沃柑潰瘍病病原菌分離鑒定及防治藥劑篩選

趙洪濤　陳東奎　陳香玲　歐智濤　黃其椿　張?zhí)m

摘要：【目的】明確廣西南寧沃柑潰瘍病病原菌種類，篩選田間能抑制該病害的藥效，為當(dāng)?shù)匚指虧儾〉姆乐翁峁┮罁?jù)?！痉椒ā坎捎媒M織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化培養(yǎng)，根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列分析與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹相結(jié)合的方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。選用14種藥劑，采用平板對(duì)峙法測(cè)定不同藥劑對(duì)沃柑潰瘍病病原菌的室內(nèi)毒力;選取室內(nèi)毒力測(cè)定具有一定抑菌效果的藥劑進(jìn)行田間防治效果試驗(yàn)?！窘Y(jié)果】確定廣西南寧沃柑潰瘍病病原為柑桔黃單胞柑桔亞種（Xanthomonas citri subsp. citri），系A(chǔ)菌系。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，供試的14種藥劑中只有80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑等5種藥劑對(duì)柑橘潰瘍病病原菌表現(xiàn)出一定的抑制效果，在500、1000、2000、4000和8000倍稀釋濃度下，80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果最好，抑菌率為77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，有效中濃度（EC50）較低，為49.09 mg/L;200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的抑菌率為73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%， EC50較高，為81.47 mg/L。田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑和1.6%噻霉酮涂抹劑對(duì)沃柑潰瘍病有較好的防治效果，防效分別為73.45%和71.07%?！窘Y(jié)論】從廣西南寧分離出的沃柑潰瘍病病原菌為強(qiáng)致病性柑桔黃單胞柑桔亞種A菌系，田間可選擇200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物防治。

關(guān)鍵詞： 沃柑;潰瘍病;柑桔黃單胞柑桔亞種;病原鑒定;藥劑篩選;廣西南寧

中圖分類號(hào)： S436.661.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2703-10

Pathogen identification and bactericide screening of

Orah citrus canker

ZHAO Hong-tao1， CHEN Dong-kui1* ， CHEN Xiang-ling1， OU Zhi-tao1，

HUANG Qi-chun1， ZHANG Lan1， LI Guo-guo1， LIU Yao-xin1， YE Yun-feng1， FU Gang2

（1Horticulture Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 2Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】In order to provide the basis for the control of the Orah citrus canker，the Orah citrus canker pathogen was clarified and field medicines were screened in Nanning，Guangxi. 【Method】The bacteria were isolated and purified with tissue separation.And the pathogenicity was verified according to Koch’s rule. It was identified by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis combining establishment of the phylogenetic tree.The pathogen were tested by plate confrontation method，and 14 kinds of bactericide were used to test its toxicities in laboratory，then carried out prevention and control in field. 【Result】The pathogen of Orah citrus canker was identified，which has a strain A of Xanthomonas citri subsp. citri in Nanning，Guangxi. The toxicity test results showed that 80% mancozeb WP， 20billion/g Bacillus subtilis WP，1.6% benziothiazolinone PF，1.8% xinjunan acetate SL and 3% Zhongshengmycin WP manifested evident antibacterial effects.With the dilution of 500， 1000， 2000， 4000 and 8000 times，the 80% mancozeb WP showed the optimal effect in the inhibitory rates of 77.4%， 75.2%， 64.7%， 63.0% and 58.3%， and lower effective concentration （EC50） of 49.09 mg/L; the inhibitory rates of 20 billion/g B.subtilis WP inhibitory rates were 73.5%，67.4%，64.5%，61.5% and 51.2%， and high EC50 was 81.47 mg/L. Field efficacy trials have shown 20 billion/g B. subtilis WP and 1.6% benziothiazolinone PF had good control effect on Orah canker，the control effects were 73.45% and 71.07% respectively. 【Conclusion】The pathogenof Orah citrus canker is identified as X.citri subsp. citri strain A isolated from Nanning， Guangxi. The 20 billion/g B.subtilis WP can be a good choice for a biological control of Orah citrus canker disease.

