一種快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質(zhì)材料的方法

唐艷 武曉曉 婁兵海 劉萍 陳傳武 牛英 張戈壁 燕佳文 鄧崇嶺

摘要：【目的】研發(fā)一種快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質(zhì)材料的方法，為加快柑橘黃龍病耐性育種進(jìn)程和提高育種效率打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳允占?6份疑似對(duì)柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質(zhì)為材料，采用直接高接于感染黃龍病菌柑橘樹(shù)上的方法（高接染毒鑒定法），通過(guò)田間癥狀觀察結(jié)合定量PCR檢測(cè)對(duì)試驗(yàn)材料的耐病性進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)?！窘Y(jié)果】春季高接供試材料1個(gè)月后接芽萌發(fā)，3個(gè)月后（2018年6月5日）首次在KH-14上出現(xiàn)典型的葉片斑駁型黃化癥狀，4個(gè)月后（2018年7月5日）觀察有23份種質(zhì)材料的葉片出現(xiàn)斑駁型黃化癥狀，另外11份種質(zhì)材料未表現(xiàn)癥狀;6個(gè)月后（2018年9月4日）觀察發(fā)現(xiàn)KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份種質(zhì)材料的生長(zhǎng)雖然較正常，但葉片已出現(xiàn)黃化癥狀，只有KH-21的枝梢生長(zhǎng)良好，無(wú)黃梢和斑駁型黃化葉，初步判定為對(duì)黃龍病具有耐性的種質(zhì)材料。對(duì)6份種質(zhì)材料的定性PCR檢測(cè)結(jié)果表明，KH-21為陰性，其他5份材料為陽(yáng)性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，KH-21的平均黃龍病菌含量為1870.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA，對(duì)照材料平均黃龍病菌含量為372285.5個(gè)細(xì)胞/μg DNA，表明KH-21對(duì)柑橘黃龍病具有耐性?！窘Y(jié)論】高接染毒鑒定法鑒定周期在6個(gè)月左右，具有通量大、時(shí)間短、效率高、成本低及結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能達(dá)到快速鑒定柑橘品種對(duì)柑橘黃龍病耐性的目的，可在柑橘黃龍病耐性鑒定中推廣使用。

關(guān)鍵詞： 柑橘;黃龍病;耐性;種質(zhì)材料;高接染毒鑒定法

中圖分類號(hào)： S436.661.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）11-2489-07

A rapid identification method for germplasm materials resistant to citrus Huanglongbing disease

TANG Yan1， WU Xiao-xiao1， LOU Bing-hai1， LIU Ping1， CHEN Chuan-wu1，

NIU Ying1， ZHANG Ge-bi1， YAN Jia-wen2， DENG Chong-ling1*

（1Guangxi Academy of Specialty Crops/Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology， Guilin， Guangxi? 541004， China; 2College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin， Guangxi? 541004， China）

Abstract：【Objective】To develop a rapid identification method for citrus Huanglongbing disease resistant germline materials and provide basis for accelarating the citrus breeding that were resistant to Huanglongbing and increasing the breeding efficiency. 【Method】Thirty-six citrus germplasms suspected to be resistant to citrus Huanglongbing disease were collected in this study. The method of direct high grafting to citrus trees infected with Huanglongbing pathogen was adop-ted. The resistance of the test materials was identified and evaluated by field symptoms combined with quantitative PCR. It was defined as the top grafting identification method. 【Result】The test materials that were grafted in spring started to germinate after one month， and three months later（June 5， 2018），typical mottled yellowing on leaves was observed on KH-14 for the fiest time. After four months（July 5， 2018） of top grafting， typical mottled yellowing occurred on 23 mate-rials， and 11 materials showed no such symptom. After six months（September 4， 2018） of top grafting， although the growth of KH-18，KH-12， KHY-4， KHY-5 and KHY-6 were normal， yellowing was observed on their leaves. Only KH-21 grew well， and showed no yellow shoots and yellowing leaves. It was identified as the material with resistance to Huanglongbing disease. Quantitative PCR tests on the above six materials showed that KH-21 was negative and the other five were positive. Real-time fluorescence quantitative PCR test indicated that the average Huanglongbing bacteria amount in KH-21 was 1870.0 cell/μg DNA， and the average Huanglongbing bacteria amount incontrol material was 372285.5 cell/μg DNA， indicating KH-21 was resistant to Huanglongbing bacteria. 【Conclusion】The method for infecting bacteria by topgrafting takes six months， and can detect large amount of seedlings，it is time-saving， high efficient，low-cost and accurate. This methodcan quickly identify the resistance of citrus varieties to citrus Huanglongbing disease， and can be popularized and used in the identification of citrus Huanglongbing disease resistance.

