕色玻璃管中，70℃水浴中振蕩提取30min，提取后自然冷卻至室溫，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，于5000r·rain轉(zhuǎn)速下離心5min，離心結(jié)束后上清液全部轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶。殘?jiān)偌尤?mL 70%甲醇溶液提取1次，重復(fù)以上操作。合并提取液定容至10.00mL，搖勻，0.45um濾膜過(guò)濾，濾液待上機(jī)分析用。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

在以往測(cè)定植物性樣品的總酚報(bào)道中，多選用乙醇一水或者甲醇水為提取酚類物質(zhì)的溶劑。超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜的流動(dòng)相體系多為甲醇一水或者乙腈一水，為檢測(cè)過(guò)程中減少溶劑效應(yīng)對(duì)峰型的影響，因此選擇甲醇.水作為提取溶劑，試驗(yàn)中比較了不同濃度甲醇溶液提取效率的影響，結(jié)果表明以70%的甲醇溶液為提取劑時(shí)測(cè)得的提取液中總酚含量最高（表2），總酚測(cè)定采用稍加改進(jìn)的Folin-Cioealteu方法。

2.2流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中考察了以甲醇一水和乙腈一水作為流動(dòng)相以及在流動(dòng)相中添加甲酸、乙酸銨對(duì)目標(biāo)化合物離子色譜峰峰型及響應(yīng)信號(hào)的影響。試驗(yàn)表明：采用0.1%（V/V）甲酸.5mmol·L乙酸銨水溶液和乙腈為流動(dòng)相，在負(fù)離子掃描模式下，酚酸類組分有良好的峰形且相對(duì)于不加乙酸銨的流動(dòng)相有更好的響應(yīng)強(qiáng)度。所分析的酚酸類組分，大都具有酚羥基官能團(tuán)或同時(shí)含有羥基與羧基結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出一定的弱酸性。在流動(dòng)相中加入乙酸銨，有利于所分析的目標(biāo)化合物中氫離子的解離，形成目標(biāo)負(fù)離子，增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào);而甲酸的加入有利于抑制酚酸類組分與色譜柱的靜電作用，減少拖尾現(xiàn)象，改善峰形。因此，試驗(yàn)中采用0.1%（v/v）甲酸-5mmol.L乙酸銨水溶液和乙腈作為流動(dòng)相。

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Waters三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括選擇各化合物的母離子、子離子、錐孔電壓（CV）、碰撞能量（cE）等參數(shù)的確定。配制500.0ug·L的15種酚酸類組分單標(biāo)溶液，流動(dòng)相為0.1%（V/V）甲酸.5mm01.L乙酸銨水溶液：流動(dòng)相B（乙腈）=50%：50%，經(jīng)質(zhì)譜直接進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用電噴霧正離子模式（ESI）和負(fù)離子模式（ESr）通過(guò)自動(dòng)調(diào)諧的方式分別對(duì)各化合物單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子、子離子掃描。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正離子掃描模式，在負(fù)離子掃描模式下更容易得到穩(wěn)定的母離子及子離子，響應(yīng)信號(hào)更好。

2.4色譜柱的選擇

試驗(yàn)中比較了分別使用Waters BEH C18柱和Waters T3C18柱，在選用甲醇.水和乙腈.水不同流動(dòng)相體系對(duì)15種酚酸類組分的保留和分離情況。發(fā)現(xiàn)Waters T3C18對(duì)極性的酚酸類組分的分離效果更好，具有更窄的峰型，尤其是對(duì)于對(duì)羥基苯甲酸及3，5-二羥基苯甲酸等化合物，區(qū)別更為明顯。窄的峰型更有利于分析中的準(zhǔn)確定量，因此在試驗(yàn)中選用Waters T3C18作為分離柱。

2.5方法評(píng)價(jià)

在優(yōu)化的條件下，考察了15種目標(biāo)化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及在基質(zhì)中的加標(biāo)回收率情況。結(jié)果顯示，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x，ug·L）與對(duì)應(yīng)的峰面積∽呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9956～0.9997。分別依據(jù)特征離子色譜峰色譜信號(hào)的3倍信噪比（S/N≥3）和10倍的信噪比確定方法的檢出限和定量限（S/N≥10），方法的檢出下限為0.5ug·L～5.8ug·L和定量限分別為1.0ug·L～15.2ug·L（表3），能滿足定量分析的要求。

根據(jù)樣品中各酚酸類組分的含量情況，根據(jù)各化合物的線性范圍，確定在樣品中合適的加標(biāo)量。對(duì)未檢出的組分在定量限水平參考GB/T 27404中要求，按照優(yōu)化的試驗(yàn)條件測(cè)定，進(jìn)行低、中、高水平的加標(biāo)，重復(fù)6次。樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)平均回收率76.3%～96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.6%～7.9%，分析方法準(zhǔn)確度較好（表4）。

2.6不同紫薯樣品中活性成分含量的檢測(cè)分析

收集福建產(chǎn)區(qū)8種不同品種的紫薯樣品為試驗(yàn)材料，按1.3所述樣品前處理方法得樣品待測(cè)溶液，運(yùn)用所建立的方法對(duì)樣品待測(cè)液中的酚酸類組分含量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量為4ul。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。在所收集的紫薯樣品中共檢出5種酚酸類組分，分別為香草酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、異綠原酸A。紫薯樣品中酚酸類組分含量為0.102～1698.490mg·kg，具體含量見(jiàn)表5。結(jié)果表明：在紫薯樣品中含量最高的為綠原酸，含量范圍291.439～1698.490mg·kg，綠原酸的含量范圍與徐柯等報(bào)道的較為接近;其次為異綠原酸A;含量最低的為對(duì)香豆酸。

3討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)色譜.質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析紫薯中15種酚酸類組分檢測(cè)方法。收集了福建產(chǎn)區(qū)8份不同品種的紫薯樣品，運(yùn)用所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。在所分析的紫薯樣品中共檢出5種酚酸類組分，含量在0.102～1698.490mg'kg，在所有的紫薯樣品中，相對(duì)于其他酚酸組分，綠原酸的含量均為最高，最高含量為1698.490mg·kg，最低含量為291.439mg·kg;其次為異綠原酸A，最高含量為202.682mg.kg，最低含量為34.099mg;對(duì)香豆酸含量為最低。因?yàn)槠贩N的差別，各酚酸類組分的含量表現(xiàn)出一定的差異，在所有的樣品中，福寧紫3號(hào)紫薯樣品中，酚酸的含量為最高。建立的方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于紫薯中酚酸類組分的定性定量分析，可為紫薯的資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。