Key words： Orah; citrus canker; Xanthomonas citri subsp. citri; pathogen identification; bactericide screening; Nanning， Guangxi

0 引言

【研究意義】沃柑（Orah）為坦普爾桔橙與單西紅桔的雜交種，具有樹勢(shì)強(qiáng)健、果實(shí)外觀漂亮、品質(zhì)優(yōu)良、晚熟高糖、早結(jié)豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)（江東和曹立，2011;黃其椿等，2014;趙洪濤等，2016），2012年引種到廣西南寧種植，因其優(yōu)異的表現(xiàn)，2014年后呈暴發(fā)式擴(kuò)張，截至2018年底廣西沃柑種植面積接近10萬(wàn)ha，約占全國(guó)總面積的一半。沃柑是當(dāng)前我國(guó)種植面積和影響力最大的晚熟柑橘品種，在廣西是繼沙糖桔后最主要的柑橘品種。但沃柑對(duì)潰瘍病敏感，潰瘍病已成為沃柑種植區(qū)最嚴(yán)重的病害，是制約沃柑產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。柑橘潰瘍病是世界范圍內(nèi)危害柑橘產(chǎn)業(yè)的重要細(xì)菌性檢疫病害，主要在柑橘新梢抽發(fā)期和幼果期為害葉片、枝梢和果實(shí)，受害處出現(xiàn)病斑或木栓化，嚴(yán)重的會(huì)造成落葉、枯梢、落果，影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，該病害傳播速度快、防治難度大。潰瘍病菌系分化較復(fù)雜，不同菌系在基因和致病性方面存在差異。因此，研究沃柑潰瘍病病原菌種類并有針對(duì)性地進(jìn)行防治藥劑篩選，對(duì)沃柑潰瘍病防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘潰瘍病菌系根據(jù)地理分布及對(duì)寄主植物的致病性差異分為A、B、C、D和E等5個(gè)菌系，A菌系又稱亞洲種，屬柑橘黃單胞柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp.citri），是致病力最強(qiáng)、最廣泛的菌系;B菌系為美洲種（X. fuscans pv. aurantifolii），主要危害南美洲的檸檬和墨西哥萊檬;C菌系從巴西圣保羅的墨西哥萊檬中分離獲得，可侵染酸橙;D菌系發(fā)現(xiàn)于墨西哥科利馬地區(qū)，主要侵染墨西哥萊檬;E菌系發(fā)現(xiàn)于美國(guó)佛羅里達(dá)，只侵染墨西哥萊檬（姚廷山等，2015）;后來(lái)有學(xué)者又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)A菌系中存在AW和A*的變異菌系（Vauterin et al.，2000;da Silva et al.，2002）。雖然潰瘍病的發(fā)生至今已有100多年歷史，但目前仍無(wú)有效方法可完全根治，生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。美國(guó)多采用大面積焚毀根除法（Graham et al.，2004），但損失巨大;我國(guó)疫區(qū)以化學(xué)防治為主，根據(jù)藥劑分類，主要為銅制劑、鏈霉素類及其他藥劑。不同藥劑因柑橘品種和實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)不同，其防治效果也存在差異（袁承東，1993）。孫惠敏等（2011）研究了非銅藥劑和含銅藥劑對(duì)柑橘潰瘍病的毒力，結(jié)果表明代森錳鋅和福美雙等的抑菌作用最強(qiáng);成秀娟等（2012）研究表明，400 mg/kg的松脂酸銅20%可濕性粉劑對(duì)潰瘍病的防治效果達(dá)70.69%～75.35%，是較理想的柑橘潰瘍病防治藥劑;李建揮等（2013）研究表明，表面活性劑能提高銅制劑對(duì)冰糖橙上潰瘍病的防治效果;宋曉兵等（2014）連續(xù)2年研究了復(fù)配藥劑25%春雷霉素·葉枯唑WP對(duì)柑橘潰瘍病的田間防治效果，結(jié)果顯示25%春雷霉素·葉枯唑WP 500 mg/kg處理2年的平均防效分別為80.80%和84.64%， 顯著高于對(duì)照藥劑處理。但長(zhǎng)期施用化學(xué)藥劑防治會(huì)產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境污染等問(wèn)題，并造成病菌抗藥性增強(qiáng)（Behlaiu et al.，2011），因此利用生防微生物進(jìn)行以菌治菌的綠色防治尤為重要。生防微生物主要包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fuorescens）、草生歐氏桿菌（Erwinia herbicala）和丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等（Das，2003）。姚廷山等（2014）從土壤中篩選的拮抗放線菌A16對(duì)柑橘潰瘍病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌圈直徑為26.00 mm;劉冰等（2015）通過(guò)枯草芽孢桿菌與農(nóng)用鏈霉素混用后抑菌效果提高20.7%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人已對(duì)其他柑橘類潰瘍病防治進(jìn)行了相關(guān)研究，但有關(guān)沃柑潰瘍病病原菌種類及防治藥劑的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察、病原菌驗(yàn)證并結(jié)合16S rDNA基因序列分析進(jìn)行廣西南寧沃柑潰瘍病病原菌鑒定，同時(shí)測(cè)定14種常用藥劑對(duì)該病原菌的室內(nèi)防效，篩選出能有效抑制該病原菌菌絲生長(zhǎng)的藥劑，繼而進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，以期為柑橘潰瘍病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試樣品 2017年7月在廣西南寧市武鳴區(qū)城廂鎮(zhèn)廣西鳴鳴果園沃柑基地的東南西北中5點(diǎn)進(jìn)行采樣，每點(diǎn)選擇1株感染潰瘍病的沃柑樹，戴無(wú)菌手套采集具有典型潰瘍病的葉片，每株采集10張葉片，5個(gè)點(diǎn)共采集50張樣品，未經(jīng)處理分別裝入干凈的密封袋中常溫保存送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。接種用健康沃柑葉片采集于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地避雨防蟲網(wǎng)棚內(nèi)沃柑樹。

