赪桐提取物抗菌活性及其對金黃色葡萄球菌的抗菌機理

羅澤萍　潘立衛(wèi)　李麗

摘要：【目的】揭示赪桐提取物（Extracts from Clerodendrum japonicum，EFC）對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌機理，為臨床抗病原菌感染藥及植物殺菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎眉埰瑪U散法和微量肉湯稀釋法測定金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌對EFC的敏感性，明確EFC的抗菌活性;通過試劑盒、流式細(xì)胞儀及掃描電鏡等測定EFC作用后金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、三羧酸（TCA）循環(huán)、可溶性蛋白、胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、細(xì)胞凋亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，研究EFC的抗菌機理?！窘Y(jié)果】EFC對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌3種供試細(xì)菌均具有抗菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強，其抑菌圈（IZ）、最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）分別為19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL。經(jīng)EFC作用10 h后，金黃色葡萄球菌的乳酸脫氫酶（LDH）、鉀離子（K+）及堿性磷酸酶（AKP）外泄分別顯著增加72.0%、43.0%和78.0%（P<0.05，下同），琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）活性分別顯著下降80.0%和36.4%。金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC作用24 h后，與對照組相比，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）組的胞外蛋白含量分別上升28.6%、41.8%和61.5%，胞內(nèi)蛋白含量分別下降40.9%、61.3%和82.5%，胞內(nèi)ROS水平分別增加9.1%、33.5%和51.0%，細(xì)胞凋亡率分別增加24.0%、50.6%和72.8%。經(jīng)EFC作用24 h后，掃描電鏡下的菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則、萎縮、畸形?！窘Y(jié)論】EFC通過破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用。

關(guān)鍵詞： 赪桐;提取物;金黃色葡萄球菌;抑菌機理

中圖分類號： S853.75? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2778-09

Antimicrobial activity of extracts from Clerodendrum japonicum and its antibacterial mechanism on Staphylococcus aureus

LUO Ze-ping1， PAN Li-wei1， LI Li2*

（1College of Chemical and Biological Engineering， Hechi University， Hechi， Guangxi? 546300， China;

2College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530200，? China）

Abstract：【Objective】To reveal the antibacterial mechanism of extracts from Clerodendrum japonicum （EFC） against Staphylococcus aureus， and to provide a theoretical foundation for the research and development of clinical anti-pathogenic bacteria infection drugs and plant fungicides. 【Method】The sensitivity of S. aureus， Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis to EFC was determined by disk diffusion method and microbroth dilution method， and the antibacterial activity of EFC was determined. The changes of cytomembrane， cytoderm， tricarboxylic acid （TCA） cycle， soluble protein， intracellular reactive oxygen species（ROS） level， apoptosis and morphological structure of S. aureus treated with EFC were determined by kit， flow cytometry and scanning electron microscope to study the antibacterial mechanism of EFC. 【Result】EFC had antibacterial activity against S. aureus， S. typhimurium and B. subtilis， among which the antibacterial activity against S. aureus was the strongest， and its bacteriostatic zone（IZ）， minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） were 19.04 mm， 0.50 mg/mL and 1.00 mg/mL， respectively. After 10 h of treatment with EFC， the leakage of lactate dehydrogenase（LDH）， potassium ion（K+） and alkaline phosphatase（AKP） of S. aureus increased significantly by 72.0%， 43.0% and 78.0%， respectively（P<0.05， the same below）. The activities of succinate dehydrogenase（SDH） and malate dehydrogenase（MDH） decreased significantly by 80.0% and 36.4%， respectively. After S. aureus was treated with EFC for 24 h， compared with the control group， the extracellular protein content of 5 MIC， 10 MIC and 20 MIC groups increased by 28.6%， 41.8% and 61.5%， respectively， while the intracellular protein content decreased by 40.9%， 61.3% and 82.5%， respectively. The intracellular ROS level increased by 9.1%， 33.5% and 51.0%， and the apoptosis rate increased by 24.0%， 50.6% and 72.8%， respectively. After 24 h of treatment with EFC， the morphology and structure of the bacteria were irregular， atrophied and deformed under scanning electron microscope. 【Conclusion】By destroying the completeness and permeability of the cytoderm and cytomembrane of S. aureus， EFC affecting protein synthesis which leads to the slowdown of TCA circulation and hence plays a role in antibacterial action. Therefore， strengthening the research on the antibacterial components of EFC is an important way to develop new， efficient and low-toxic anti-pathogenic drugs and plant fungicides.

