廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)氣單胞菌耐藥狀況的調(diào)查分析

鄧玉婷 譚愛萍 張瑞泉 趙飛 姜蘭

摘要：【目的】了解廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)氣單胞菌的耐藥狀況，為評(píng)估水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā?014—2016年每年7—9月分別對(duì)廣東佛山、肇慶、韶關(guān)和陽(yáng)江等4市6區(qū)（縣）16個(gè)養(yǎng)殖戶共20個(gè)池塘（均為無(wú)發(fā)病史池塘）進(jìn)行動(dòng)物樣品及環(huán)境樣品采集，分離純化氣單胞菌，然后采用微量二倍稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)14種抗菌藥物的敏感性。【結(jié)果】從采集的590份樣品中分離純化獲得1143株氣單胞菌，鑒定為8個(gè)種，分別為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，占60.28%）、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌（A. jandaei，占18.11%）、溫和氣單胞菌（A. sobria，占7.96%）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila，占7.09%）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae，占5.86%）、達(dá)卡氣單胞菌（A. dhakensis，占0.35%）、A. simiae（占0.26%）和舒伯特氣單胞菌（A. schubertii，占0.09%）。1143株分離菌株對(duì)14種抗菌藥物的敏感性表現(xiàn)不一，其中，對(duì)氨芐西林的耐藥率最高（97.81%），對(duì)磺胺間甲氧嘧啶和萘啶酸中度耐藥（69.55%和46.72%），對(duì)其他11種抗菌藥物相對(duì)敏感，耐藥率均在20.00%以下。豚鼠氣單胞菌的多重耐藥率最高（25.37%），其次是嗜水氣單胞菌（11.11%），溫和氣單胞菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和維氏氣單胞菌對(duì)各類抗菌藥物相對(duì)敏感，多重耐藥率分別為2.20%、1.93%和1.74%。畜禽糞便分離菌株的多重耐藥率較高（10.53%），其次是魚組織分離菌株（5.88%），而池塘水和底泥分離菌株相對(duì)敏感，多重耐藥率分別為3.35%和1.95%。畜禽—魚復(fù)合養(yǎng)殖模式和非復(fù)合養(yǎng)殖模式氣單胞菌分離菌株均對(duì)新霉素完全敏感，但前者對(duì)其他13種藥物的耐藥率均高于后者;高密度養(yǎng)殖雜交鱧及復(fù)合養(yǎng)殖模式下團(tuán)頭魴和麥鯪源分離菌株的耐藥率較高，而一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較低的品種如羅非魚和草魚，其分離菌株多重耐藥率較低?！窘Y(jié)論】廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)氣單胞菌耐藥率總體水平不高，耐藥程度與養(yǎng)殖水平、用藥習(xí)慣及養(yǎng)殖模式等有關(guān)，磺胺類耐藥性已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌病害防治過程中最突出的問題，因此，非常有必要開展水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)，了解其發(fā)展趨勢(shì)及傳播風(fēng)險(xiǎn)，為評(píng)估水產(chǎn)品質(zhì)量安全及指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 氣單胞菌;抗菌藥物;耐藥性;水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū);廣東

中圖分類號(hào)： S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）11-2375-09

Antimicrobial resistance of Aeromonas isolates from

aquaculture areas in Guangdong

DENG Yu-ting1，2， TAN Ai-ping1， ZHANG Rui-quan1， ZHAO Fei1， JIANG Lan1*

（1Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology， Pearl River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Fishery Drug Development， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology， Guangzhou? 510380， China; 2Key Laboratory of Control of Quality and Safety for Aquatic Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing? 100141， China）