1. 1. 2 供試藥劑 14種供試藥劑見(jiàn)表1。

1. 2 病原菌分離及鑒定

1. 2. 1 病原菌分離純化 參照方中達(dá)（2001）的方法進(jìn)行病原菌分離。選取病健交界處葉片組織，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用無(wú)菌水漂洗3次;選取10塊已消毒好的葉片組織置于滅菌研缽，加入1 mL無(wú)菌水，用滅菌研磨棒進(jìn)行研磨;用接種環(huán)蘸取研磨液在牛肉膏蛋白胨瓊脂（NA）培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于28 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、瓊脂18.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1. 2. 2 病原菌驗(yàn)證 參照李云鋒和李祥（2000）的方法進(jìn)行病原菌驗(yàn)證。將分離純化的細(xì)菌菌株接種到NA培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)的細(xì)菌用無(wú)菌水配制成濃度約108 CFU/mL的菌懸液。在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地從3株健康的沃柑采集夏梢葉片，每株采集9片共27片沃柑葉片，放置于密封袋常溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室用自來(lái)水沖洗干凈，晾干用于病原菌接種。用滅菌大頭針在健康柑桔葉片上刺出傷口，再用移液器吸取20 μL菌液接種到傷口上，每個(gè)菌株測(cè)試3張葉片，3次重復(fù)共9張葉片，每張葉片接種4個(gè)傷口，以接種等量無(wú)菌水作對(duì)照。接種葉片置于28 ℃下保濕培養(yǎng)，定期觀察葉片發(fā)病情況，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌再分離，并通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證病原菌。

1. 2. 3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)病原菌在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察和描述，進(jìn)行病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。

