雞胚骨形成蛋白（BMPs）基因表達水平的發(fā)育性變化

閆成光 張渝潔 唐瑋琦 邢晉祎

摘要：【目的】分析骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）基因在雞胚不同發(fā)育階段的表達水平，為進一步研究BMPs基因的功能提供依據(jù)?！痉椒ā窟x取AA肉雞種蛋100枚進行孵化，分別于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18d（記為E1～E18）選取胚蛋6枚，E1～E6采集整胚，E12～E18分別采集大腦、心臟、肝臟和腿肌組織。采用定量PCR（qPCR）方法檢測BMP2、BMP4和BMP7基因的表達豐度?！窘Y果】BMP2基因在E1～E6中的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;BMP2在E4、E5和E6中的表達水平顯著高于E1（P<0.05）;BMP2在大腦中的表達顯示，E12顯著高于E1（P<0.05），而到了E18階段反而極顯著低于E1（P<0.01）;BMP2在心臟和腿肌中的表達均是E9顯著或極顯著大于E1（P<0.05或尸<0.01）;雞胚發(fā)育到了后期（E15和E18），BMP2在心臟和肝臟中的表達卻顯著或極顯著低于E1時期（P<0.05或P<0.01）。BMP4在E1-E6中的表達水平也是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;BMP4基因在E3～E6整胚和E9胚齡的大腦、心臟、肝臟和腿肌中的表達水平均顯著或極顯著高于E1胚齡（P<0.05或尸<0.01）。BMP7在E4、E5和E6的表達與BMP2、BMP李類似，即BMP7基因的表達水平顯著或極顯著高于E1時期（P<0.05或P<0.01），但在E2和E3時期，BMP7表達水平反而降低了，且E2時期極顯著低于E1時期（P<0.01）;在整胚和大腦中的結果顯示，E4～E18階段BMP7基因的表達水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，到E18時期大腦中的BMP7基因的表達水平極顯著低于E1時期（P<0.01）;與E1相比，在心臟中BMP7到E12時期達到最低水平（P<0.01），而肝臟中BMP7基因表達水平在E12和E15階段均極顯著低于E1（P<0.01）。【結論】BMP2、BMP4和BMP夕基因在整胚的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，至E4時期到達最高點;BMP2基因在E9、E12、E15和E18的心臟、肝臟和腿肌中的表達均呈現(xiàn)下降趨勢。說明BMPs基因在器官形成初期起著關鍵作用，之后隨著器官發(fā)育完成BMPs基因的作用逐漸減弱。

關鍵詞：肉雞;骨形成蛋白;雞胚;表達水平

中圖分類號：S814.6 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1276-07

0 引言

【研究意義】胚胎期是動物生長發(fā)育的關鍵時期，此時機體生長發(fā)育的狀況對動物出生后的各項性能具有極其重要的影響。由于雞胚具有發(fā)育周期短、易于操作等特點，所以雞胚成為研究胚胎發(fā)育和器官形成機制的最佳模型[1]。另外，雞胚發(fā)育過程受到多種基因嚴格調(diào)控，保證胚胎有序地進行組織分化和個體發(fā)育。大腦、心臟和肝臟是雞胚發(fā)育過程中較早發(fā)育的重要器官。因此，以雞胚為試驗材料，研究骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）基因在雞胚中的表達規(guī)律，可為進一步研究BMPs基因的功能提供依據(jù)。[前人研究進展】BMPs蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）超家族的多功能生長因子，它能夠誘導動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織[2-3];BMPs不但能促進骨骼形成并幫助修復骨折，而且可以通過抑制肌肉生成來指導體細胞的發(fā)育[3]。目前，BMPs在胚胎發(fā)育、動物出生后以及成年動物細胞功能中的作用越來越受到重視。最初，BMPs按照氨基酸序列及同源性分為BMP1～7種，但隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種BMPs[3-4]。已證明BMP2、4、6、7、9具有顯著的成骨特性[5-6]。BMP2在誘發(fā)軟骨及硬骨的生成、成骨細胞的分化扮演重要角色[7-9];BMP4可以調(diào)節(jié)牙齒、四肢以及由中胚層發(fā)育而來的硬骨形成，其對骨折的修復、上表皮的形成、腹背軸的形成，以及卵巢濾泡的發(fā)育過程發(fā)揮作用[3，10-11];BMP7主要在成骨細胞的分化、脂肪形成和能量消耗、腎的發(fā)育及修復中有重要作用[12-14]。【本研究切入點】目前，尚未見有BMP2、BMP4、BMP7基因在雞胚中定量表達研究的報道?！緮M解決的關鍵問題】本文研究BMP2、BMP4、BMP7基因在雞胚不同發(fā)育階段的表達水平，以期為BMPs基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 雞胚孵化與樣品采集