Key words： citrus; Huanglongbing disease; resistance; germplasm material; method for infecting bacteria by top grafting

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing）是一種世界范圍的柑橘毀滅性細(xì)菌病害，其病原是一類難培養(yǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌（Bassanezi et al.，2009;鄧崇嶺，2017），目前已發(fā)現(xiàn)3個(gè)種：亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Ca. L. africanus）（Jagoueix et al.，1994）和美洲種（Ca. L. americanus）（Teixeira et al.，2005;Bové，2006），其中亞洲種發(fā)生流行最廣泛，在我國(guó)發(fā)生流行的也是亞洲種。黃龍病每年對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元。柑橘樹(shù)感染黃龍病初期，植株新抽出的枝梢葉片接近成熟時(shí)停止轉(zhuǎn)綠，在樹(shù)冠頂部形成明顯的“黃梢”，受害葉片主要表現(xiàn)為斑駁型黃化、均勻型黃化和花葉型3種類型癥狀。黃龍病樹(shù)經(jīng)過(guò)2～3年的病情發(fā)展，全樹(shù)發(fā)黃，樹(shù)勢(shì)迅速衰退，葉片早脫落，枝梢干枯，根系腐爛，病株逐漸枯死。柑橘植株一旦感病，輕者影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重者則造成樹(shù)死園毀，給果農(nóng)帶來(lái)不可估量的經(jīng)濟(jì)損失（婁兵海和周常勇，2007;程春振等，2013;周常勇，2018）。目前，柑橘黃龍病的綜合防控措施主要有種植柑橘無(wú)病苗木、防治柑橘木虱、及時(shí)清除病樹(shù)（鄧秀新和彭抒昂，2013）等，雖然嚴(yán)格執(zhí)行上述措施能有效防控柑橘黃龍病，但在實(shí)際生產(chǎn)中存在一定的操作執(zhí)行難度。因此，篩選出對(duì)柑橘黃龍病具有抗性或耐性的柑橘種質(zhì)材料或新品系，并在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，是解決柑橘黃龍病危害最根本的途徑，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，部分野生柑橘品種對(duì)黃龍病具有一定的耐性，但由于供試野生柑橘品種數(shù)量少，迄今為止，國(guó)際上尚未挖掘出更有耐黃龍病價(jià)值的柑橘資源。廣西存在大量的野生和特有柑橘種質(zhì)資源，石健泉（1989）、鄧崇嶺等（2013）先后開(kāi)展了廣西柑橘種質(zhì)的調(diào)查、收集和保存工作，目前已在廣西特色作物研究院保存了575份柑橘種質(zhì)資源，其中廣西野生和特有柑橘種質(zhì)資源81份，同時(shí)從大田中優(yōu)選出疑似耐黃龍病種質(zhì)材料62份，這些資源中可能存在具有柑橘黃龍病耐性的柑橘種質(zhì)材料。然而，目前對(duì)柑橘黃龍病耐性柑橘種質(zhì)材料的常用鑒定方法是將待鑒定種質(zhì)材料嫁接到砧木上培育成幼苗，然后將感染黃龍病的芽、皮或枝段嫁接到幼苗上，使黃龍病菌傳染到待鑒定的種質(zhì)材料上，再通過(guò)黃龍病典型癥狀的表現(xiàn)及PCR檢測(cè)情況判斷該種質(zhì)材料對(duì)柑橘黃龍病的耐性（黃小耘和田甜，2015;李彬，2019），鑒定周期較長(zhǎng)，且存在接種病原數(shù)量少、效率低、成本高等缺點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于此，有必要研發(fā)一種可快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質(zhì)材料的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研發(fā)一種可快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質(zhì)材料的方法，為加快柑橘黃龍病耐性育種進(jìn)程和提高育種效率打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料共36份，為2014—2018年在廣西調(diào)査、發(fā)掘和收集的疑似對(duì)柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質(zhì)材料（表1）。36份種質(zhì)材料分別嫁接在枳砧上，種植于廣西特色作物研究院柑橘育種大棚內(nèi)加以保存，目前生長(zhǎng)情況較好，可滿足接穗采集和嫁接使用。

1. 2 傳（染）毒鑒定方法比較試驗(yàn)