Abstract：【Objective】Antimicrobial resistance of Aeromonas isolates from aquaculture areas in Guangdong was stu-died to provide reference for evaluating risks of antimicrobial resistance in aquaculture. 【Method】Aeromonas samples from animals and aquatic environment were collected at 20 ponds from 16 farmers in 6 districts（counties）， 4 cities（Foshan， Zhaoqing， Shaoguan and Yanguan） in Guangzhou from July to September during 2014 to 2016. Aeromonaswere isolated and purified， all the isolates were tested for resistance to 14 antimicrobial agents by two-fold micro dilution method. 【Result】Five hundred and ninety samples were collected and a total of 1143 Aeromonas isolates were isolated and identified. Eight species were identified， they were A. veronii（60.28%）， A. jandaei（18.11%）， A. sobria（7.96%），A. hydrophila（7.09%），A. caviae（5.86%），A. dhakensis（0.35%），A. simiae（0.26%） and A. schubertii（0.09%）. Diversity of susceptibilities of 1143 Aeromonas isolates to 14 antimicrobial agents was determined. Aeromonas isolates showed highest resistance to ampicillin（97.81%）， and medium resistance to sulfanilamide and nalidixic acid， whose resistance rates were 69.55% and 46.72%， respectively. The isolated were susceptible to the other 11 drugs with resistance rate all being below 20.00%. Multi-drug resistance of A. caviae was the highest（25.37%）， followed by A. hydrophila（11.11%）， A. sobria， A. jandaei and A. veronii were sensitive to all the drugs， with multi-drug resistance rates being 2.20%， 1.93% and 1.74%. The isolates from livestock feces had high multi-drug resistance rate（10.53%）， followed by isolates from fish tissue（5.88%）. The isolates from pond water and sediment were susceptible with multi-drug resistance rates being 3.35% and 1.95%. Comparing different types of aquaculture systems， the isolates collected from the livestock-fish integrated breeding and non-integrated farming were all susceptible to neomycin， but the resistance to other 13 drugs of isolates from livestock-fish integrated breeding was higher than the non-integrated farming. The isolates from the hybrid snakehead cultured with high stocking density and the isolates from Megalobrama amblycephala and Cirrhina mrigala cultured in livestock-fish farm showed high resistance， but for the fishes with lower economic values such as tilapia and grass carp， their multi-resistance rates were low. 【Conclusion】These results indicate that the overall resistance rate of Aeromonas isolated from different origins in aquaculture areas in Guangdong is not very high， the resistance maybe related to the development of farming， the habits of drug prescribing and the types of aquaculture systems， etc. The resistance to sulfanilamide grous has become a serious problem in disease control during aquaculture. It is very urgent to monitor the antimicrobial resistance in aquaculture to understand its occurrence and transmission， and to provide reference for evaluating the quality safety of aquatic products and clinical rational use of medicine.

Key words： Aeromonas; antimicrobial agent; antimicrobial resistance; aquaculture areas; Guangdong

