具群體感應淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

童文濤 陳彪 彭孟凡 趙禎 肖翎 宋增福 張慶華

摘要：【目的】優(yōu)化具群體感應淬滅作用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）T-1株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，進一步提高其產(chǎn)孢量，為今后開發(fā)地衣芽孢桿菌制劑（抗菌益生菌）打下基礎。【方法】在搖床發(fā)酵條件下，采用單因素試驗篩選T-1株的最佳培養(yǎng)條件，并確定影響發(fā)酵菌液活菌含量的主要影響因素。根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，篩選出影響芽孢產(chǎn)量的2個最顯著因素，以最陡爬坡試驗確定其響應中心點和最佳濃度范圍，然后通過Box-Behnken中心組合試驗和響應面分析獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件?！窘Y果】T-1株的最適發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、鹽度0.5%和pH 6.0，在此條件下T-1株芽孢產(chǎn)量與培養(yǎng)時間呈正相關，在培養(yǎng)48～60 h期間其芽孢產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。在對T-1株芽孢產(chǎn)量影響較大的6個因子[X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床轉速）和X6（接種量）]中，X2（可溶性淀粉）對T-1株芽孢產(chǎn)量的影響達顯著水平（P<0.05），X5（搖床轉速）的影響達極顯著水平（P<0.01），其他因子的影響均不顯著（P>0.05）。T-1株的最佳培養(yǎng)基為可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%和CaCl2 0.5%，在搖床轉速218 r/min的培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前采用初始基礎培養(yǎng)基的芽孢產(chǎn)量提高6.25倍?！窘Y論】具群體感應淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前明顯提高，且延長菌株生長的穩(wěn)定期，加上優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對廉價且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)模化生產(chǎn)上推廣應用。

關鍵詞： 地衣芽孢桿菌;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;單因素試驗;響應面分析法

中圖分類號： S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2559-08

Optimization of culture media and fermentation conditions of quorum sensing quenching bacteria Bacillus licheniformis T-1

TONG Wen-tao1，2， CHEN Biao1，2， PENG Meng-fan1，2， ZHAO Zhen1，2，

XIAO Ling1，2， SONG Zeng-fu1，2*， ZHANG Qing-hua1，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 2National Pathogen Collection for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Education，

Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】To optimize the culture medium and fermentation conditions of Bacillus licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching effect， further increase its spore production，lay the foundation for future development of Bacillus licheniformis preparations（antibacterial probiotics）. 【Method】The optimum culture condition of T-1 bacterial strain was screened and chosen in the way of single factor method under the shaking flask fermentation condition， and the main influencing factors affecting the live bacteria content of the fermentation broth were determined. According to the results of Plackett-Burman test， the two most significant factors affecting spore yield were screened. The steepest climbing test was used to determine the response center point and the optimal concentration range of the two factors， and then the box-Behnken center combination test and response surface were used to obtain the best fermentation culture conditions. 【Result】The optimal culture temperature was 37 ℃， the optimum growth salinity was 0.5% and the optimum growth pH was 6. Under this condition， the spore formation was in positive correlation with culture time. The sporulation rate were stable between 48-60 h. Among the six factors that had great impact on the spore yield of T-1 strains[X1（molasses）， X2（soluble starch）， X3（yeast extract powder）， X4（CaCl2）， X5（shaker speed）， and X6（inoculation amount）]，the effect of X2（soluble starch） on the spore yield of T-1 strain reached a significant level（P<0.05）， the effect of X5（shaker speed） reached an extremely significant level（P<0.01）， and the effects of other factors were not significant（P>0.05）. The optimal medium for T-1 strain was 1.11% soluble starch， 0.3% yeast extract powder and 0.5% CaCl2. Under the culture conditions of 218 r/min shaker speed， the spore yield of the T-1 strain was higher than that of the original basic medium before optimization. The spore yield increased by 6.25 times. 【Conclusion】Under the optimized fermentation conditions， B. licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching can increase its spore yield greatly compared with the original method. Its stable period of growth also prolongs. Since the optimized media use cheap but high efficient raw materials， the fermentation costs can be reduced. This method can be applied in large-scale production in the future.

