長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的分離純化及其理化性質(zhì)

林勇 劉俊鋒 唐小巒 張?jiān)路? 戴推彬

摘要：【目的】凝集素是竹蓀的一類(lèi)生理活性物質(zhì)，為進(jìn)一步明確其藥用功效，開(kāi)展了長(zhǎng)裙竹蓀凝集素理化性質(zhì)研究?！痉椒ā块L(zhǎng)裙竹蓀菌絲體通過(guò)生理鹽水抽提、20%～75%飽和度的硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose和SephadexG-100柱層析純化得到長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素（DIL）;并通過(guò)血細(xì)胞凝集活性、糖抑制試驗(yàn)、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性分析以及金屬離子等因素來(lái)測(cè)定長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的理化性質(zhì)?！窘Y(jié)果】經(jīng)PAGE顯示單一條帶，測(cè)得其亞基相對(duì)分子質(zhì)量為43.6kDa。該凝集素對(duì)供試的鴿、兔、鴨和雞血紅細(xì)胞具有凝集作用，對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集作用可被D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖所抑制。長(zhǎng)裙竹蓀凝集素對(duì)熱不穩(wěn)定，經(jīng)50℃處理10min，活性明顯降低;該凝集素在pH 4.0-8.0都保持著較高的凝集活性，其凝血活性依賴(lài)于Ca²⁺和Mg²⁺二價(jià)金屬離子，Mn²⁺和Zn²⁺則無(wú)影響。[結(jié)論]長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)動(dòng)物血紅細(xì)胞具有較好的凝集活性，而且凝集活性需要在一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺才會(huì)起作用。

關(guān)鍵詞：凝集素;長(zhǎng)裙竹蓀;分離純化;理化性質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）11-1342-05

0 引言

【研究意義】竹蓀，亦稱(chēng)竹參、竹菌、竹笙，是一類(lèi)大型真菌。長(zhǎng)裙竹蓀Dictyophora indusiata為竹蓀屬模式種，在真菌分類(lèi)學(xué)上，屬擔(dān)子菌亞門(mén)，腹菌綱，鬼筆菌目，鬼筆菌科[1]，具有較好的食用、保健兼藥用價(jià)值。凝集素是一種可以從植物、動(dòng)物或微生物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凝集、免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血型鑒定和高分子化合物的篩選、純化等方面都發(fā)揮著重要的作用[2]，而凝集素也是竹蓀中所含的一類(lèi)重要的生理活性物質(zhì)，具有重要的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有報(bào)道表明，從食用菌子實(shí)體或菌絲體中分離得到的特異構(gòu)型的活性蛋白和多糖類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)在免疫功能的調(diào)節(jié)、腫瘤因子的抑制以及抑菌防腐功能中都扮演著重要的角色，其功效都與凝集素有著密切的關(guān)系[3-8]。目前從動(dòng)植物中已分類(lèi)純化的凝集素有100多種，其中大部分做成產(chǎn)品[4];從真菌廣泛分布地區(qū)采集了403種，用人紅細(xì)胞和兔紅細(xì)胞檢測(cè)凝集素，其中50%含有凝集素[9]，其研究?jī)r(jià)值不斷提高，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，對(duì)食用菌凝集素的深入研究，可以更好地開(kāi)發(fā)應(yīng)用這一寶貴生物資源提供科學(xué)依據(jù)。目前，對(duì)竹蓀的研究主要集中在其栽培及抗菌活性上，對(duì)竹蓀凝集素的研究?jī)H發(fā)現(xiàn)林玉滿和蘇愛(ài)華對(duì)其子實(shí)體凝集素的報(bào)道[4，10]，而從長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體中分離純化凝集素的相關(guān)研究，至今還尚未見(jiàn)到報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用液體發(fā)酵培養(yǎng)長(zhǎng)裙竹蓀，開(kāi)展長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素提取分離和理化性質(zhì)的研究，以期為長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素生物學(xué)活性研究利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 長(zhǎng)裙竹蓀Dictyophora indusiata Fisscher菌株由福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 玉米淀粉20g，黃豆粉10g，葡萄糖20g，酵母膏5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g、維生素B150mg·L^-1，調(diào)整pH至6.0，分裝三角瓶中高壓滅菌（121℃，20min）。