0 引言

【研究意義】廣東是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主產(chǎn)區(qū)之一，養(yǎng)殖品種眾多，除四大家魚外還有產(chǎn)量較高的特色經(jīng)濟(jì)品種，包括鱸魚、烏鱧、羅非魚、鱖魚和鰻鱺等（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，2018）。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖集約化程度、養(yǎng)殖密度和水產(chǎn)品總量不斷攀升，隨之出現(xiàn)的水質(zhì)環(huán)境惡化、疾病暴發(fā)流行、病原微生物耐藥性增強(qiáng)及水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題日益突出。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中廣泛使用的抗菌藥物主要有磺胺類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類等（汪建國(guó)，2013），而在水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題的諸多影響因素中，除藥物殘留外，細(xì)菌耐藥性問題也是近年來(lái)全球關(guān)注的熱點(diǎn)之一（孟思妤等，2012;Miller and Harbottle，2018）。因此，加強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌耐藥性研究，尤其是開展水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)工作，了解水產(chǎn)病原菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性變化，對(duì)評(píng)估水產(chǎn)品質(zhì)量安全及指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖使用抗菌藥物所產(chǎn)生的耐藥情況，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展了一系列調(diào)查研究工作（李國(guó)烈等，2012;王靜波等，2012;朱芝秀等，2012）。丁正峰等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，分離自患病水產(chǎn)動(dòng)物的氣單胞菌（Aeromonas spp.）、弗尼斯弧菌（Vibrio fluvialis）及類志賀鄰單胞菌（Plesimonas shigelloides）等病原菌對(duì)喹諾酮類藥物的總體耐藥率高達(dá)62.50%，對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥率為50.50%，對(duì)氯霉素類和四環(huán)素類的耐藥率較低，分別為11.85%和10.35%。吳雅麗等（2013）測(cè)定了1995—2012年112株來(lái)源于不同患病水產(chǎn)動(dòng)物的氣單胞菌對(duì)20種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示其對(duì)萘啶酸、磺胺類及四環(huán)素類的耐藥率均在40.00%以上，而對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢喹肟、阿米卡星及多西環(huán)素等廣譜藥物較敏感，耐藥率在15.00%以下。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大力開展水產(chǎn)病原菌耐藥性研究工作，但國(guó)外的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖品種及抗菌藥物使用習(xí)慣等與國(guó)內(nèi)存在明顯差異，其耐藥性調(diào)查的主要對(duì)象為海水魚和海水環(huán)境（Miller and Harbottle，2018;Santos and Ramos，2018），而國(guó)內(nèi)細(xì)菌耐藥性研究尚處在起步階段。一方面，主要集中在從患病淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物分離的病原菌上（劉訓(xùn)猛等，2017;黃艷華等，2018;梁靜真等，2018），調(diào)查菌種一般在100株左右，數(shù)據(jù)量較小;另一方面，水產(chǎn)病原菌藥物敏感性檢測(cè)主要采用紙片擴(kuò)散法（K-B），雖然該方法操作簡(jiǎn)單，但只能用于判斷菌株對(duì)某種抗菌藥物是否耐藥的定性分析（劉亞等，2018），無(wú)法測(cè)定菌株的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）而進(jìn)行定量分析，了解其在特定時(shí)段的藥物敏感性變化規(guī)律;此外，與人醫(yī)臨床和動(dòng)物源（畜禽）細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)相比，水產(chǎn)養(yǎng)殖源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)尚未具備系統(tǒng)性、持續(xù)性和廣泛性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】氣單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，廣泛存在于水環(huán)境和水生動(dòng)物中，也可從動(dòng)物和人類的腸道內(nèi)分離獲得（Janda and Abbott，2010），目前已鑒定的氣單胞菌有36個(gè)種、12個(gè)亞種（Martin-Carnahan and Joseph，2015）。氣單胞菌多為條件致病菌，可引起水生動(dòng)物腸炎或敗血癥等，也可引起人類或其他動(dòng)物腸炎等（Janda and Abbott，2010;肖艷翼等，2015;葛陽(yáng)楊等，2017）。與從患病動(dòng)物上分離獲得的病原菌耐藥情況不同，在未發(fā)病動(dòng)物及其生長(zhǎng)環(huán)境中分離得到的氣單胞菌對(duì)大部分廣譜抗菌藥物敏感（馮永永等，2016），因此，氣單胞菌可作為研究水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌耐藥性的指示菌，但至今鮮見針對(duì)無(wú)發(fā)病狀態(tài)下水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及水產(chǎn)動(dòng)物源氣單胞菌對(duì)抗菌藥物敏感性的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】2014—2016年連續(xù)3年在廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)開展氣單胞菌耐藥性調(diào)查，從水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物及其養(yǎng)殖環(huán)境中分離氣單胞菌，通過微量二倍稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，分析不同養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖品種和養(yǎng)殖模式中氣單胞菌的耐藥情況，為評(píng)估水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集及細(xì)菌分離培養(yǎng)

2014—2016年每年7—9月分別對(duì)廣東佛山、肇慶、韶關(guān)和陽(yáng)江等4市6區(qū)（縣）16個(gè)養(yǎng)殖戶共20個(gè)池塘（均為無(wú)發(fā)病史池塘）進(jìn)行動(dòng)物樣品及環(huán)境樣品采集。動(dòng)物樣品包括畜禽樣品和魚樣品，畜禽樣品用無(wú)菌棉簽取肛門糞便，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)10份;魚樣品取其鰓、肝臟和腸道等臟器，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)5～10尾魚。環(huán)境樣品包括池塘水和池塘底泥，環(huán)繞池塘不同方向選取5個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)以采水器采集池塘表面以下20～30 cm的池塘水500 mL;底泥采集則選擇池塘水采集的同一采樣點(diǎn)，用采泥管采集底泥約50 g。共采集各類樣品590份，包括池塘水152份、池塘底泥119份、魚組織233份及畜禽糞便86份（表1）。

處理過的樣品濾液或組織液用生理鹽水梯度稀釋后，涂布于氣單胞菌選擇性RS瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，挑選3～5個(gè)特征單菌落接種至RS瓊脂純化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再經(jīng)氧化酶鑒定，陽(yáng)性菌株置于4 ℃保存，或經(jīng)分子鑒定為氣單胞菌的分離菌株采用真空冷凍干燥后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 菌株鑒定

