甘藍(lán)型油菜再生體系中的種子滅菌和生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

傅淑 劉昭霞 陳金芝 孫庚曉 孫翠英 陳進(jìn) 楊廣

摘要：[目的]植物的種子滅菌和生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的重要步驟。目前已報道的用于甘藍(lán)型油菜種子滅菌的次氯酸鈉（NaClO）濃度、滅菌時間和生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度均存在較大的差異，因此，本研究旨在篩選出甘藍(lán)型油菜種子的最佳NaClO滅菌處理方法和生根培養(yǎng)基最適的植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度。[方法]比較了甘藍(lán)型油菜的種子經(jīng)不同濃度（濃度范圍為0.1%～30.0%）NaClO滅菌后的發(fā)芽率、健康芽率和菌落率，篩選出最適的種子滅菌NaClO濃度，再在該最適NaClO濃度基礎(chǔ)上找出了最適的種子滅菌時間;通過比較不同質(zhì)量濃度（0.1～2.0mg·L）的植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸（NAA）或吲哚丁酸（IBA）對甘藍(lán)型油菜再生根的促進(jìn)作用，找出油菜生根培養(yǎng)最適的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度。[結(jié)果]甘藍(lán)型油菜種子的最佳滅菌NaClO濃度為2.0%或3.0%，在3.0%NaClO下的最適滅菌時間為15min，種子經(jīng)該滅菌方法處理后的發(fā)芽率和健康芽率分別可達(dá)97.4%和85.9%，且菌落發(fā)生率最少。該油菜種子滅菌的方法也適用于其他9個植物品種，尤其適合于甘藍(lán)型油菜、大白菜和擬南芥的種子滅菌。在生根培養(yǎng)基中添加0.1mg·LNAA對甘藍(lán)型油菜再生根的促進(jìn)作用最強(qiáng)，油菜培養(yǎng)7d后即有92.5%的累積生根率，再生根從切點處生長，且再生的須根數(shù)最多。[結(jié)論]本研究優(yōu)化了甘藍(lán)型油菜種子的NaClO滅菌方法和生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度，為高效的油菜組織培養(yǎng)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜;種子滅菌;次氯酸鈉;生根;萘乙酸;吲哚丁酸

中圖分類號：S565.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12-1371-08

0引言

[研究意義]種子滅菌和生根培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的重要步驟。種子滅菌的目的是獲得無菌的愈傷組織，避免后續(xù)的細(xì)胞再生過程受到污染，同時也要盡量減少對種子自身發(fā)芽能力的損傷;生根培養(yǎng)是細(xì)胞再生芽形成植株的最后一步，只有成功生根的再生芽才能成為一顆完整的植株，因此種子滅菌和生根培養(yǎng)對植物組織培養(yǎng)的研究具有重要的意義。[前人研究進(jìn)展]目前，甘藍(lán)型油菜種子滅菌使用最普遍的是NaClO滅菌法，但已報道使用的NaClO濃度和滅菌時間存在著較大的差異，例如有報道使用以下的濃度和滅菌時間：0.1%NaClO滅菌10min、1.0%NaClO滅菌45min、2.0%NaClO滅菌20min、3.0%NaClO滅菌30min、5.0%NaClO滅菌20min、12.5%NaClO滅菌20min、15.0%NaClO滅菌6min和50.0%NaClO滅菌10min等。甘藍(lán)型油菜生根的植物生長調(diào)節(jié)劑種類主要有萘乙酸NAA、吲哚丁酸IBA和吲哚乙酸IAA等，其中常使用的是NAA和IBA2種，但其使用的濃度差異較大，例如NAA的使用質(zhì)量濃度主要為0.1～2.0mg·L，IBA的使用質(zhì)量濃度主要為0.1～5.0mg·L。此外，郝夢宇等對甘藍(lán)型油菜生根培養(yǎng)基的凝固劑、基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化，但并未對生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度進(jìn)行過優(yōu)化。甘藍(lán)型油菜商業(yè)化品種浙大622為2014年浙江省審定推廣的雜交新品種，具有穩(wěn)定高產(chǎn)的優(yōu)點，適宜作為油菜背景材料構(gòu)建轉(zhuǎn)基因油菜新品種。[本研究切入點]甘藍(lán)型油菜種子無菌化的效果與使用的NaClO濃度和滅菌時間之間的關(guān)系，油菜的再生根效果與生根培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA或IBA濃度之間的聯(lián)系均未見系統(tǒng)性的研究報道，有待于進(jìn)一步的優(yōu)化。[擬解決的關(guān)鍵問題]篩選出甘藍(lán)型油菜種子最佳的NaClO滅菌方法和最適的生根培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度，為高效的油菜細(xì)胞再生植株和基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料和環(huán)境