Key words： Bacillus licheniformis; media; fermentation conditions; single factor methodology; response surface methodology

0 引言

【研究意義】細菌的群體感應是其自體誘導現(xiàn)象，細菌通過感知群體感應信號分子，調控毒力因子表達及生物膜形成等生理現(xiàn)象（許玉彬等，2013）。群體感應淬滅可通過降解群體感應信號分子或抑制其合成而阻斷病原菌毒力基因的表達，在不殺死病原菌的基礎上有效降低其致病性（王巖等，2017）。目前，群體感應淬滅酶包括群體感應信號分子的內酯酶、酰基水解酶及氧化酶還原酶3種，其中酰基高絲氨酸內酯酶是發(fā)現(xiàn)最早和研究最深入的群體感應淬滅酶。群體感應淬滅酶最早在芽孢桿菌240B1（Bacillus sp. 240B1）中發(fā)現(xiàn)（Dong et al.，2000），隨后陸續(xù)在不同菌屬中發(fā)現(xiàn)多種淬滅酶基因，包括attM、ahlD、ytnP、ahlS和aidH等基因（Zhang et al.，2002;Park et al.，2003;Mei et al.，2010;Morohoshi et al.，2012;Schneider et al.，2012）。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）T-1株是國家水生動物病原庫從水產(chǎn)動物腸道分離篩選獲得，具有良好的群體感應淬滅效果，尤其對感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚具有良好抗感染能力，具備開發(fā)成抗菌益生菌的潛力（宋增福等，2015;Chen et al.，2019）。因此，優(yōu)化地衣芽孢桿菌T-1株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，可為更好地利用該菌進行后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)提供技術指導?！厩叭搜芯窟M展】目前，關于芽孢桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究已有較多報道，且主要采用常規(guī)的正交試驗設計進行優(yōu)化。洪劍輝（2015）通過正交試驗設計對棘孢小單孢菌產(chǎn)慶大霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后其產(chǎn)慶大霉素B量較原配方提高20%;劉寬博等（2016）使用正交試驗設計優(yōu)化枯草芽孢桿菌C3的培養(yǎng)基組成，優(yōu)化后枯草芽孢桿菌C3的活菌數(shù)達7.1×1010 CFU/mL，細菌濃度提高7.89倍;邵帥（2016）以正交試驗設計優(yōu)化夏孢生枝孢菌株的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組分，優(yōu)化后的菌株發(fā)酵上清液對黃曲霉毒素B1的降解率提高1.40倍;Wang等（2017）采用正交試驗設計對食用真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后其發(fā)酵液中的黃酮類和可溶性蛋白分別為1.551和0.691 mg/mL;王忠忠和龔國利（2017）以正交試驗設計優(yōu)化短小芽孢桿菌株M01抗菌活性物質的發(fā)酵工藝，優(yōu)化后其抑菌活性提高38.7%;葉碧霞等（2017）采用正交試驗設計對枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌數(shù)達1.03×1010 CFU/mL;陳海超等（2018）通過正交試驗設計優(yōu)化漢遜氏葡糖酸醋桿菌培養(yǎng)條件，優(yōu)化后細胞膜干重的產(chǎn)量提高3倍;Liu等（2018）采用正交試驗設計對巨大芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵液用于作物肥料，能使農(nóng)作物產(chǎn)量提高25.91%;王海德（2018）通過正交試驗設計優(yōu)化空氣芽孢桿菌的培養(yǎng)基組成，使其活菌數(shù)高達7.65×109 CFU/mL，細菌濃度提高117倍;張同睿（2018）以正交試驗設計對多粘類芽孢桿菌SC2抗細菌活性物質的發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，優(yōu)化后抗菌物質的最終產(chǎn)量約提高4倍。【本研究切入點】由于正交試驗設計不能給出明確的函數(shù)表達式以確定整個區(qū)域的最佳因素組合及最佳響應值，難以獲得理想的優(yōu)化效果（李姝江等，2019）;且單因素試驗是通過逐個考察各因素以修正其他因素，但各因素間存在交互作用，因此獲得的最佳條件并非最優(yōu)條件。響應面分析是一種回歸分析方法，所求得的回歸方程精度高，能研究多種因素間的交互作用，且周期短和試驗次數(shù)少;同時可建立數(shù)學模型，通過多元二次回歸方程來解決最優(yōu)組合受多個變量影響的問題（徐敏強，2018）。因此，利用響應面分析法進行微生物培養(yǎng)基優(yōu)化可獲得良好的效果，但至今未見以響應面分析法優(yōu)化地衣芽孢桿菌T-1株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用單因素試驗和響應面分析法對具群體感應淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，進一步提高其產(chǎn)孢量，為后續(xù)開發(fā)地衣芽孢桿菌制劑（抗菌益生菌）打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