Key words： Clerodendrum japonicum; extracts; Staphylococcus aureus; antibacterial mechanisms

0 引言

【研究意義】使用抗生素是臨床治療傳染性疾病的主要手段，但隨著抗生素的大量及不合理應(yīng)用，耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，超級耐藥菌也隨之產(chǎn)生（Deng et al.，2015），而如何應(yīng)對多重耐藥菌帶來的危害已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的重要課題之一。中藥作為我國醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，具有獨特的資源優(yōu)勢，且毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性（楊健等，2016;樸喜航和艾紅佳，2017），推測利用中藥及其有效成分控制細(xì)菌感染及降低細(xì)菌耐藥性具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，研究并開發(fā)中藥抗菌制劑對避免耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義。【前人研究進展】赪桐（Clerodendrum japonicum）為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum）植物，該屬植物因具有豐富的化學(xué)成分及獨特的藥理活性而受到廣泛關(guān)注。田軍和孫漢董（1995）應(yīng)用正反相硅膠柱層析、中壓柱層析及制備性薄層層析等手段，從赪桐中分離得到4個苯丙素苷類成分，同時獲得22，23-二氫菠甾醇、豆甾醇、25，26-去氫豆甾醇、烏索酸、丁二酸酐和小麥黃素等化合物。尚冀寧（2010）對赪桐乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4個萃取部分的化學(xué)成分進行分離，結(jié)果鑒定出17種化合物，分別屬于二萜、黃酮、甾體和香豆素等類型。陳俊等（2013）采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加及小鼠棉球肉芽腫等急慢性炎癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赪桐根水提物對急慢性炎癥有明顯的抗炎作用。焦楊等（2016）采用細(xì)胞溶血法研究赪桐醇提取物經(jīng)典途徑和旁路途徑的抗補體活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有較強的經(jīng)典途徑抗補體活性。張樹琳（2018）利用系統(tǒng)溶劑法、正反相硅膠色譜和制備型HPLC等方法從赪桐乙醇提取物的乙酸乙酯中分離獲得35種化合物，其中化合物Japonicum cyclic pentapeptide A、Japonicum cyclic pentapeptide B、Hydroxyhomodestru-xin B及Hydroxydestruxin B具有抗腫瘤活性。目前，關(guān)于赪桐抗菌活性的研究甚少，但已有大量研究表明同屬植物臭牡丹、苦郎樹和大青葉等均具有抑菌活性。臭牡丹提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌和大腸埃希菌等均有較強的抑制作用（劉建新等，2015）;苦郎樹葉提取化合物（KLS-46和KLS-54）對西瓜枯萎病菌、芒果葉枯病菌、甘蔗鳳梨病菌等植物病原真菌有明顯抑菌活性（鄧業(yè)成等，2012）;大青葉粗黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌具有明顯抑制作用（劉富康等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】赪桐在廣西的資源非常豐富，但在臨床上的應(yīng)用并不廣泛，通常作為可供觀賞的園藝栽培植物，其藥理作用及機制尚缺乏系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定赪桐提取物（Extracts from C. japonicum，EFC）對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、三羧酸（TCA）循環(huán)、可溶性蛋白、胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、細(xì)胞凋亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，揭示其抗菌機理，為臨床抗病原菌感染藥及植物殺菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為赪桐的新鮮莖葉，母株采自廣西河池市宜州區(qū)小龍村。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、傷寒桿菌（ATCC13311）和枯草芽孢桿菌（ATCC9372）由河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院制藥工程實驗室保藏提供?；钚匝鯔z測試劑盒（批號S0033）購自碧云天生物技術(shù)研究所;鉀離子（K+）測定試劑盒（批號2018003）購自長春匯力生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號20171212）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（批號20171221）、琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（批號20171225）、蘋果酸脫氫酶（MDH）試劑盒（批號20171225）購自南京建成生物工程研究所;蛋白濃度測定試劑盒（批號20171116）購自北京常萊寶科技有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號20180319）購自上海科華生物工程股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：AUW220D電子天平（日本島津），HVE-50全自動滅菌鍋（日本Hirayama），SW-CJ-IFD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），F(xiàn)orma 3110生化培養(yǎng)箱（美國熱電公司），SU80-40掃描電鏡（日立），DH-20F臺式高速冷凍離心機（長沙市百諾克離心機儀器有限公司），Agilent 8453紫外可見分光光度計（美國安捷倫科技公司），Accuri? C6 Plus流式細(xì)胞儀（美國BD公司），CS-2000高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司），xMark酶標(biāo)儀（美國伯樂BIO-RAD公司）。