取過夜培養(yǎng)的分離菌株培養(yǎng)液，按細(xì)菌基因組試劑盒（美國(guó)OMEGA公司）說(shuō)明提取并純化細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)Borrell等（1997）、Yá?ez等（2003）的方法分別合成擴(kuò)增16S rRNA序列和gyrB基因的特異性引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1. 3 藥物敏感性測(cè)定

藥物敏感性測(cè)定采用微量二倍稀釋法，參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)判斷分離菌株的藥物敏感性，并以大腸埃希菌（Escherichia coli） ATCC25922作為質(zhì)控菌株。選取廣譜抗菌藥物七大類14種藥物，包括磺胺類及其增效劑：磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶（Sulfamethoxazole/trimethoprim，SXT）;四環(huán)素類：多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）;喹諾酮類：萘啶酸（Nalidixic acid，NAL）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）和環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）;氨基糖苷類：新霉素（Neomycin，NEO）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）和阿米卡星（Amikacin，AMK）;β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林（Ampicillin，AMP）和頭孢噻肟（Cefotaxime，CTX）;酰胺醇類：氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)FC）和氯霉素（Chloramphenicol，CHL）;呋喃類：呋喃妥因（Nitrofurantoin，NIT）。同時(shí)設(shè)無(wú)藥無(wú)菌的陰性對(duì)照和無(wú)藥有菌的陽(yáng)性對(duì)照。于每孔中加入上述稀釋至1×106 CFU/mL的菌液100 μL，置于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～24 h，取出觀察結(jié)果。對(duì)照組菌株生長(zhǎng)良好時(shí)，以肉眼觀察到能抑制菌株生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為其對(duì)氣單胞菌的MIC。根據(jù)MIC，統(tǒng)計(jì)各抗菌藥物對(duì)分離菌株的MIC50和MIC90（分別指抑制50%和90%分離菌株生長(zhǎng)所需要的MIC）;同時(shí)根據(jù)Magiorakos等（2012）對(duì)多重耐藥（Multiple drug resistance，MDR）的定義標(biāo)準(zhǔn)——對(duì)特定抗菌藥物中的3類或3類以上（每類中1種或1種以上）抗菌藥物不敏感，對(duì)分離菌株進(jìn)行多重耐藥分析，并統(tǒng)計(jì)其多重耐藥率。

2 結(jié)果與分析

2. 1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從590份不同來(lái)源的樣品中共分離純化獲得氣單胞菌1143株（表1），通過分子鑒定為8個(gè)種，分別為維氏氣單胞菌（A. veronii）（689株，占60.28%）、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌（A. jandaei）（207 株，占18.11%）、溫和氣單胞菌（A. sobria）（91株，占7.96%）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）（81株，占7.09%）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）（67株，占5.86%）、達(dá)卡氣單胞菌（A. dhakensis）（4株，占0.35%）、A. simiae（3株，占0.26%）和舒伯特氣單胞菌（A. schubertii）（1株，占0.09%）（表2）。

2. 2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 總體耐藥情況 1143株分離菌株對(duì)14種抗菌藥物的敏感性表現(xiàn)不一（表3），其中，對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，為97.81%，與氣單胞菌對(duì)氨芐西林固有耐藥有關(guān);對(duì)磺胺間甲氧嘧啶和萘啶酸中度耐藥，耐藥率分別為69.55%和46.72%;對(duì)喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、酰胺醇類、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶和頭孢噻肟相對(duì)敏感，耐藥率均在20.00%以下。

比較不同年份氣單胞菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥情況（表3），發(fā)現(xiàn)2014年分離菌株主要對(duì)磺胺間甲氧嘧啶耐藥，其次是萘啶酸;與2014年分離菌株相比，2015年分離菌株對(duì)除頭孢噻肟外的其他13種抗菌藥物的耐藥率均略有增加;2016年分離菌株對(duì)磺胺間甲氧嘧啶耐藥較嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)82.77%;所有分離菌株對(duì)氨基糖苷類、頭孢菌素類和喹諾酮類藥物較敏感，耐藥率均低于10.00%。

比較各抗菌藥物對(duì)分離菌株的MIC50和MIC90，發(fā)現(xiàn)磺胺間甲氧嘧啶的MIC50和MIC90均在耐藥范圍內(nèi)，說(shuō)明該藥物的耐藥性較嚴(yán)重;萘啶酸和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的MIC90也在耐藥范圍內(nèi)，說(shuō)明這兩種藥物的耐藥性相對(duì)嚴(yán)重;雖然其他藥物的MIC50和MIC90處在敏感值范圍，但部分藥物的MIC50和MIC90呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。不同年份分離菌株的耐藥性存在差異，可能與采樣區(qū)域、養(yǎng)殖類型及養(yǎng)殖品種等不同有關(guān)。