1. 2. 4 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 參考樓兵干等（2009）的方法進(jìn)行病原菌分子生物學(xué)鑒定。采用試劑盒提取病原菌基因組DNA，使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物27F（10 μmol/L） 1.0 μL，引物1492R（10 μmol/L）1.0 μL，DNA模板100 ng，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，委托上海鼎安生物科技有取公司采用ABI 3730型基因分析儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用ClustalW對(duì)序列進(jìn)行多重比較，使用MEGA 6.0以NJ法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 3 14種藥劑對(duì)潰瘍病病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

1. 3. 1 含菌培養(yǎng)基制備 將鑒定的柑橘潰瘍病病原菌菌株接種于含NA培養(yǎng)基的平皿中，于28 ℃下培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)皿中加入25 mL無(wú)菌水，用無(wú)菌接種環(huán)刮下菌苔，制成濃度為1010 CUF/mL的菌懸液，用移液器吸取1 mL菌懸液加入99 mL冷卻至45 ℃的NA培養(yǎng)基中充分搖勻，制成含菌濃度為108 CUF/mL的含菌培養(yǎng)基，然后倒皿，每皿倒20 mL培養(yǎng)基。

1. 3. 2 藥劑配制及稀釋 供試的14種藥劑由高濃度向低濃度成倍稀釋。先用無(wú)菌水配制500倍溶液，依次向低濃度稀釋獲得1000、2000、4000和8000倍藥液，藥劑的含量分別為2000、1000、500、250和125 mg/L，以清水為對(duì)照（CK）。

1. 3. 3 抑菌作用測(cè)定 用直徑為6 mm的滅菌打孔器在含菌培養(yǎng)基上打出等邊三角形的3個(gè)孔，吹干孔內(nèi)水分。各取不同濃度的藥劑50 μL加入到孔中，每個(gè)濃度重復(fù)3次，無(wú)菌水作對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算不同濃度藥劑下的抑菌圈平均值。

1. 3. 4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)抑菌圈直徑計(jì)算相對(duì)抑菌率，相對(duì)抑菌率（%）=（處理抑菌圈直徑-對(duì)照抑菌圈直徑）/處理抑菌圈直徑×100。以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量（x）、相對(duì)抑菌率的幾率值為因變量（y），建立毒力回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R）和抑菌有效中濃度（EC50）。

1. 4 防治藥劑田間效果測(cè)定

1. 4. 1 試驗(yàn)材料 選取室內(nèi)防治藥劑篩選中表現(xiàn)出一定抑菌效果的5種藥劑（80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑）進(jìn)行田間柑橘潰瘍病防治試驗(yàn)。

試驗(yàn)在南寧市武鳴區(qū)城廂鎮(zhèn)九聯(lián)村廣西鳴鳴果業(yè)有限公司基地進(jìn)行，品種為沃柑，樹齡四年，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯，株行距2 m×4 m，密度為1245株/ha，肥水管理較好，潰瘍病發(fā)生程度中等。

1. 4. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)80%代森錳鋅可濕性粉劑500倍液、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑500倍液、1.6%噻霉酮涂抹劑400倍液、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑600倍液、3%中生菌素可濕性粉劑900倍液和清水對(duì)照，共6個(gè)處理，每處理4次重復(fù)，共24個(gè)小區(qū)。每個(gè)供試藥劑為一處理小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)10株沃柑樹，小區(qū)間設(shè)1行分隔樹，各小區(qū)的樹齡、樹勢(shì)和管理水平等均基本一致。對(duì)不同藥劑采用人工噴霧法進(jìn)行潰瘍病防治，將藥液均勻噴布于葉片正面和背面及果實(shí)上。