甘藍(lán)型油菜商業(yè)化品種浙大622和其他8種農(nóng)作物品種的種子均購買自福州市的種子零售店，擬南芥種子由本實驗室提供。75%酒精和NaClO原液（有效氯含量≥8%）購買自福州伯樂林生物技術(shù)有限公司，MS固體培養(yǎng)基粉末、硝酸銀（AgNO）、蔗糖、瓊脂粉、NAA和IBA等試劑購買自索萊寶生物科技有限公司。試驗環(huán)境保持在光照度為2000lx、溫度（25±1）℃、相對濕度50%～70%和光周期為16L：8D。

1.2 油菜種子滅菌的NaClO濃度和時間的篩選

1.2.10.1%～30.0%大范圍濃度NaClO的種子滅菌效果比較

挑選飽滿且無傷痕的種子放在水中浸泡1h，挑選沉在水底的種子，自來水沖洗1遍。將種子轉(zhuǎn)移至200mL的組培瓶（直徑6cm，高12cm）內(nèi)，75%酒精消毒1min，無菌水沖洗2遍，再轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)操作。用不同濃度（V/V）NaClO（0.0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%和30.0%）100mL浸泡種子10min，之后用無菌水漂洗6遍，再轉(zhuǎn)移至無菌干燥的濾紙上晾干待播種。另設(shè)一全程僅用無菌水處理種子作為對照組，檢測種子的原始發(fā)芽能力。滅菌后的種子播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基（2.22g·L MS+30g·L蔗糖+8g·L瓊脂粉），5d后記錄種子發(fā)芽數(shù)、健康芽數(shù)（指莖稈高于5cm、子葉正常展開且未染菌的健康苗）和菌落數(shù)，每組處理32顆種子（每8顆種子播種于一個組培瓶內(nèi)），共4個重復(fù)128顆種子。

1.2.2 1.0%～5.0%小范圍濃度NaClO的種子滅菌效果比較

從NaClO大范圍濃度滅菌效果比較的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.0%～5.0%濃度間可能存在一個更加適合的濃度用于種子滅菌。為了驗證這一假設(shè)，設(shè)計了1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%共5組濃度NaClO用于進(jìn)一步的種子滅菌試驗，試驗條件、操作過程和結(jié)果分析均與上述一致。

1.2.3 3.0%NaClO滅菌種子10～30min的效果比較

在篩選到種子滅菌的最佳NaClO濃度（2.0%或3.0%）后，為了進(jìn)一步找出種子在該濃度NaClO下滅菌的最適時間，試驗比較了種子在3.0%NaClO處理種子不同時間（10、15、20、25和30min）后的滅菌效果。每組處理為64顆種子，共3個重復(fù)192顆種子，其他試驗條件、操作過程和結(jié)果分析均與上述一致。

1.3 種子滅菌方法在蕓苔屬作物中的通用性

為了驗證已篩選出的甘藍(lán)型油菜種子滅菌方法對其他蕓苔屬作物的通用性，試驗使用這一種子滅菌方法（即3.0%NaClO處理種子15min）對其他9種植物種子進(jìn)行了種子滅菌效果分析。包括7個蕓苔屬作物：甘藍(lán)（B.oleracea）京豐一號（JF）、白菜型油菜（B.compestris）紅菜苔（HC）、小白菜（B.campestris）夏尊（XZ）、甘藍(lán)型油菜（B.napus）亞科油68（YK）、甘藍(lán)型油菜（B.napus）高油605（GY）、甘藍(lán)型油菜（B.napus）德豐油（DF）和大白菜（B.pekinens～）F、早熟五號（ZS），1個萵苣屬作物萵苣（Lactuca sativa）意大利全年生菜王（SC）和模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana，AT）。試驗條件、操作過程和結(jié)果分析均與種子滅菌的NaClO濃度篩選試驗一致。

1.4NAA/IBA對油菜生根效果的比較

甘藍(lán)型油菜種子經(jīng)3.0%NaClO滅菌15min，播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基5d后，切取高為8-10cm苗的根上部分用于再生根實驗。在生根培養(yǎng)基（443g·LMS+30g·L蔗糖+8g·L瓊脂粉+5mg·LAgNO）內(nèi)分別添加不同質(zhì)量濃度（0.0、0.1、0.5、1.0、2.0mg·L）的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA或IBA。將切去根后的苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基內(nèi)生根培養(yǎng)，每個處理組8株，5次重復(fù)，共40株。每日統(tǒng)計生根情況至24d后，洗去再生根根部的培養(yǎng)基，測量再生根的主根長、生根部位（再生根位置與切點間的距離），并統(tǒng)計再生的須根數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜種子滅菌的NaCIO濃度和處理時間的優(yōu)化