選取新鮮的艾拔益加（Arbor Acres，AA）肉雞種蛋100枚（蛋重50～55g），洗凈，用高錳酸鉀熏蒸消毒后放入溫度為（37±0.5）℃、濕度為60%的孵化箱中孵化，每隔2h自動翻蛋1次。分別于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18d（記為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E9、E12、E15、E18）同一時間選取大小一致、發(fā)育良好的胚蛋6枚，E1～E6采集整胚，E12～E18分別采集大腦、心臟、肝臟和左側大腿肌肉組織放入凍存管液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol（Invitrogen公司）法從整胚、腦、心、肝和腿部肌肉中提取總RNA。用核酸蛋白檢測儀檢測總RNA的純度和濃度。利用M-MLV（Promega公司）反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，按照說明書合成cDNA第一鏈。

1.3 引物設計與熒光定量PCR擴增（qPCR）

根據(jù)GenBank上雞的BMP2（登錄號：NM_204358）、BMP4（登錄號：NM 205237）和BMP7（登錄號：AF205877）基因序列，利用Primer Premier6.0軟件設計qPCR引物。以雞GAPDH（登錄號：NM_204305）基因為內(nèi)參，引物序列由北京鼎國生物技術有限責任公司合成（表1）。

采用SYBR Green I（Tiangen公司）染料法，以雞GAPDH基因為內(nèi)參，進行BMP2、BMP4和BMP7基因qPCR分析。qPCR反應組成：FastFire qPCR PreMix10μL，引物各0.2μL，cDNA（稀釋10倍）1μL，滅菌超純水加至20μL。qPCR反應程序：95℃5min;95℃20s，退火溫度（表1）10s，72℃1s，重復40個循環(huán)。每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。為了分析qPCR擴增的特異性，溫度從58℃緩慢升溫到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。所有樣本進行3個重復測定，并在每次試驗時設陰性對照。根據(jù)熒光曲線的Ct值及標準曲線，以雞GAPDH基因為內(nèi)參，用2^-△△Ct法計算BMP2、BMP4和BMP7基因mRNA的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計分析

BMP2、BMP4和BMP7基因的mRNA表達水平表示為平均值±標準差（SD）。利用SAS8.2軟件，采用單因子方差分析（One-way ANOVA）分析平均數(shù)間的差異顯著性。當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 BMP2基因的表達水平

以不同發(fā)育階段的雞胚cDNA為模板，進行BMP2基因qPCR擴增，試驗結果如圖1所示。從圖1可見，BMP2基因在整胚（E1～E6）中的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;與E1相比，BMP2基因在E4、E5和E6中的表達水平顯著增高（P<0.05）。BMP2在大腦中的表達顯示E12時期顯著高于E1時期（P<0.05），而到了E18階段反而極顯著低于E1階段（P<0.01）。BMP2在心臟和腿肌中的表達E9階段顯著或極顯著大于E1時期（P<0.05或P<0.01）;雞胚發(fā)育到了后期（E15和E18），BMP2基因在心臟和肝臟中的表達卻顯著或極顯著低于E1時期（P<0.05或P<0.01）。

2.2 BMP4基因的表達水平

BMP4基因表達水平如圖2所示。與BMP2類似，BMP4基因在整胚（E1～E6）中的表達水平也是呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢;與E1相比，BMP4基因在E3～E6整胚和E9胚齡的大腦、心臟、肝臟和腿肌中的表達水平均顯著或極顯著增加（P<0.05或P<0.01）;而在E2、E12、E15和E18胚齡時期，BMP4基因的表達與E1相比均未達到差異顯著水平（P>0.05）。

2.3 BMP7基因的表達水平

圖3為BMP7基因在雞胚中的表達水平。結果表明，E4、E5和E6時期BMP7基因表達與BMP2、BMP4類似，即BMP7基因的表達水平顯著或極顯著高于E1時期（P<0.05或P<0.01），但在E2和E3時期，BMP7基因表達水平降低，且E2時期極顯著低于E1時期（P<0.01）。在整胚和大腦中的結果顯示，從E4～E18階段BMP7基因的表達水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，到E18時期極顯著低于E1時期（P<0.01）。在心臟、肝臟和腿肌中也出現(xiàn)類似的情況。相較于E1，心臟部位的BMP7表達在E12階段達到最低水平（P<0.01），而肝臟中BMP7基因水平到E12和E巧階段均極顯著低于E1階段（P<0.01）。BMP7基因在其余組織和胚齡中的表達均未達到差異顯著水平（P>0.05）。