1. 4. 3 調(diào)查項(xiàng)目及方法 于夏梢新葉展開時(shí)（2018年5月20日）開始第1次噴藥，每隔10～15 d噴1次，共噴3次（5月30日噴第2次，6月15日噴第3次），末次噴藥后15 d（6月30日）調(diào)查夏梢葉片潰瘍病發(fā)病情況。由于藥前夏梢葉片尚未發(fā)病，故未作病情基數(shù)調(diào)查。每試驗(yàn)小區(qū)選擇有代表性的2株沃柑樹進(jìn)行調(diào)查，每株樹按東南西北中5個(gè)方位取樣，每個(gè)方位調(diào)查2個(gè)秋梢的全部葉片，2株樹共調(diào)查20個(gè)梢。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑;1級(jí)，每葉有1～5個(gè)病斑;3級(jí)，每葉有6～10個(gè)病斑;5級(jí)，每葉有11～15個(gè)病斑;7級(jí)，每葉有16～20個(gè)病斑;9級(jí)，每葉有21個(gè)以上病斑。

病情指數(shù)（%）=[∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×9]×100

防治效果（%）=（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情況指數(shù)×100

1. 4. 4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0的ANOVA法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法比較各處理的防治效果，分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病害癥狀

潰瘍病菌一般只侵染幼嫩的組織，如嫩葉、嫩梢和幼葉，葉片被侵染后在其背面出現(xiàn)針頭大小的油漬狀斑點(diǎn)，然后擴(kuò)大穿透葉片，在葉片正面出來(lái)近圓形病斑，表面粗糙，后期組織木栓化形成火山口開裂，病健交界處出現(xiàn)黃綠暈圈，危害枝條和果實(shí)時(shí)木栓化更嚴(yán)重，形成木栓化病斑，但潰瘍病對(duì)果肉沒(méi)有影響（圖1）。

2. 2 病原菌分離及鑒定

2. 2. 1 病原菌分離和驗(yàn)證 從沃柑病葉組織上分離獲得2株細(xì)菌，分別命名為G1和G2，將2株細(xì)菌通過(guò)針刺接種法接種到健康的柑桔葉片上，接種G1菌株的葉片在接種后第8 d出現(xiàn)明顯的褐色水漬狀病斑（圖2-a），第10 d針刺點(diǎn)葉背出現(xiàn)隆起，病斑處出現(xiàn)白色海綿狀物質(zhì)堆積，呈典型的火山口突起（圖2-b）;而接種G2菌株的葉片未出現(xiàn)病癥，對(duì)照葉片也未出現(xiàn)病癥（圖2-c）。通過(guò)柯赫氏證病試驗(yàn)，從離體葉片發(fā)病部位分離出的病原菌與接種的G1菌株相同。

2. 2. 2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 病原菌G1在NA培養(yǎng)基上形成的菌落呈黃色、黏液狀、圓形、表面光滑、稍隆起（圖3-a），菌落背面也為黃色（圖3-b），與已報(bào)道的柑橘潰瘍病菌相似（吳明瓊，2018）。

2. 2. 3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 對(duì)沃柑潰瘍病病原菌G1菌株16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果獲得1417 bp的片段序列（登錄號(hào)MK121207），BLAST比對(duì)結(jié)果（圖4）顯示，其序列與柑桔黃單胞柑桔亞種（X. citri subsp. citri）的同源性為100%，因此將G1菌株鑒定為柑桔黃單胞柑桔亞種。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）也可看出，G1菌株與多個(gè)已報(bào)道的柑桔黃單胞柑桔亞種聚在一個(gè)分支內(nèi)。

綜合病原菌的形態(tài)特征、致病性、16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果，進(jìn)一步將沃柑潰瘍病病原菌鑒定為柑桔黃單胞柑桔亞種，為潰瘍病A菌系（姚廷山等，2015）。

2. 3 14種藥劑對(duì)潰瘍病病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果及毒力回歸方程