1. 2 赪桐提取物制備

將新鮮采摘的赪桐莖葉置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎成粉末。稱取500 g赪桐粉末，80%乙醇（料液比1∶10）超聲波提取3次，每次1 h，合并濾液，濃縮回收乙醇，得浸膏131.8 g，浸膏以少量純化水分散懸浮，再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取，減壓濃縮蒸干溶劑，得到正丁醇相浸膏54.0 g。

1. 3 抑菌圈（IZ）測定

IZ試驗采用紙片擴散法，并以無菌水及慶大霉素作為對照。

1. 4 最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

采用微量肉湯稀釋法（鄭翠萍等，2015）測定EFC的MIC和MBC，設(shè)5次平行試驗，以刃天青作為指示劑，無細(xì)菌生長的孔呈藍(lán)色，有細(xì)菌生長的孔則逐漸由藍(lán)色變成粉色，并設(shè)陽性對照組（加菌和加慶大霉素）及陰性對照組（加菌和加無菌水）。

1. 5 細(xì)胞膜通透性測定

菌體處理方法：在肉湯培養(yǎng)基中分別加入對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌和EFC，使藥物終濃度為2.5 mg/mL，另設(shè)無菌水為空白對照，于37 ℃下130 r/min搖床培養(yǎng)。取各組培養(yǎng)液2.0 mL，4000 r/min離心10 min，棄沉淀，按試劑盒說明測定各時段培養(yǎng)液上清液中的LDH活性（黎芳靖，2018）;按照鉀離子測定試劑盒說明測定各時段培養(yǎng)液上清液中的K+濃度（黃巍等，2017）。

1. 6 細(xì)胞壁通透性測定

菌體處理方法同1.5。按照試劑盒說明測定各時段培養(yǎng)液上清液中的AKP活性（劉昊等，2017）。

1. 7 可溶性蛋白含量測定

在肉湯培養(yǎng)基中分別加入對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌和EFC，使藥物終濃度為0、2.50、5.00和10.00 mg/mL。于37 ℃下130 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)24 h，取各組培養(yǎng)液4000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，測定上清液蛋白含量即胞外可溶性蛋白含量，沉淀用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌3次，再加入蒸餾水5.0 mL，超聲波處理20 min后4000 r/min離心10 min，去除沉淀，然后測定上清液蛋白含量即胞內(nèi)可溶性蛋白含量（李璐等，2016）。蛋白含量參照試劑盒說明進行測定。

1. 8 TCA循環(huán)影響測定

菌體處理方法同1.5。參照Li等（2017）的方法收集菌體，然后根據(jù)試劑盒說明測定各時段培養(yǎng)液上清液中的SDH和MDH活性。

1. 9 胞內(nèi)ROS水平測定

菌體處理方法同1.7。取連續(xù)培養(yǎng)12 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再根據(jù)試劑盒說明采用流式細(xì)胞儀（FCM）測定各樣品熒光強度。

1. 10 細(xì)胞凋亡測定

菌體處理方法同1.7。取連續(xù)培養(yǎng)20 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再根據(jù)試劑盒說明采用FCM測定各樣品熒光強度。

1. 11 超微結(jié)構(gòu)分析

菌體處理方法同1.5。取連續(xù)培養(yǎng)24 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再參照王永剛等（2018）的方法制備電鏡樣品后進行掃描電鏡（SEM）觀察。

1. 12 生長曲線測定方法

菌體處理方法同1.7。紫外分光光度計（600 nm）測定各組培養(yǎng)液中不同時間點的吸光值。

1. 13 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中組間兩兩比較采用 t 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 EFC的IZ、MIC及MBC測定結(jié)果

由表1可知，EFC對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌（G+）、傷寒沙門菌（G?）和枯草芽孢桿菌（G+）的IZ分別為19.04、14.85和10.04 mm，MIC分別為0.50、1.25和2.50 mg/mL，MBC分別為1.00、2.50和5.00 mg/mL。EFC對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，因此有必要對其抑菌機制進行深入研究。

2. 2 細(xì)胞膜完整性測定結(jié)果

細(xì)胞膜是金黃色葡萄球菌的保護屏障之一。LDH是一種胞內(nèi)酶，正常情況下不會外漏，當(dāng)菌體細(xì)胞膜受損時LDH可從胞漿滲出至培養(yǎng)液中，即通過測定培養(yǎng)液中LDH活性的變化可推斷細(xì)胞膜是否完整。細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)離子也可穿過細(xì)胞膜而外泄，導(dǎo)致培養(yǎng)液中離子濃度增加。由圖1和圖2可知，與對照組相比，LDH和K+外泄均呈逐漸增加趨勢，培養(yǎng)至10 h時LDH、K+外泄分別增加72.0%和43.0%，差異顯著（P<0.05，下同）。說明EFC可能具有破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物大量外泄。