1.1.3 動(dòng)物血紅細(xì)胞及其懸液制備 兔血、鴿血、雞血、鴨血采購(gòu)自福州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。各種動(dòng)物血樣中分別加入檸檬酸鈉抗凝劑，通過(guò)離心去除血漿，用生理鹽水將血紅細(xì)胞洗滌4～5次，配制的紅細(xì)胞懸液的含量最終達(dá)到2%。

1.1.4 試劑 試劑Sephadex G-100、DEAF-SephroseFast Flow、蛋白質(zhì)Marker分別購(gòu)自Pharmacia公司、北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司和購(gòu)自Fermentas公司;其他常規(guī)藥品、試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 儀器 ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器、冷凍干燥機(jī)、L-550型低速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體的培養(yǎng) 將試管斜面長(zhǎng)裙竹蓀菌種接人裝有已滅菌冷卻50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)5d，而后采用180r·min^-1搖床28℃培養(yǎng)7d，終止發(fā)酵，用4層紗布過(guò)濾，菌絲體用高純水沖洗，重復(fù)3次，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的分離和純化 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體按質(zhì)量/體積比為1：3（即w/v=1/3）加入生理鹽水在4℃下浸泡18h，用高速組織搗碎機(jī)勻漿后在4℃下繼續(xù)浸提6h，勻漿4℃下冷凍離心（8000r·min^-1，20min），取出上清液備用。通過(guò)20%～75%飽和度的硫酸銨沉淀，收集沉淀部分，將沉淀溶于少量的PBS緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=6.8）中，并裝入透析袋除鹽，隨后用同一種緩沖液再透析，直到外透析液中SO₄^2-離子低于檢測(cè)限以下為止。聚乙二醇濃縮后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.6cm×30cm）以磷酸鹽緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=6.8）進(jìn)行梯度洗脫，分管收集，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nn，采用鴿子血檢測(cè)各洗脫峰的血凝活性，收集活性峰。第一次收集的活性峰經(jīng)Sephadex G-100柱（1.6cm×60cm）柱再次進(jìn)行層析提純，以4mL·管^-1的流速進(jìn)行，時(shí)間為10min·管^-1，以磷酸緩沖液（0.05mol·L^-1，pH=7.2）進(jìn)行洗脫，分管收集后依次檢測(cè)各峰的凝血活性，采用冷凍干燥處理活性峰，得菌絲體凝集素純品。

1.2.3 SDS-PAGE測(cè)定長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素亞基相對(duì)分子質(zhì)量 凝膠電泳參考Laemmli[11]的方法，分離膠和濃縮膠的含量分別為15%和5%，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色[12]。

1.2.4 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的血凝活性 根據(jù)孫冊(cè)的方法[2]，采用“V”型血凝板進(jìn)行血凝活性測(cè)定，首先用等量的PBS對(duì)20μL質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的凝集素溶液進(jìn)行不同倍比的稀釋?zhuān)缓蠓謩e加20μL2%的不同動(dòng)物血紅細(xì)胞，在室溫下將混合液振蕩搖勻后放置2h，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和記錄，當(dāng)凝集反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)記錄下此時(shí)的最大稀釋倍比。

1.2.5 糖抑制試驗(yàn) 將10mg·mL^-1長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素不同倍數(shù)稀釋后，分別添加在“V”型血凝板上，然后加入40mmol·L^-1的各種糖溶液混合1h后，再加入20μL2%鴿血紅血細(xì)胞，振蕩搖勻后放置于室溫下2h，觀察其凝集結(jié)果。

1.2.6 酸堿穩(wěn)定性分析 參照Ahmed and Chatterjee的方法配制pH4.0～10.0的不同系列緩沖液，在設(shè)定的pH條件下測(cè)定長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的血凝活力。pH4.0～6.0，采用0.015mol·L^-1的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液;pH6.5～7.5，采用0.015mol·L^-1的磷酸鹽緩沖液;pH8.0～9.0，采用0.015mol·L^-1的三乙醇胺鹽緩沖液，pH10.0采用0.015mol·L^-1的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。將長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素分別在上述各種鹽緩沖液中配制成質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的溶液，然后用2%的鴿血紅細(xì)胞在“V”型血凝板上檢測(cè)其凝集活性。