3 討論與結論

最近研究發(fā)現(xiàn)，BMPs不但具有促進骨生長和成骨細胞分化的特性，而且與細胞增殖以及分化、凋亡、形態(tài)發(fā)生時的細胞通訊等細胞發(fā)育過程有直接或間接關系[8-9，14]。本研究以不同發(fā)育階段雞胚為研究對象，應用qPCR方法分析了BMP2、BMP4、BMP7基因在整胚和肌肉、心臟、肝臟和大腦中的表達水平變化。結果表明，BMP2和BMP4在E1～E6中的表達均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;BMP7基因在E4～E6中的表達呈現(xiàn)下降趨勢;BMP2、BMP4、BMP7基因在E9以后不同組織中表達水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢;與E1相比，BMPs基因在E9～E18時期4種組織的表達量存在一定差異，反應了BMPs基因的表達有一定的時空規(guī)律性。值得注意的是，BMPs基因在整胚中的表達均在E4時到達最高點，推測這個時期BMPs基因的高表達可能對器官的形成起著重要作用，因為E4時期機體的器官均開始發(fā)育，胚胎頭部明顯增大，是器官形成的關鍵時期。另外，研究表明BMPs是雞胚前心外膜特性的重要調(diào)節(jié)因子，BMPs的時空表達模式對雞胚的心肌形成至關重要[15-16]，并且發(fā)現(xiàn)BMPs基因在雞胚頂外胚層嵴有較強的表達[17]。以上研究結果為進一步研究刀材凡基因的功能和信號傳導途徑提供了資料。

眾所周知，BMP2在骨折愈合中起著重要作用，BMP2基因的表達是啟動骨折愈合和調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的必要條件[18-19]，所以，BMP2是脊椎動物發(fā)育不可缺少的多功能調(diào)節(jié)器[2，20]。因此，BMP2在與骨形成、體內(nèi)平衡和再生相關的生物學過程中起著至關重要的作用Izl l在動物上的研究表明，BMP2基因在母羊卵巢中的表達增強可導致體外雌二醇濃度升高[22]，而BMP2基因在綿羊體內(nèi)的表達可抑制孕酮濃度[23];在雞的研究上也檢測到非閉鎖性竇狀卵泡膜和顆粒中BMP2的表達[24]。最近發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在小尾寒羊下丘腦、輸卵管、卵巢、垂體和小腦中的相對表達高于蘇尼特羊[25]。本研究發(fā)現(xiàn)BMP2在E9～E18階段4種組織的表達除了在E12階段大腦組織有所上升外，BMP2在其余3種組織的表達均呈現(xiàn)下降趨勢。

BMP4不但在骨骼形成和骨折修復中發(fā)揮重要作用，而且與肌肉形成、卵母細胞成熟、卵泡發(fā)育和胚胎發(fā)育等密切相關[24，26-30]。據(jù)報道，BMP4在斑馬魚的嗅鞘、眼、囊泡、心臟、生殖管、肛門、腸道、胸鰭和尾鰭芽中表達[26]，而對鯉魚和羅非魚研究結果表明，BMP4基因在不同部位肌肉中的表達存在差異[29]對雞和鵝的研究發(fā)現(xiàn)，BMP4的相對豐度隨著卵泡發(fā)育過程不斷增加，在F5卵泡中達到最大值[28，30]。本研究中，BMP4在4種組織中的相對豐度均是在E9階段最高，在E12～E18階段均呈不規(guī)則的變化。

BMP7廣泛表達于人類胸腺、骨髓、脾臟、大腦、脊髓、心臟、骨骼肌、腎臟、肺、肝、胰腺和前列腺，對骨骼修復和再生、腎臟和眼睛形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用[31-32]。在綿羊上的研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊腦垂體、腦、下丘腦、輸卵管和卵巢中BMP7基因的表達明顯高于蘇尼特羊[24]。據(jù)報道，BMP7能誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化和解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）表達[33]。最近研究表明，刀幾護夕基因能調(diào)控雞卵巢功能和黑色素生成，對藍殼雞的雞冠色素沉著和產(chǎn)卵具有多效性[34]。本研究中，在雞胚E9～E18發(fā)育階段BMP7基因在大腦、心臟和肌肉中的表達量均是在E9階段最高，且在大腦中的表達呈現(xiàn)下降趨勢，在其他3種組織中均是不規(guī)則變化。

目前，對BMPs的研究越來越深入，一些新的功能也被發(fā)現(xiàn)。比如，BMP2和BMP4能促進白色脂肪發(fā)育，而BMP7與棕色脂肪發(fā)育有關[13，35]。不但BMP2能增加雌二醇的產(chǎn)生，提高卵巢顆粒細胞的存活率，而且BMP7也有同樣的功能[36]。另外，BMP2和BMP7可能還是影響綿羊產(chǎn)仔數(shù)的候選基因[37-38]。因此，隨著研究的不斷深入，BMPs的更多功能將被挖掘，為進一步改善動物遺傳性狀奠定基礎。

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（責任編輯：張梅）

收稿日期：2019-08-13初稿;2019-11-13修改稿

作者簡介：閆成光（1998-），男，主要從事動物分子遺傳研究（E-mail：2521131699@qq.com）

通信作者：邢晉祎（1968-），男，博士，教授，主要從事動物分子遺傳研究（E-mail：xingjinyi@lyu.edu.cn）

基金項目：國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201910452014）;山東省自然科學基金項目（ZR2017LC018）;國家自然科學基金項目（31372333）