2.1.1 種子滅菌的NaCIO大范圍濃度的初步篩選油菜種子經(jīng)o.0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%和30.0%NaClO滅菌后的發(fā)芽率結(jié)果表明，不同處理組間存在著顯著性的差異（F=203.734，df=6，21，P=0.000），其中種子經(jīng)0.0%、0.1%和1.0%NaClO滅菌后的發(fā)芽率為93.8%～99.2%，顯著地高于其他濃度處理組的種子發(fā)芽率（圖1-A），但與種子的原始發(fā)芽率（95.8%）無顯著性差異（F=3.458，df=3，12，P=0.051），這表明0.0%、0.1%和1.0%NaClO處理組不會損傷油菜種子的發(fā)芽能力。不同濃度NaClO處理組的種子健康芽率存在著顯著性差異（F=98.742，df=6，21，P=0.000），其中種子經(jīng)0.0%、0.1%和1.0%NaClO滅菌后的健康芽率≥75.8%，顯著地高于其他濃度處理組的種子健康芽率（圖1-B）。同樣，不同處理組間的菌落率也存在著顯著性差異（F=12.020，df=6，21，P=0.000），其中種子經(jīng)濃度≥1.0%NaClO滅菌后的菌落率顯著地低于0.0%和0.1%NaClO處理組（圖1-C）。這些結(jié)果表明種子經(jīng)1.0%NaClO處理后的發(fā)芽率和健康芽率最高，同時其菌落率最少，值得注意的是NaCIO濃度在1.0%～5.0%間可能還存在一個更適合種子滅菌的濃度。

2.1.2種子滅菌的NaClO濃度小范圍篩選

種子經(jīng)1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%NaClO滅菌后的發(fā)芽率為85.2%～96.1%，不同處理組的發(fā)芽率無顯著性差異（F=2.190，df=4，15，P=0.120;圖2-A）。不同濃度NaClO滅菌后的種子健康芽率存在顯著性差異（F=21.877，df=4，15，P=0.000），其中種于經(jīng)1.0%、2.0%和3.0%NaClO滅菌后的健康芽率≥82.5%，顯著地高于4.0%和5.0%NaCIO處理組的種子健康芽率（圖2-B）。種子經(jīng)NaClO滅菌后的菌落率也存在著顯著性差異（F=4.977，df=4，15，P=0.009），其中2.0%、3.0%、4.0%和5.0%NaClO處理組的種子菌落率為0.78%～1.56%，顯著地低于1.0%NaClO滅菌種子后的菌落率（圖2-C）。綜上可知，油菜種子在2.0%或3.0%NaClO處理下的滅菌效果最好。

2.1.3種子滅菌的時間篩選種子在3.0%NaClO下滅菌10、15、20、25和30min后的發(fā)芽率（92.2%～97.4%）無顯著性差異（F=2.018，df=4，10，P=0.168;圖3-A）。3.0%NaCIO處理種子10min后的健康芽率顯著地低于其他處理組（F=3.875，df=4，10，P=0.037;圖3-B）。此外，不同處理組的菌落率無顯著性差異（F=1.272，df=4，10，P=0.344;圖3-C）。由此可知，種子經(jīng)3.0%NaClO滅菌15、20、25和30min后的效果優(yōu)于滅菌10min的效果。

2.2 種子滅菌方法在蕓苔屬作物中的通用性

9個植物品種的種子經(jīng)3.0%NaClO滅菌15min后的發(fā)芽率為80.0%～100.0%，其中的6個蕓苔屬植物品種（包括小白菜XZ、大白菜ZS、擬南芥AT、甘藍(lán)型油菜YK、甘藍(lán)型油菜GY和甘藍(lán)型油菜DF）的發(fā)芽率（≥94.4%）顯著地高于其他3個植物品種（F=30.306，df=8，18，P≤0.000;圖4-A、D、E）。這6個發(fā)芽率較高的蕓苔屬植物中的5個（不包括小白菜XZ）的種子健康芽率（≥96.7%）顯著地高于其他4個植物品種（F=30.306，df=8，18，P≤0.000;圖4-B）。此外，7個植物品種（不包括小白菜XZ和大白菜ZS）的菌落率（≤1.11%）顯著地低于其他2個植物品種（F=3.969，df=8，18，P=0.007;圖4-C）。這些結(jié)果表明本文篩選出的甘藍(lán)型油菜種子滅菌的方法也適用于其他植物品種，尤其適合于甘藍(lán)型油菜品種、大白菜品種和模式植物擬南芥。