1.2.7 熱穩(wěn)定性分析 設(shè)置8個(gè)溫度梯度，每10℃為1個(gè)梯度，即30，40，50，60，70，80，90，100℃。將質(zhì)量濃度為1mg·mL^-1的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素溶液，分別置于以上不同溫度的水浴下處理10min，然后用純水對(duì)樣品進(jìn)行冷卻至室溫為止，同時(shí)對(duì)凝集素的血凝活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 金屬離子對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的影響根據(jù)林玉滿等[10]的方法，設(shè)定溫度為4℃，在透析袋中加入10mg·mL^-1的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素，同時(shí)把透析袋放置于20mmol·L^-1的EDTA-Na₂溶液中進(jìn)行充分透析，獲得不含金屬離子的菌絲體凝集素溶液，再通過(guò)生理鹽水作不同倍比稀釋后，分別加入10mmol·L^-1的4種二價(jià)金屬離子（Ca²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺），各自檢測(cè)凝集素對(duì)鴿血紅細(xì)胞的凝血活性。將沒(méi)有處理的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素溶液和經(jīng)EDTA處理的菌絲體凝集素溶液作為對(duì)照。

2 結(jié)果和分析

2.1 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的分離和純化

長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素粗品經(jīng)DEAE-Fast Flow離子交換層析，得到2個(gè)洗脫峰（圖1），經(jīng)血凝活性測(cè)定，其中峰2部分具有凝血活性，該活性部分經(jīng)Sephadex G-100柱進(jìn)一步純化，得到3個(gè)洗脫峰（圖2）;經(jīng)血凝活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)第2峰具有血凝活性，而第1峰則無(wú)活性。將第2洗脫峰的洗脫液收集后進(jìn)行透析除鹽，經(jīng)冷凍干燥后得到長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素純品DIL。

2.2 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素亞基相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

如圖3所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素所得為單一條帶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算得到長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為43.6kDa。

2.3 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的血細(xì)胞凝集活性分析

將長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素配制成初始質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的溶液，經(jīng)過(guò)不同倍數(shù)稀釋后測(cè)定其對(duì)鴿、兔、雞、鴨血的凝血活性，結(jié)果表明：長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)4種供試動(dòng)物血細(xì)胞均有一定的凝集作用（表1），但凝集素對(duì)不同種類(lèi)血細(xì)胞的凝集能力有差異，其對(duì)鴿血血細(xì)胞的凝集活性最強(qiáng)（活性達(dá)到2¹⁰），最低凝集質(zhì)量濃度為9.8μg·mL^-1，對(duì)雞血細(xì)胞的凝集作用最差（活性?xún)H為2³），最低凝集質(zhì)量濃度為1.25mg·mL^-1。

2.4 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的糖抑制實(shí)驗(yàn)

如表2所示，經(jīng)過(guò)倍比稀釋?zhuān)鹗假|(zhì)量濃度為10mg·mL^-1的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的糖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：凝集素對(duì)鴿紅細(xì)胞的凝集活性可被D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖所抑制，但抑制程度有差異，而其他供試的4種糖對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性無(wú)抑制作用。

2.5 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的酸堿穩(wěn)定性分析

長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素起始質(zhì)量濃度為10mg·mL^-1，如表3所示，在pH3.0～10.0緩沖系統(tǒng)中的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，其凝集活性在pH4.0～8.0，凝集活性最高;但當(dāng)pH為3.0或9.0～10.0時(shí)，其凝集活性下降較為明顯。

2.6 長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的熱穩(wěn)定性分析

經(jīng)過(guò)30℃～80℃的不同溫度處理后，菌絲體凝集素對(duì)鴿血細(xì)胞的凝集活性結(jié)果如表4所示，當(dāng)處理溫度達(dá)到50℃時(shí)低質(zhì)量濃度凝集素的凝集活性開(kāi)始部分下降;當(dāng)處理溫度達(dá)到70℃，長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)鴿血紅細(xì)胞失去凝集活性，這表明長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)溫度的耐受性較低。