2. 2. 2 不同種屬氣單胞菌耐藥率比較 除達(dá)卡氣單胞菌（4株）、A. simiae（3株）及舒伯特氣單胞菌（1株）外，對(duì)其余5個(gè)種（1135株分離菌株）進(jìn)行不同種屬氣單胞菌的耐藥率比較（圖1），發(fā)現(xiàn)豚鼠氣單胞菌對(duì)14種抗菌藥物中的10種耐藥率高于其他菌種，多重耐藥率為25.37%;其次是嗜水氣單胞菌，其多重耐藥率為11.11%;而溫和氣單胞菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和維氏氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物相對(duì)敏感，多重耐藥率分別為2.20%、1.93%和1.74%。

2. 2. 3 不同來(lái)源氣單胞菌耐藥率比較 比較不同來(lái)源氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥情況（圖2），發(fā)現(xiàn)動(dòng)物來(lái)源樣品（畜禽糞便和魚組織）分離菌株的耐藥性普遍高于環(huán)境來(lái)源（池塘水和底泥）的分離菌株。畜禽糞便分離菌株的多重耐藥率較高，達(dá)10.53%;其次是魚組織分離菌株，多重耐藥率為5.88%;而池塘水和底泥分離菌株相對(duì)敏感，對(duì)應(yīng)的多重耐藥率分別為3.35%和1.95%。

2. 2. 4 不同養(yǎng)殖模式氣單胞菌耐藥率比較 比較不同養(yǎng)殖模式下氣單胞菌的耐藥性，一種模式為主養(yǎng)草魚且池塘旁邊同時(shí)圈養(yǎng)豬、鴨或鵝的復(fù)合養(yǎng)殖模式（6個(gè)池塘），一種為以主養(yǎng)草魚、混養(yǎng)其他四大家魚的非復(fù)合養(yǎng)殖模式（4個(gè)池塘）。兩種養(yǎng)殖模式下的氣單胞菌分離菌株均對(duì)新霉素完全敏感，但復(fù)合養(yǎng)殖模式分離菌株對(duì)其他13種藥物的耐藥率均高于非復(fù)合養(yǎng)殖模式分離菌株，多重耐藥率為2.02%（圖3），只養(yǎng)魚的養(yǎng)殖池塘其分離菌株未出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。

2. 2. 5 不同養(yǎng)殖魚類氣單胞菌耐藥率比較 比較不同養(yǎng)殖魚類分離菌株的耐藥性（圖4），發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖雜交鱧（Channa maculate ♀×C. argus ♂）源分離菌株的耐藥情況較嚴(yán)重，對(duì)萘啶酸、磺胺類及氟苯尼考的耐藥率均超過80.00%，對(duì)多西環(huán)素中度耐藥，其多重耐藥率達(dá)55.00%;復(fù)合養(yǎng)殖模式下，與草魚（Ctenopharyngodon idella）一起混養(yǎng)的團(tuán)頭魴（Me-galobrama amblycephala）源分離菌株及作為喂養(yǎng)鱖（Siniperca chuatsi）餌料魚麥鯪（Cirrhina mrigala）源分離菌株的耐藥率也相對(duì)較高，主要對(duì)磺胺間甲氧嘧啶和萘啶酸中度耐藥，多重耐藥率分別為24.00%和10.53%;羅非魚（Oreochromis niloticus）和草魚源分離菌株最敏感，對(duì)氨基糖苷類的3種藥物完全敏感，其多重耐藥率分別為1.30%和0.46%;18株鱖源分離菌株中只有1株嗜水氣單胞菌同時(shí)對(duì)酰胺醇類、磺胺類和慶大霉素耐藥。