地衣芽孢桿菌T-1株由國家水生動物病原庫篩選獲得，保藏于中國微生物保藏中心，保藏編號CCTCC M2014049。LB培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2）和LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4）自制，碳源（糖蜜、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨）、氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉、黃豆粉、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）、無機鹽（NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2）均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：超凈工作臺（SJ-CJ-1FD）、恒溫培養(yǎng)箱（LHP-100）、高速冷凍離心機（KT7-900-430）、振蕩培養(yǎng)箱（INNOVA 40R）、紫外分光光度計（UPG-722）和光照培養(yǎng)箱（MGC-350BP）。

1. 2 T-1株最佳培養(yǎng)條件的單因素試驗

1. 2. 1 最佳培養(yǎng)溫度 參考陳海超等（2018）的方法，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中（pH 7.0），分別置于20、24、28、32、37、42、46和50 ℃的搖床上振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳溫度。每個溫度組設3個平行。

1. 2. 2 最佳pH 參考葉碧霞等（2017）的方法，用1 mol/L HCl或NaOH將培養(yǎng)基pH調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中，置于37 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳pH。每個pH設3個平行。

1. 2. 3 最佳鹽度 參照胡桂萍等（2018）的方法，將過夜培養(yǎng)菌液按1%比例接種到5 mL營養(yǎng)肉湯試管中（pH 7.0），按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的梯度鹽度進行搖床振蕩培養(yǎng)18 h后測OD600，確定T-1株生長的最佳鹽度。每個鹽度設3個平行。

1. 3 T-1株菌液OD600與活菌數(shù)量的關系

參考Ushakiranmayi等（2017）的方法，梯度稀釋待測菌液10-3～10-7，取稀釋菌液200 ?L均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度重復3次，培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計活菌數(shù)。

1. 4 T-1株生長曲線繪制

參考葉碧霞等（2017）的方法，將T-1株的菌液按1%比例接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)。每4 h測量一次菌液OD600，以未接種菌液的培養(yǎng)基為空白對照，繪制T-1株培養(yǎng)時間與OD600的生長曲線。

1. 5 T-1株活菌數(shù)、芽孢數(shù)與時間的關系

活菌數(shù)測定參考葉碧霞等（2017）的方法，將T-1株菌液按1%比例接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，采用稀釋涂布法分別對培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、36、48、60和72 h后的菌液進行活菌計數(shù)，每個梯度重復3次，測出各時段的活菌數(shù)。芽孢數(shù)測定參考Roy等（2013）的方法，將待測菌液置于80 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后按活菌計數(shù)方法進行計數(shù)，每個梯度重復3次，測量各時段的芽孢產(chǎn)量。

1. 6 發(fā)酵培養(yǎng)基組分單因素試驗

1. 6. 1 最佳碳源篩選 分別選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨作為唯一碳源（1.0%），以牛肉浸粉為氮源（0.3%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照碳源不同設8個試驗組，每組3個平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 6. 2 最佳氮源篩選 以最佳碳源為碳源（1.0%），選取5種有機氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黃豆粉）和4種無機氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）作為氮源（0.3%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照碳源不同設9個試驗組，每組3個平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 6. 3 最佳無機鹽篩選 在最佳碳源和氮源的基礎上，選取NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7種無機鹽（0.5%），裝液量150 mL，接種量3%，37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)54 h。按照無機鹽不同設7個試驗組，每組3個平行，測量菌液OD600及其芽孢產(chǎn)量。

1. 7 響應面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基成分及配比

1. 7. 1 Plackett-Burman試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，確定6個對芽孢產(chǎn)量影響較大的因子。采用Minitab 16.0中的Plackett-Burman試驗設計篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中影響芽孢產(chǎn)量的主要因子，依次設為X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（搖床轉速）和X6（接種量），每個因素取高低兩個水平（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 2 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗設計得出的一次擬合方程確定因素取值中心點，并確定主要因素的爬坡方向和變化步長;然后根據(jù)最陡爬坡試驗中菌液芽孢產(chǎn)量的變化趨勢，確定Box-Behnken試驗設計的中心點及最適質量濃度范圍（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 3 響應面分析 根據(jù)最陡爬坡試驗結果，確定Plackett-Burman試驗設計中主要因素的最適質量濃度范圍。采用Minitab 16.0中的Box-Behnken設計3因素優(yōu)化試驗，通過響應面分析各因素間的相互作用。

1. 8 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)整理，利用Mini-tab 16.0對單因素試驗結果和響應面分析結果進行方差分析，并通過最小顯著性差異（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2. 1 T-1株最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素試驗結果