1. 2. 1 嫁接傳毒鑒定法（常規(guī)方法） 2017年9月，將收集的3份待鑒定沙糖橘種質(zhì)材料KH-16、KH-17和KH-18取單芽采用小芽腹接法嫁接在枳砧上，于2018年3月剪去嫁接口以上的砧木枝干，至2018年9月抽發(fā)的嫁接芽長(zhǎng)成小苗;同時(shí)，設(shè)沙糖橘無(wú)病苗為對(duì)照。2018年9月從沙糖橘黃龍病樹(shù)上表現(xiàn)斑駁型黃化葉片癥狀的枝條上采集接穗，采用腹接法，嫁接到待鑒定的種質(zhì)材料上，每株均嫁接3個(gè)黃龍病病樹(shù)芽。對(duì)供試材料及對(duì)照定期進(jìn)行黃龍病癥狀觀察，并在嫁接傳毒6個(gè)月后進(jìn)行定性和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。

1. 2. 2 高接染毒鑒定法 2018年3月將相同的3份待鑒定沙糖橘種質(zhì)材料取單芽高接至黃龍病樹(shù)上，成活后定期進(jìn)行黃龍病癥狀觀察，并在6個(gè)月后進(jìn)行定性和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè);同時(shí)，將無(wú)毒沙糖橘芽高接至同一株黃龍病樹(shù)上作為對(duì)照。

1. 3 高接染毒鑒定試驗(yàn)

1. 3. 1 高接樹(shù)選擇 在柑橘果園中選取感染黃龍病菌的柑橘樹(shù)，并進(jìn)行PCR檢測(cè)加以確定。本次試驗(yàn)果園位于廣西桂林市臨桂區(qū)中庸鄉(xiāng)江勒寨村。園中所種柑橘品種為沙糖橘，砧木為枳，共計(jì)112株，經(jīng)PCR檢測(cè)，112株樹(shù)全部呈陽(yáng)性，田間癥狀觀察和PCR檢測(cè)結(jié)果表明，所選的高接樹(shù)均已感染黃龍?。▓D1）。

1. 3. 2 高接染毒鑒定試驗(yàn) 于2018年3月將供試材料高接至黃龍病樹(shù)上。高接供試種質(zhì)材料36份，其中2份材料由于天牛危害死亡，因此高接鑒定材料實(shí)為34份，高接方法為春接。

高接方法主要分為春接和秋接。春接：接種時(shí)間為2—4月，高接方式為單芽切接;操作方法：在高接樹(shù)上選取直徑0.5 cm以上的枝條，在樹(shù)皮平滑處剪斷，在枝條斷面下方沿皮層與木質(zhì)部交界處向下縱切一刀，露出形成層，切面短于接穗芽，然后從待鑒定種質(zhì)材料的枝條上切取單芽，將單芽插入中間砧枝條切口上，對(duì)準(zhǔn)雙方形成層并縛緊。秋接：接種時(shí)間為9—11月，高接方式為小芽腹接;操作方法：在高接樹(shù)上選取直徑0.5 cm以上的枝條，在樹(shù)皮平滑處沿皮層與木質(zhì)部交界處向下縱切一刀，露出形成層，切面長(zhǎng)度2.0～4.0 cm，然后從待鑒定種質(zhì)材料的枝條上切取芽片，將芽片插入砧枝條切口上并縛緊，保留高接枝條。同時(shí)設(shè)同一品種的對(duì)照品種進(jìn)行高接。

1. 3. 3 田間癥狀觀察 高接4個(gè)月后，根據(jù)待鑒定種質(zhì)材料抽出枝梢的癥狀進(jìn)行診斷：枝梢生長(zhǎng)良好、無(wú)黃梢、無(wú)斑駁型黃化葉或僅有輕微葉片黃化癥狀，則初步判定該種質(zhì)材料對(duì)柑橘黃龍病具有耐性;枝梢生長(zhǎng)較弱、黃梢嚴(yán)重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，則初步判定該種質(zhì)材料對(duì)柑橘黃龍病不具耐性。

1. 3. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取高接成活且初步判定為對(duì)柑橘黃龍病具有耐性種質(zhì)材料的葉片，采用改良CTAB法提取DNA（程運(yùn)江等，2001），得到待測(cè)樣品的DNA模板;從健康柑橘樹(shù)的葉片中提取DNA作為陰性對(duì)照，從柑橘黃龍病樹(shù)的葉片中提取DNA作為陽(yáng)性對(duì)照;參照Li等（2006）的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算病原菌含量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 兩種鑒定方法結(jié)果

對(duì)3份沙糖橘種質(zhì)材料KH-16、KH-17和KH-18進(jìn)行田間癥狀觀察，結(jié)果顯示，采用嫁接傳毒法的植株在接種毒源6個(gè)月后均表現(xiàn)出典型的葉片斑駁型黃化癥狀;采用高接染毒法的植株在高接3個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)黃龍病典型葉片黃化癥狀，4個(gè)月后黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯。