3 討論

目前，使用抗菌藥物仍是防控水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性病害的主要措施之一，鑒于全球?qū)?xì)菌耐藥性的關(guān)注與重視，近年來(lái)我國(guó)在水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌耐藥性方面也開展了大量研究工作。丁正峰等（2011）對(duì)2006—2009年分離自江蘇省的480株病原菌進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)患病水產(chǎn)動(dòng)物中氣單胞菌的檢出率達(dá)72.80%，且這些氣單胞菌分離菌株對(duì)部分喹諾酮類、磺胺類和氯霉素類藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性，耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)。吳雅麗等（2013）對(duì)廣東地區(qū)1995—2012年從患病水產(chǎn)動(dòng)物上分離收集的112株氣單胞菌進(jìn)行耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受試菌株對(duì)磺胺類和四環(huán)素等藥物中度耐藥，對(duì)氟喹諾酮類、氨基糖苷類和第三代頭孢類藥物相對(duì)敏感，且爬行兩棲類和觀賞魚源菌株的多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。此外，有學(xué)者對(duì)不同地區(qū)不同水產(chǎn)動(dòng)物源氣單胞菌進(jìn)行耐藥性分析，同樣發(fā)現(xiàn)分離菌株主要對(duì)磺胺類耐藥，部分分離菌株對(duì)氟苯尼考和四環(huán)素等耐藥，對(duì)氟喹諾酮類和氨基糖苷類等藥物的敏感性較高（王靜波等，2012;朱芝秀等，2012）。

本研究的氣單胞菌主要分離自無(wú)發(fā)病史的養(yǎng)殖動(dòng)物及其養(yǎng)殖環(huán)境，與臨床分離獲得（患病動(dòng)物）的氣單胞菌相比，同樣表現(xiàn)為對(duì)磺胺類藥物，尤其是對(duì)單方的磺胺類藥物耐藥，耐藥率高達(dá)80.00%以上;磺胺類是最早應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌病防控的抗菌藥物之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上已有20多年的使用歷史。本研究結(jié)果與前人的相關(guān)研究結(jié)果（丁正峰等，2011;王靜波等，2012;吳雅麗等，2012;朱芝秀等，2012）均表明，長(zhǎng)期使用該類藥物已不可避免地產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，因此臨床上應(yīng)盡量減少使用。有研究報(bào)道，2010年以前的臨床分離病原菌對(duì)酰胺醇類氯霉素和硝基呋喃類表現(xiàn)部分耐藥，氯霉素耐藥率在10%～15%，呋喃唑酮耐藥率在5%～10%（李愛華等，2001;吳雅麗等，2013）;而本研究中2014—2016年分離菌株對(duì)氯霉素的耐藥率在10.00%左右，對(duì)呋喃妥因的耐藥率在1.00%以下。氯霉素和硝基呋喃類藥物曾廣泛用于治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病（李輝華和王廣軍，2001），但由于這兩種藥物毒性大，對(duì)人體產(chǎn)生危害，現(xiàn)已將其列為禁用獸藥。本研究通過檢測(cè)氣單胞菌分離菌株對(duì)氯霉素和呋喃妥因的敏感性，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物的耐藥率均很低，對(duì)禁用獸藥的耐藥性檢測(cè)可從側(cè)面反映藥物停止使用能有效恢復(fù)菌株的敏感性。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)上建議采用輪換用藥的方式，以降低耐藥性產(chǎn)生和傳播風(fēng)險(xiǎn)。

以往我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物病源菌耐藥性調(diào)查的研究對(duì)象主要為從發(fā)病動(dòng)物體內(nèi)分離獲得的菌株，從淡水水生動(dòng)物分離出的氣單胞菌以嗜水氣單胞菌為主（李愛華等，2001;王靜波等，2012;朱芝秀等，2012）。本研究的調(diào)查結(jié)果顯示，正常養(yǎng)殖狀況下不管是從魚組織還是其養(yǎng)殖環(huán)境分離獲得的氣單胞菌種類主要為維氏氣單胞菌（占60.28%），與近年報(bào)道的魚類氣單胞菌病原以維氏氣單胞菌為主（王一娟，2010;張德鋒等，2015）相符，說(shuō)明維氏氣單胞菌有可能成為另一種重要的致病菌。本研究還發(fā)現(xiàn)不同種屬氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的敏感性差異明顯，以豚鼠氣單胞菌的多重耐藥率最高（25.37%），可能與其在畜禽糞便中的分離率較高有關(guān);其次是嗜水氣單胞菌，多重耐藥率為11.11%;溫和氣單胞菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和維氏氣單胞菌的多重耐藥率相對(duì)較低，均在2.00%左右。綜合其他水產(chǎn)病原菌的耐藥分析結(jié)果（李愛華等，2001;王靜波等，2012;朱芝秀等，2012）可知，嗜水氣單胞菌的耐藥性比其他氣單胞菌種類高很多，且作為一種致病性非常強(qiáng)的條件病原菌，一旦產(chǎn)生耐藥性將給臨床治療帶來(lái)極大困難。因此，氣單胞菌作為養(yǎng)殖水體和水生動(dòng)物體普遍存在的一種細(xì)菌，尤其是維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的指示菌，通過掌握其耐藥相對(duì)水平，可為評(píng)估水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌耐藥性和指導(dǎo)水生動(dòng)物細(xì)菌性病害防控提供參考依據(jù)。