室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，供試的14種藥劑中只有80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑等5種藥劑對(duì)沃柑潰瘍病病原菌表現(xiàn)出一定的抑制效果。在500、1000、2000、4000和8000倍稀釋濃度下，80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果最好，抑菌率分別為77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，其次是200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，抑菌率分別為73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%，而1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑在藥劑稀釋倍數(shù)較低的情況下有一定的抑菌作用但效果較差，在藥劑稀釋倍數(shù)較高的情況下無(wú)抑菌效果。其余9種藥劑沒(méi)有抑菌效果。

根據(jù)抑菌圈直徑，建立供試藥劑的毒力回歸方程，計(jì)算、比較80%代森錳鋅可濕性粉劑和200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的EC50。結(jié)果顯示，80%代森錳鋅可濕性粉劑的毒力回歸方程為y=0.463x+4.217，R=0.933，EC50較低，為49.09 mg/L，抑菌效果較好;而200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的毒力回歸方程為y=0.449x+4.142，R=0.948，EC50較高，為81.47 mg/L，抑菌效果稍差。

2. 4 田間藥劑篩選結(jié)果

選取室內(nèi)藥劑篩選中表現(xiàn)出一定抑制效果的5種藥劑（80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑）進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示，5種防治藥劑對(duì)沃柑潰瘍病的防治效果在61.81%～73.45%，防治效果排序?yàn)?00億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（73.45%）>1.6%噻霉酮涂抹劑（71.07%）>1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（66.53%）>80%代森錳鋅可濕性粉劑（65.14%）>3%中生菌素可濕性粉劑（61.81%）;其中，除3%中生菌素可濕性粉劑外，其余各處理對(duì)沃柑潰瘍病的防治效果差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

柑橘潰瘍病菌系具有品種特異性，但所產(chǎn)生的癥狀無(wú)明顯差異，需借助血清學(xué)、噬菌體敏感性、分子標(biāo)記及寄主范圍等多種生物學(xué)特征進(jìn)行病原菌分類鑒定。目前根據(jù)基因測(cè)序的差異可將柑橘潰瘍病分為柑橘黃單胞亞種（X. citri subsp. citri）、棕色黃單胞萊檬亞種（X. fuscans subsp. aurantifolii）和苜蓿黃單胞枳柚亞種（X. alfalfae subsp. citrumelonis）等3個(gè)亞種（Schaad et al.，2006）。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、致病性驗(yàn)癥和分子鑒定，明確從廣西沃柑潰瘍病病葉上分離到的病原菌為柑橘黃單胞柑橘亞種，系柑橘潰瘍A菌系，與Schaad等（2006）的研究結(jié)果一致，是我國(guó)柑橘潰瘍病病原菌主要類型。