對(duì)3份沙糖橘種質(zhì)材料分別進(jìn)行定性和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果（表2）顯示，采用嫁接傳毒法的材料黃龍病菌平均含量為1079608.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA，采用高接染毒法的材料黃龍病菌平均含量為1269969.7個(gè)細(xì)胞/μg DNA，較嫁接傳毒法的病菌平均含量約高17.63%。

嫁接傳毒鑒定法（常規(guī)方法）是在待鑒定種質(zhì)上嫁接已感染黃龍病的芽、皮或枝段，使黃龍病菌傳染到待鑒定的種質(zhì)材料上，嫁接材料由于體積小，含有的病原數(shù)量較少，使得接種病原數(shù)量少，鑒定周期為10～16個(gè)月。高接染毒鑒定法是將待鑒定的種質(zhì)材料直接高接在柑橘黃龍病樹(shù)上，病原數(shù)量多且可持續(xù)侵染待鑒定的種質(zhì)材料，高接成活后通過(guò)黃龍病癥狀觀察結(jié)合黃龍病菌PCR定量檢測(cè)進(jìn)行耐性鑒定，鑒定周期為6個(gè)月。兩者相比較，高接染毒鑒定法具有通量大、時(shí)間短、效率高、成本低及結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

2. 2 高接柑橘成活率調(diào)查結(jié)果

2018年7月31日，對(duì)高接試驗(yàn)果園的嫁接成活情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，高接芽共計(jì)397個(gè)，其中成活芽357個(gè)，成活率為89.92%。

2. 3 高接后田間癥狀觀察結(jié)果

春季高接鑒定材料1個(gè)月后接芽萌發(fā)，2個(gè)月后接芽生長(zhǎng)正常，3個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)黃龍病典型葉片黃化癥狀，4個(gè)月后黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯（圖2），可進(jìn)行黃龍病田間癥狀觀察和統(tǒng)計(jì)，同時(shí)進(jìn)行黃龍病菌定性PCR檢測(cè)（圖3）。2018年6月5日首次出現(xiàn)典型的葉片斑駁型黃化癥狀，種質(zhì)材料編號(hào)為KH-14（宮川）;6月19日觀察發(fā)現(xiàn)9份種質(zhì)材料的葉片出現(xiàn)斑駁型黃化癥狀;7月5日觀察23份種質(zhì)材料的葉片出現(xiàn)斑駁型黃化癥狀，另外11份種質(zhì)材料未表現(xiàn)癥狀;8月7日觀察只有6份種質(zhì)材料（KH-21、KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6）的葉片未表現(xiàn)癥狀，其余材料出現(xiàn)葉片斑駁型黃化癥狀，說(shuō)明34份種質(zhì)材料對(duì)柑橘黃龍病的耐性存在差異;9月4日觀察KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份種質(zhì)材料的生長(zhǎng)雖然較正常，但葉片已出現(xiàn)黃化癥狀（非黃龍病典型斑駁型黃化癥狀），疑似感染黃龍病病菌，只有編號(hào)為KH-21材料（沙糖橘）的枝梢生長(zhǎng)良好，無(wú)黃梢和斑駁型黃化葉，初步判定為對(duì)黃龍病具有耐性的種質(zhì)材料。對(duì)照同一品種則已表現(xiàn)出典型的黃龍病癥狀，即枝梢生長(zhǎng)較弱、黃梢嚴(yán)重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，初步判定為對(duì)黃龍病不具耐性的種質(zhì)材料。

2. 4 定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2018年9月7日，對(duì)8月7日觀察的6份未表現(xiàn)黃龍病癥狀的種質(zhì)材料進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，KH-21材料檢測(cè)結(jié)果為陰性，其他5份材料檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，雖然5份材料已感染黃龍病菌，但其枝梢生長(zhǎng)較正常、生長(zhǎng)勢(shì)較旺，感染時(shí)間也較晚，說(shuō)明對(duì)黃龍病有一定的耐病性。2018年9月12日對(duì)定性PCR檢測(cè)呈陰性的KH-21材料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，KH-21材料中的黃龍病菌含量為1809.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA，對(duì)照材料黃龍病菌含量為951837.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA（圖4）;此后，在不同時(shí)期連續(xù)進(jìn)行5次實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，KH-21平均黃龍病菌含量為1870.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA，對(duì)照材料平均黃龍病菌含量為372285.5個(gè)細(xì)胞/μg DNA ，對(duì)照含菌量是KH-21的199.1倍，說(shuō)明KH-21材料中的黃龍病菌含量明顯低于對(duì)照（圖5）。