抗菌藥物在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的長(zhǎng)期使用極易誘導(dǎo)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生耐藥菌株，且這些耐藥菌株及其攜帶的耐藥基因可隨糞尿排放，在水產(chǎn)環(huán)境中傳播擴(kuò)散（Heuer et al.，2011）。本研究對(duì)不同來(lái)源的氣單胞菌進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)從畜禽糞便分離的氣單胞菌對(duì)多種藥物耐藥，尤其對(duì)萘啶酸、氟苯尼考和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率均高于其他來(lái)源的氣單胞菌，可能與畜禽養(yǎng)殖大量使用這些藥物有關(guān);分離自畜禽糞便和魚組織的氣單胞菌耐藥率比環(huán)境源氣單胞菌高，豬（禽）—四大家魚復(fù)合養(yǎng)殖下氣單胞菌分離菌株的耐藥率比非復(fù)合養(yǎng)殖模式分離菌株的耐藥率高很多，且后者未出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。鐘曉霞等（2017）檢測(cè)了廣東鴨—魚立體養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因的污染情況，發(fā)現(xiàn)鴨糞中耐藥基因的相對(duì)豐度較池塘水和底泥高一個(gè)數(shù)量級(jí)。Su等（2011）、Zhang等（2013）、馮永永等（2016）均研究發(fā)現(xiàn)在廣東地區(qū)畜禽—魚復(fù)合養(yǎng)殖模式下分離的耐藥菌株多重耐藥嚴(yán)重，且從分離菌株中檢測(cè)出大量耐藥基因，其中磺胺類和四環(huán)素類耐藥基因污染最嚴(yán)重。表明養(yǎng)殖業(yè)使用抗菌藥物已不可避免地產(chǎn)生耐藥菌，尤其畜禽與魚混養(yǎng)的方式可能會(huì)促使耐藥菌由動(dòng)物向水環(huán)境傳播擴(kuò)散。

在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的珠三角地區(qū)，傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖已逐漸向高密度精養(yǎng)和集約化養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變，高密度養(yǎng)殖已成常態(tài)。本研究對(duì)比分析不同養(yǎng)殖品種分離菌株的耐藥率，發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖品種如雜交鱧，其多重耐藥現(xiàn)象比其他品種更嚴(yán)重，多重耐藥率高達(dá)55.00%;其次是畜禽復(fù)合養(yǎng)殖模式下混養(yǎng)的團(tuán)頭魴和作為喂養(yǎng)鱖的餌料魚麥鯪，其分離菌株多重耐藥率分別為24.00%和10.53%;而一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較低的品種如羅非魚和草魚，其分離菌株多重耐藥率較低，只有1.30%和0.46%。也有研究報(bào)道，工廠化養(yǎng)殖、高密度養(yǎng)殖或一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的品種，如鰻鱺、龜鱉和觀賞魚，其分離菌株多重耐藥率遠(yuǎn)高于四大家魚和蝦等養(yǎng)殖品種（Deng et al.，2014;譚愛萍等，2014;吳小梅等，2015）。盡管本研究調(diào)查結(jié)果顯示，水產(chǎn)養(yǎng)殖源氣單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率總體水平不高，但對(duì)部分水產(chǎn)養(yǎng)殖常用抗菌藥物如磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、恩諾沙星和氟苯尼考的耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，其他類藥物也存在耐藥性遞增的隱患。

4 結(jié)論

廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)氣單胞菌耐藥率總體水平不高，耐藥程度與養(yǎng)殖水平、用藥習(xí)慣及養(yǎng)殖模式等有關(guān)，磺胺類耐藥性已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌病害防治過程中最突出的問題，因此，非常有必要開展水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)，了解其發(fā)展趨勢(shì)及傳播風(fēng)險(xiǎn)，為評(píng)估水產(chǎn)品質(zhì)量安全及指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）