2.3 油菜生根培養(yǎng)基的NAA/IBA濃度篩選

油菜在含不同濃度NAA/IBA培養(yǎng)基下再生根的累積生根率有顯著性的差異（x=41.062，df=8，P<0.001），其中：油菜在0.1mg·L NAA下的累積生根率最高，在第5日開始生根，第7日達(dá)到92.5%的累積生根率;其次為0.5mg·LNAA、1.0mg·LNAA和1.0mg·LIBA（圖5-A）。同時，油菜在含0.1mg·LNAA培養(yǎng)基下的再生根部位最好（0cm，表示再生根直接從切點處生長），顯著地優(yōu)于其他處理組（F=28.249，df=8，204，P<0.001;圖5-B）;再生的須根數(shù)也顯著地多于其他處理組（F=7.919，df=8，204，P<0.001;圖5-C）。但值得注意的是，油菜在含0.1mg·LNAA培養(yǎng)基下再生的主根長并不是最高的，其主根長低于1.0mg·LIBA或CK處理組的主根長（F=11.265，df=8，204，P<0.001;圖5-D）。綜上可知，0.1mg·L NAA對油菜再生根的累積生根率、生根部位和須根數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，在油菜再生根的研究中應(yīng)優(yōu)先使用0.1mg·LNAA用于根的再生培養(yǎng)。

3討論與結(jié)論

本研究以甘藍(lán)型油菜種子為材料，篩選出了油菜種子滅菌的最適NaClO濃度為2.0%或3.0%，且在3.0%NaClO基礎(chǔ)上找到了最適的種子滅菌時間為15min，其種子滅菌后的發(fā)芽率達(dá)到了96.9%。值得注意的是甘藍(lán)型油菜種子經(jīng)高濃度（30.0%）NaClO滅菌處理后依然有菌落生長，這可能是由于種子體內(nèi)攜帶的內(nèi)生菌污染。在NaClO大范圍濃度的初步篩選和小范圍濃度篩選的2次使用5.0%NaCIO滅菌種子的試驗中，第一次使用5.0%NaClO處理后的種子發(fā)芽率顯著的低于第二次使用該濃度后的種子發(fā)芽率，這可能是由于2次使用的種子的生產(chǎn)批次不同導(dǎo)致的，第一次試驗使用的是前一年剩余的種子（市場上未銷售當(dāng)年最新種子），而第二次使用的是當(dāng)年最新批次的種子。杜燕等也證實過期油菜種子的發(fā)芽能力會降低，種子的滅菌方法需要做進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化。因此，在做植物組織培養(yǎng)再生實驗時，應(yīng)優(yōu)先選擇最新的植物種子作為原材料。

本研究對甘藍(lán)型油菜生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明0.1mg·LNAA最有利于油菜生根，培養(yǎng)7d后即可達(dá)到92.5%的生根率，高于其他報道的甘藍(lán)型油菜的生根率。在生根培養(yǎng)基中使用適宜的NAA/IBA濃度可促進(jìn)再生根在切點處生根，提高主根長和須根數(shù)，但不恰當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑濃度則會影響油菜再生根的效果。本研究篩選出的甘藍(lán)型油菜最適生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度與其他報道的采用0.1mg·LNAA用于油菜轉(zhuǎn)基因抗性再生芽的生根培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度一致，但該植物生長調(diào)節(jié)劑濃度是否也能有效促進(jìn)其他植物品種再生根還有待于進(jìn)一步驗證。

本研究篩選出的甘藍(lán)型油菜種子最適滅菌方法也適用于其他9種植物品種，尤其適合于甘藍(lán)型油菜品種、大白菜品種和模式植物擬南芥，滅菌后的種子發(fā)芽率和健康芽率均≥95.0%，其種子發(fā)芽率均高于前人報道的相關(guān)植物品種的種子發(fā)芽率。但值得注意的是，不同植物品種的種子經(jīng)滅菌后的發(fā)芽率存在著顯著性差異，這可能與不同物種間的差異有關(guān)，也可能與不同種子儲存的外界環(huán)境條件有關(guān)。此外，本研究篩選出的最適種子滅菌方法還可以與其他的種子滅菌方法聯(lián)合使用，進(jìn)一步提高種子滅菌的效果，例如與其他物理滅菌方法、照射滅菌方法和生物抑制滅菌方法等聯(lián)合使用。