2. 5 田間癥狀結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)耐性種質(zhì)的評(píng)價(jià)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及田間癥狀觀察結(jié)果顯示，編號(hào)為KH-21材料的枝梢生長(zhǎng)良好，在試驗(yàn)果園內(nèi)未觀察到黃梢和葉片斑駁型黃化癥狀，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明黃龍病菌含量為1809.0個(gè)細(xì)胞/μg DNA，表明KH-21對(duì)柑橘黃龍病具有耐性。

3 討論

盡管黃龍病病原可感染所有柑橘主栽品種，且目前還未發(fā)現(xiàn)抗性資源和材料，但已有研究發(fā)現(xiàn)，不同柑橘品種對(duì)黃龍病的耐性不同，寬皮橘（C. reticulata）、甜橙（C. sinensis）和桔柚（C. reticulata×C. paradisi）最感病，檸檬（C. limonum）和葡萄柚（C. paradisi）較耐病，枳殼（Poncitrus. trifoliate）、來(lái)檬（C. aurantifolia）和枳橙（C. sinensis×P. trifoliate）最耐病（黃麗，2013）;胡柚、金柑和佛手較抗病，椪柑和甌柑等較易感病（蔣自珍等，2006）。Shokrollah等（2011）通過(guò)柑橘嫁接試驗(yàn)證明，依據(jù)植株黃龍病癥狀可將供試材料分為5組：重癥組，包括寬皮柑橘、甜橙和印度酸橘;中癥組，包括金柑、阿力檬和小花大翼橙;輕癥組，包括枸櫞、部分來(lái)檬和粗檸檬等;耐病組（無(wú)黃龍病癥狀，但有黃龍病菌檢出），包括酸橙和某些來(lái)檬;抗病組（無(wú)癥狀且黃龍病菌檢測(cè)陰性），包括Limau Bali柚、馬蜂柑和Limau Tembikai。林雄杰等（2014）測(cè)試13個(gè)枳屬及其雜交種砧木對(duì)黃龍病的抗性，結(jié)果所有供試砧木品種均表現(xiàn)出黃龍病癥狀，其中LT49、5號(hào)小花枳、墨西哥枳橙、LT54和鄢陵枳橙等5個(gè)品種接穗上的黃龍病癥狀表現(xiàn)較嚴(yán)重。劉登全等（2014）采用黃龍病毒源樹(shù)對(duì)不同柑橘品種進(jìn)行嫁接，結(jié)果表明，椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，溫州蜜柑高度抗病。McCollum等（2016）通過(guò)長(zhǎng)期田間評(píng)估發(fā)現(xiàn)，大部分柑橘品種均易感染黃龍病，而澳沙檬和澳指檬等柑橘近緣屬植物對(duì)黃龍病具有一定的抗/耐病性。以上研究均表明，不同柑橘品種對(duì)黃龍病的耐性存在差異。

目前，對(duì)柑橘黃龍病耐性種質(zhì)材料的鑒定方法通常是嫁接傳毒鑒定法，該方法的主要缺點(diǎn)是每份待鑒定材料只能通過(guò)嫁接來(lái)接種病原，由于嫁接材料體積小，含有的病原數(shù)量較少，使得接種病原數(shù)量少;此外，由于鑒定周期通常在10～16個(gè)月，時(shí)間長(zhǎng)、效率低、成本高。本研究首次將待鑒定的種質(zhì)材料直接高接在柑橘黃龍病病樹(shù)上，高接成活后通過(guò)黃龍病癥狀觀察，并結(jié)合黃龍病菌定量PCR檢測(cè)進(jìn)行耐性鑒定，即高接染毒鑒定法，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有類似報(bào)道。高接染毒鑒定法克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種對(duì)柑橘黃龍病具有耐性的種質(zhì)材料的快速鑒定方法：每份待鑒定種質(zhì)材料直接嫁接在柑橘黃龍病病樹(shù)上，病原數(shù)量多且可持續(xù)侵染待鑒定的種質(zhì)材料;鑒定周期在6個(gè)月左右，具有通量大、時(shí)間短、效率高、成本低及結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究將待鑒定的種質(zhì)材料直接高接于柑橘黃龍病病樹(shù)上進(jìn)行耐性鑒定，即高接染毒鑒定法，能達(dá)到快速鑒定柑橘品種對(duì)柑橘黃龍病耐性的目的，為開(kāi)展柑橘黃龍病耐性育種和耐病分子機(jī)制研究打下一定基礎(chǔ)，可在柑橘黃龍病耐性鑒定中推廣使用。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）