室內(nèi)毒力是衡量藥劑對(duì)有害生物毒力作用大小的指標(biāo)之一，是藥劑對(duì)有害生物所具有的內(nèi)在致死能力，而田間藥效試驗(yàn)更接近生產(chǎn)實(shí)際。本研究的室內(nèi)毒力鑒定結(jié)果表明，14種供試藥劑中80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑對(duì)柑橘潰瘍病病原菌表現(xiàn)出一定的抑制效果，其余藥劑對(duì)病菌無(wú)抑制作用;田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，所選藥劑對(duì)沃柑潰瘍病的防治效果在61.81%～73.45%，其中200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的防效最好，1.6%噻霉酮涂抹劑次之。本研究中，常用的銅制劑如氫氧化銅沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌效果，其原因可能是果園連續(xù)大量使用銅制劑防治潰瘍病，導(dǎo)致抗銅制劑的菌株產(chǎn)生。陳雪鳳等（2012）測(cè)定廣東、江西和廣西等地不同產(chǎn)區(qū)的21個(gè)柑橘潰瘍病菌對(duì)化學(xué)藥劑的敏感性，結(jié)果表明部分潰瘍病菌對(duì)藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，其中有18個(gè)菌株對(duì)硫酸銅（必備）產(chǎn)生了不同程度的抗性，特別是來(lái)自廣東的菌株對(duì)硫酸銅已產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性，來(lái)自江西的菌株對(duì)潰瘍克星產(chǎn)生中等以上抗性，來(lái)自廣西桂林的菌株對(duì)鏈霉素產(chǎn)生抗性，而枯草芽孢桿菌在廣西沃柑產(chǎn)區(qū)使用還較少，潰瘍病菌可能對(duì)其還未產(chǎn)生抗性。另外，田間防治效果與室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果不一致，可能與在實(shí)驗(yàn)室毒力測(cè)定時(shí)的病菌濃度和田間藥劑試驗(yàn)時(shí)樹體所帶的病菌濃度不一致有關(guān);也可能是實(shí)驗(yàn)室藥劑是直接與病菌接觸起到殺菌或抑菌作用，而在田間噴施，藥劑不一定直接接觸到病菌，有些潰瘍病菌在植株組織內(nèi)部，如果不是內(nèi)吸性藥劑就不能直接接觸到病菌;也可能是不同地區(qū)病原菌存在生理分化，或柑桔品種與栽培管理水平不同，病原菌在寄主上生長(zhǎng)的適合度也不同，因而存在品種間感病性差異所致;以及與有些藥劑需在植物內(nèi)活化后才能激活防治作用有關(guān)（姚廷山等，2011），具體原因還需進(jìn)一步探究。在防治藥劑的篩選上，生防微生物制劑是未來(lái)綠色農(nóng)業(yè)的選擇方向，譚小艷等（2006）從枯草芽孢桿菌分離出的Bv10變種對(duì)柑橘潰瘍病菌有較好的抑制作用;陳嬌梅等（2014）鑒定短小芽孢桿菌和芽孢桿菌對(duì)柑橘潰瘍病的防效達(dá)90.0%～100.0%。結(jié)合室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效試驗(yàn)，本研究篩選的200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑屬于生防微生物藥劑，作為柑橘潰瘍病防治藥劑可降低化學(xué)藥劑的使用量，減少環(huán)境污染。

不同柑橘種類或品種對(duì)潰瘍病的抗性水平變化較明顯（張戈壁等，2004），其中甜橙和臍橙品種普遍容易感病，屬高度感病品種，而寬皮柑橘抗病性最強(qiáng)（宋盛英等，2002），但寬皮橘類的雜柑類為高感品種（胡秀榮等，2014）。廣西以前主要以沙糖桔和南豐蜜桔等寬皮柑橘為主，潰瘍病發(fā)生輕，為次要病害，近年來(lái)隨著沃柑的大面積發(fā)展，潰瘍病快速成為我區(qū)沃柑產(chǎn)區(qū)最重要的病害。潰瘍病在廣西沃柑上發(fā)生流行如此快速，主要有以下幾個(gè)原因：一是沃柑雖然是寬皮橘類，但其為含橙類基因的雜柑;二是沃柑生長(zhǎng)速度快，葉片氣孔大，胞間不緊密，潰瘍病菌易侵入;三是廣西特別是桂南地區(qū)夏秋季節(jié)高溫多濕，沃柑有刺，在風(fēng)雨天氣容易刺傷，加重了潰瘍病的感染和傳播;四是防治藥劑的持效性短，大多數(shù)銅制劑只有7～10 d的有效期，且常期使用銅制劑等造成抗性細(xì)菌產(chǎn)生。因此，建議采取農(nóng)業(yè)和藥劑綜合防治沃柑潰瘍病，如選用無(wú)病苗木、合理施肥、清除田間病殘?bào)w、興建防風(fēng)林、剪除刺、輪換用藥、每次新梢抽發(fā)時(shí)及時(shí)噴布高效低毒藥劑等。

4 結(jié)論

從廣西南寧分離出的沃柑潰瘍病病原菌為強(qiáng)致病性柑桔黃單胞柑桔亞種A菌系，生產(chǎn)上推薦使用200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物防治。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）