由圖1-A可看出，菌液OD600隨培養(yǎng)溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，于37 ℃時達最高值（0.425），即T-1株的最佳生長溫度為37 ℃。由圖1-B可看出，當pH由3.0逐漸上升至6.0時，菌液OD600隨之升高，但pH繼續(xù)上升后菌液OD600開始降低，說明T-1株適合在偏酸性環(huán)境下生長，最佳pH為6.0。由圖1-C可看出，當培養(yǎng)基鹽度為0.5%時，菌液OD600達最高值（0.453），但鹽度繼續(xù)增加時菌液OD600開始降低。由圖1-D可看出，當菌液OD600大于0.859后菌液OD600與活菌數(shù)量間的關系趨于直線變化，當菌液OD600為1.604時，活菌數(shù)量達5.0×109 CFU/mL。

2. 2 T-1株活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)量與培養(yǎng)時間的關系

由T-1株在37 ℃下?lián)u床（150 r/min）培養(yǎng)的生長曲線（圖2-A）可看出，0～4 h為菌株生長的遲緩期，4～24 h為對數(shù)增長期，24～48 h菌株生長達穩(wěn)定期，48 h后為衰亡期。由圖2-B可看出，T-1株的芽孢產(chǎn)量隨搖床培養(yǎng)時間的延長逐步增加，即與培養(yǎng)時間呈正相關;培養(yǎng)至48 h后其活菌數(shù)呈下降趨勢，而芽孢產(chǎn)量依然呈增加趨勢。T-1株的活菌數(shù)在培養(yǎng)48～60 h期間其芽孢產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。

2. 3 T-1株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素試驗結果

2. 3. 1 最佳碳源篩選 以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麩皮粉和蛋白胨等8種碳源進行單因素試驗，結果（表1）顯示，可溶性淀粉組和葡萄糖組的菌液OD600較高，分別為1.308和1.200，而糖蜜組和可溶性淀粉組的芽孢產(chǎn)量較高，分別為1.28×108和1.66×108 CFU/mL。綜合生產(chǎn)成本及培養(yǎng)效果，選取可溶性淀粉和糖蜜進行響應面分析。

2. 3. 2 最佳氮源篩選 選用5種有機氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黃豆粉）和4種無機氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）進行單因素試驗，結果（表2）顯示，酵母浸粉組的菌液OD600和芽孢產(chǎn)量均最高，分別為1.853和4.30×108 CFU/mL，因此選擇酵母浸粉為最佳氮源。

2. 3. 3 最佳無機鹽篩選 以可溶性淀粉為碳源、酵母浸粉為氮源，選擇NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7種無機鹽進行單因素試驗，結果（表3）顯示，CaCl2組的菌液OD600和芽孢產(chǎn)量均最高，分別為1.930和6.35×108 CFU/mL，因此選擇CaCl2為最佳無機鹽。

2. 4 響應面分析結果

2. 4. 1 Plackett-Burman試驗結果 Plackett-Burman試驗設計采用n=12，對6個因素（X1、X2、X3、X4、X5和X6）進行分析，并利用Minitab 16.0對試驗結果（表4）進行統(tǒng)計分析，結果（表5）表明，X2（可溶性淀粉）對T-1株芽孢產(chǎn)量的影響達顯著水平（P<0.05，下同），而X5（搖床轉速）對芽孢產(chǎn)量的影響達極顯著水平（P<0.01）。

2. 4. 2 最陡爬坡試驗結果 由表5可知，X2（可溶性淀粉）對T-1株芽孢產(chǎn)量具有顯著負效應，因此最陡爬坡試驗應沿著可溶性淀粉濃度減少的方向進行設計;而X5（搖床轉速）對T-1株芽孢產(chǎn)量具有極顯著正效應，因此最陡爬坡試驗應沿著轉速升高的方向進行設計。最陡爬坡試驗結果（表6）表明，在可溶性淀粉1.2%和搖床轉速220 r/min附近區(qū)域時，T-1株的芽孢產(chǎn)量達最高值（27.7×108 CFU/mL）。

2. 4. 3 Box-Behnken中心組合試驗結果 根據(jù)最陡爬坡試驗結果（表6）設計Box-Behnken中心組合試驗，其中可溶性淀粉和搖床轉速的中心點分別為X1=1.2%和X2=220 r/min，具體因素水平設計見表7。對Box-Behnken中心組合試驗結果（表8）進行方差分析，可知回歸模型的決定系數(shù)為93.54%，P=0.000，失擬項P為0.764，表明擬合得到的回歸模型顯著且無失擬現(xiàn)象。由表9可知，回歸模型的線性和平方對菌株芽孢產(chǎn)量的影響達顯著水平，而交互作用對菌株芽孢產(chǎn)量的影響不顯著;擬合得到的二次回歸方程為Y芽孢產(chǎn)量=10.52+0.51X1-329.20X2-1.05X12-1.05X22+0.075X1X2。