2. 3 細(xì)胞壁完整性測定結(jié)果

培養(yǎng)基上清液AKP活性改變可反映菌體細(xì)胞壁通透性的變化，藥物處理后菌液AKP活性增加，說明藥物可破壞菌體細(xì)胞壁，而失去對菌體的保護作用，最終致使細(xì)菌溶解死亡。由圖3可看出，EFC組培養(yǎng)液中的AKP活性較對照組高，并隨著時間的延長而逐漸增強。培養(yǎng)至10 h時AKP活性較對照組增加78.0%，且差異顯著。說明EFC可能具有破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁完整性的作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌胞AKP大量外泄。

2. 4 可溶性蛋白含量測定結(jié)果

由圖4可知，金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC作用24 h后，其胞外蛋白含量與對照組相比呈明顯的上升趨勢，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）組分別上升28.6%、41.8%和61.5%，可能是細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致部分蛋白外漏所致。與對照組相比，胞內(nèi)蛋白含量呈明顯下降趨勢，5MIC、10MIC和20MIC組分別下降40.9%、61.3%和82.5%，可能是EFC對金黃色葡萄球菌蛋白具有一定的抑制作用，通過破壞部分蛋白結(jié)構(gòu)而抑制蛋白合成。

2. 5 TCA循環(huán)影響測定結(jié)果

SDH和MDH是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)控酶，檢測培養(yǎng)液中SDH和MDH的活性能間接反映菌體內(nèi)能量代謝的情況。由圖5和圖6可知，EFC組的SDH和MDH活性與對照組相比明顯下降，連續(xù)培養(yǎng)10 h后SDH和MDH活性分別顯著下降80.0%和36.4%。說明EFC能抑制金黃色葡萄球菌的SDH和MDH活性，進而擾亂菌體內(nèi)能量代謝。

2. 6 胞內(nèi)ROS水平測定結(jié)果

ROS作為細(xì)菌新陳代謝的產(chǎn)物在細(xì)胞中不斷產(chǎn)生和消除，ROS系統(tǒng)失衡會對細(xì)胞造成傷害，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ROS水平變化在一定程度上可反映細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部活性的變化。2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）本身沒有熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，進入胞內(nèi)后可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。DCFH不會通透細(xì)胞膜，因此探針極易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能將無熒光的DCFH氧化生成具有熒光的DCF。本研究通過DCFH-DA單染色法，采用FCM檢測DCF熒光強度以評價細(xì)菌胞內(nèi)ROS水平。由圖7可知，5MIC、10MIC和20MIC組金黃色葡萄球菌的ROS含量與對照組相比分別增加9.1%、33.5%和51.0%，說明EFC可能通過擾亂細(xì)菌ROS平衡而達(dá)到抑制細(xì)菌生長繁殖的作用。

2. 7 細(xì)胞凋亡測定結(jié)果

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在環(huán)境條件改變時為了維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而通過基因調(diào)控使其自動結(jié)束生命的過程。本研究采用Annexin-V/PI復(fù)染法檢測菌體細(xì)胞凋亡，結(jié)果（圖8）顯示，金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC處理后，Annexin V-FITC染色呈陽性且PI染色呈陰性的細(xì)胞即凋亡細(xì)胞（圖右下象限Q4-LR）呈增加趨勢;Annexin V-FITC染色和PI染色均呈陽性的細(xì)胞即壞死細(xì)胞（圖右上象限Q4-UR）也有所增加;Annexin V-FITC染色呈陰性而PI染色呈陽性的細(xì)胞（圖左上象限Q4-UL）則是許可范圍內(nèi)檢測誤差所在象限。細(xì)胞凋亡率=Q4-UR+Q4-LR。由圖8可知，5MIC、10MIC和20MIC組的細(xì)胞凋亡率與對照組相比分別增加24.0%、50.6%和72.8%，說明EFC的抑菌作用可能與其促使金黃色葡萄球菌發(fā)生細(xì)胞凋亡及影響菌體系列基因激活、表達(dá)和調(diào)控有關(guān)。

2. 8 菌體超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

對照組金黃色葡萄球菌在掃描電鏡下外觀飽滿、形態(tài)規(guī)則、表面光滑（圖9-A）;而經(jīng)EFC作用24 h后，掃描電鏡下的菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則、萎縮、畸形（圖9-B）。說明EFC具有破壞菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，可能與破壞菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及抑制蛋白合成等有關(guān)。