2.7 金屬離子對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性的影響

測(cè)定二價(jià)金屬離子對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性影響的結(jié)果，如表5所示，結(jié)果表明：長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)鴿血紅細(xì)胞的凝集活性與金屬離子有一定相關(guān)性。采用EDTA-Na₂將長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素中的金屬離子去除后，則凝集素活性隨之消失，然而在去除金屬離子的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素溶液中，分別再加入Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺二價(jià)金屬離子，Ca²⁺和Mg²⁺的離子濃度為10mmol·L^-1，可恢復(fù)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素至較高的活性水平，而Zn²⁺和Mn²⁺對(duì)其活性則無(wú)影響，這說(shuō)明長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素凝集活性需要一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺才會(huì)起作用。

3 討論與結(jié)論

本研究利用液體發(fā)酵培養(yǎng)得到長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體，從菌絲體中提取并分離純化得到長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素（DIL）。與傳統(tǒng)的人工栽培長(zhǎng)裙竹蓀（子實(shí)體）相比，通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)獲取長(zhǎng)裙竹蓀菌絲的模式培養(yǎng)周期短、不受氣候影響的優(yōu)點(diǎn)，能較容易地提供大量原料資源用于提取長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素，為今后可能的工業(yè)化生產(chǎn)提供了保證。本研究測(cè)定的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為43.6kDa，略小于林玉滿等[10]報(bào)道的棘托竹蓀子實(shí)體凝集素的亞基;并且長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)溫度的耐受性較低，對(duì)熱不穩(wěn)定，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，但是本研究分離純化的長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素在溫度70℃時(shí)失去活性，略高于林玉滿等[10]（60℃）的報(bào)道。

凝集素能與糖類(lèi)分子專(zhuān)一性結(jié)合，這也是凝集素重要的特征之一，凝集素的糖結(jié)合位點(diǎn)的形狀、大小、糖決定簇在糖鏈中的位置及配體糖的構(gòu)象在這種專(zhuān)一性結(jié)合中起著決定性的作用[14]。糖對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素抑制試驗(yàn)表明，供試的D-半乳糖和N-乙酰胺基-葡萄糖能抑制其對(duì)鴿血紅細(xì)胞的凝集活性，而D-甘露糖、D-海藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性無(wú)抑制作用，這與長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素結(jié)合細(xì)胞受體的糖結(jié)合專(zhuān)一性有關(guān)。根據(jù)這一特性，以后對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的純化可以采用含有D-半乳糖或N-乙酰胺基-葡萄糖單糖鏈的親和層析，以提高純化效率。

在測(cè)定二價(jià)金屬離子Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素的凝集活性影響的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)鴿血紅細(xì)胞的凝集活性依賴(lài)于一定濃度的Ca²⁺和Mg²⁺，Mg²⁺和Mn²⁺對(duì)其活性則無(wú)影響，這與林玉滿和蘇愛(ài)華[14]所報(bào)道的二價(jià)金屬離子對(duì)短裙竹蓀凝集素凝集活性的影響結(jié)果一致。

有關(guān)真菌凝集素對(duì)小鼠的急性毒性的研究報(bào)道較少，而且有報(bào)道指出，棘托竹蓀凝集素[10]對(duì)小鼠的半致死劑量顯著低于草菇凝集素[15]和楊樹(shù)菇凝集素[16]。因此，后續(xù)的工作我們將重點(diǎn)開(kāi)展長(zhǎng)裙竹蓀菌絲體凝集素對(duì)小鼠的急性毒性的研究，為進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)系列產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林海清）

收稿日期：2019-10-30初稿;2019-11-15修改稿

作者簡(jiǎn)介：林勇（1970-），男，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物研究與應(yīng)用（E-mail：lforesty@163.com）

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類(lèi)專(zhuān)項(xiàng)（201581020-4）;福建省科技特派員項(xiàng)目（閩財(cái)指[2019]476號(hào)）