利用響應優(yōu)化器對擬合的二次回歸方程進行求值（圖4），得知當X1=1.11%、X2=218.43 r/min時，Y芽孢產(chǎn)量達最大值（10.59）。為進一步驗證響應面分析結果，進行3次重復試驗，結果顯示T-1株芽孢產(chǎn)量的平均值為（10.52±4.50）×108 CFU/mL，與理論預測值相近，說明該回歸模型預測結果可靠。與優(yōu)化前采用初始基礎培養(yǎng)基的T-1株芽孢產(chǎn)量（2.15×108 CFU/mL）相比，優(yōu)化后的T-1株芽孢產(chǎn)量提高6.25倍。

3 討論

抗生素是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)常用的化學防治藥物，但抗生素易使菌株產(chǎn)生耐藥性，毒副作用強且存在環(huán)境污染等缺點，歐盟已于2006年全面停止使用抗生素作為飼料添加劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)（倪軍等，2018），即目前迫切需要一種新型安全綠色無污染的抗菌制劑來替代抗生素應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，尤其在生態(tài)環(huán)境和食品安全越來越受到重視的背景下，加快新型抗菌制劑的研制對促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。在本課題組前期的研究基礎上，本研究采用單因素試驗和響應面分析法對地衣芽孢桿菌T-1株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，結果表明，以酵母浸粉為唯一氮源，T-1株的芽孢產(chǎn)量最高（4.30×108 CFU/mL），是由于酵母浸粉富含蛋白質、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素和微量元素，與朱天輝等（2013）的研究結果一致;以CaCl2為唯一無機鹽時，T-1株的芽孢產(chǎn)量明顯高于其他無機鹽，是由于Ca2+在細胞中控制其體內的滲透壓，且Ca2+是某些生物酶的激活劑，能保障細胞正常的機體功能和酶活特性，與林陳強等（2011）的研究結果一致。

本研究基于單因素試驗和Plackett-Burman試驗，篩選出對T-1株芽孢產(chǎn)量影響顯著的2個因素分別是可溶性淀粉和搖床轉速，并通過最陡爬坡試驗找出這2個因素的中心點，然后利用響應面分析法中的Box-Behnken中心組合試驗設計篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。結合T-1株的生物學特性及其培養(yǎng)基優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)在溫度37 ℃、pH 6.0、可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%、CaCl2 0.5%、搖床轉速218 r/min的條件下培養(yǎng)54 h，其芽孢產(chǎn)量為10.59×109 CFU/mL，較優(yōu)化前初始基礎培養(yǎng)基的菌株芽孢產(chǎn)量提高6.25倍。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能有效提高地衣芽孢桿菌T-1株發(fā)酵產(chǎn)孢數(shù)量，保證微生態(tài)制劑的含菌量;此外，優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對廉價且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)?；a(chǎn)上推廣應用。

李冠杰等（2018）研究表明，地衣芽孢桿菌YDY株的最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度 37 ℃、pH 8.0、接種量體積分數(shù)1%。王珊珊等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌LS-1株的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度40 ℃、初始pH 12.0、接種量體積分數(shù)4%。在本研究的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，地衣芽孢桿菌T-1株的生長對數(shù)期為4～24 h，即收集菌體的最佳時間為18～24 h，48 h后開始進入衰亡期，與劉瑩等（2006）研究發(fā)現(xiàn)T-1株從培養(yǎng)21 h后進入衰亡期的結論相比，極大延長了地衣芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期。T-1株在溫度37 ℃、搖床轉速218 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，其芽孢產(chǎn)量可達最大值，與解順昌等（2015）的研究結果基本一致?？梢?，不同菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件也不同，且差距較大，但具體原因有待進一步研究驗證。

4 結論

具群體感應淬滅作用地衣芽孢桿菌T-1株在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前明顯提高6.25倍，且延長菌株生長的穩(wěn)定期，加上優(yōu)化篩選出的培養(yǎng)基是采用相對廉價且高效的原材料，有效節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵成本，可在規(guī)?；a(chǎn)上推廣應用。

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（責任編輯 蘭宗寶）