2. 9 生長曲線圖繪制結(jié)果

生長曲線可表征菌體的生長規(guī)律，同時反映藥物對細(xì)菌生長增殖周期的抑制情況。由圖10可知，對照組金黃色葡萄球菌培養(yǎng)2 h后開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)22～24 h后進入細(xì)菌穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)26 h后進入衰亡期。加入EFC后，金黃色葡萄球菌的生長受到抑制，其生長曲線發(fā)生明顯改變，未出現(xiàn)快速生長對數(shù)期，說明EFC具有抑制金黃色葡萄球菌生長繁殖的作用，其抑菌機理可能與縮短細(xì)菌分裂速度有關(guān)。

3 討論

細(xì)菌細(xì)胞膜通過調(diào)節(jié)和選擇必需養(yǎng)分及代謝產(chǎn)物進出細(xì)胞，從而維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定和有序運行。K+能維持細(xì)胞內(nèi)外液的滲透壓平衡，當(dāng)細(xì)胞膜通透性增大時，K+大量外泄（Cox et al.，2000）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)EFC作用后金黃色葡萄球菌的胞內(nèi)蛋白、LDH和K+均出現(xiàn)外泄，說明EFC具有破壞菌體細(xì)胞膜或促使細(xì)胞膜通透性增大的作用。AKP存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間，主要參與細(xì)菌磷代謝，當(dāng)細(xì)胞壁通透性增大或受損時會發(fā)生大量AKP外泄（劉昊等，2017）。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)EFC處理后的金黃色葡萄球菌AKP大量外泄，說明EFC具有破壞細(xì)胞壁完整性或增大細(xì)胞壁通透性的作用。蛋白作為生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)廣泛存在于菌體內(nèi)，在藥物作用下菌體蛋白結(jié)構(gòu)受損或合成受抑制，導(dǎo)致部分生物功能消失。經(jīng)EFC處理的金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白含量明顯下降，說明EFC的抑菌機理可能與阻礙菌體某些蛋白合成有關(guān)。

TCA循環(huán)是機體糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式，也是糖、脂類、蛋白及核酸代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐。SDH和MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶（Naseri et al.，2016）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌的MDH和SDH活性較對照組明顯降低，說明EFC的抑菌作用與破壞或抑制TCA循環(huán)有關(guān)。ROS可使類脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成機體多種損傷和病變，而加速衰老（Elloumi et al.，2017;Vassie et al.，2017）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌胞內(nèi)ROS水平與對照組相比明顯增加，說明EFC破壞了菌體ROS與抗氧化系統(tǒng)間的平衡。此外，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌的細(xì)胞凋亡率與對照組相比明顯上升，說明EFC具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

李開泉等（2002）研究發(fā)現(xiàn)烏索酸能抑制金色葡萄糖球菌及酵母的生長;趙雁武等（2003）研究證實3，4-二羥基苯甲醛對金黃葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用;孫濤（2013）研究發(fā)現(xiàn)七星瓢蟲的次生代謝產(chǎn)物對羥基苯乙醇對沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抑菌活性;蔡百祥等（2015）研究表明0.6 mg/mL丁香脂素對油菜菌核病菌的抑制率達(dá)36.72%;石麗娟（2015）研究證實反式對羥基肉桂酸對小麥赤霉病菌的半數(shù)有效濃度（EC50）為10.80 mg/L;熊麗霞（2016）研究發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲醛對釀酒酵母表現(xiàn)出較強的抑制作用，且枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對對羥基苯甲醛也較敏感;陸?。?018）研究證實芹菜素是鴨兒芹發(fā)揮抗氧化和抗菌活性的主要活性成分;楊光等（2018）研究表明對羥基苯甲酸對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用。根據(jù)以上文獻(xiàn)推測，張樹琳（2018）從赪桐提取分離的化合物馬桶花酮、3，4-二羥基苯甲醛、對羥基苯乙醇、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛、丁香脂素和反式對羥基肉桂酸等可能都是赪桐的有效抑菌活性成分。此外，從赪桐中提取獲得的烏索酸（田軍和孫漢董，1995）和芹菜素（尚冀寧，2010）可能也是抑菌活性成分。赪桐化學(xué)成分種類較多，且其單一成分藥理活性作用廣泛。本研究結(jié)果表明，EFC具有較強的抑菌作用，對金色葡萄糖球菌的IZ、MIC、MBC分別為19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL，可能是通過破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮作用，但具體抑菌作用機理有待進一步探究。

4 結(jié)論

EFC通過破壞黃金色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用。因此，加強EFC抑菌活性成分研究是開發(fā)新型、高效、低毒抗病原菌感染藥和植物殺菌劑的重要基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）